Questa ricerca è stata sostenuta da grant National Institutes of Health (R01-DE025985) e da un American Cancer Society ricerca Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Questo lavoro è stato anche supportato da concessioni dal US Department of Agriculture (2015-67015-23268 e 2014-67015-21787) e nuova concessione di iniziativa di ricerca presso University of California, Davis.

Attenzione: Linee cellulari utilizzati in questa procedura contengono virus infettivi, attenti e procedere solo in impianto di BSL di livello 2 o superiore.
1. preparazione e manutenzione delle cellule
<ol><li>Coltura di cellule TREx-K-RTA BCBL-1 (o un altro KSHV infettato linee cellulari PEL) in RPMI1640 supplementato con 15% siero bovino fetale (FBS) e soluzione di 1% penicillina streptomicina glutamina.</li>
	<li>Crescere le cellule a 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2), assicurandosi di crescere continuamente e per dividere le celle di un rapporto di 1:4 ogni 2 – 4 giorni.</li>
	<li>Monitorare le colture cellulari con un microscopio a luce ogni giorno per confermare la crescita delle cellule buone e morfologia, altrimenti che si consiglia di riavviare la coltura delle cellule o di regolare di conseguenza le condizioni di coltura delle cellule.</li>
</ol>2. timidina sincronizzazione e induzione litica
<ol><li>In un 10 cm di Petri, cellule di TREx-K-Rta BCBL-1 piastra in preparati media (1 x 106 cellule/2 mL di media)</li>
	<li>Aggiungere della timidina 200mm (concentrazione finale: 2 mM) al piatto, mescolare e incubare per 18 h.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. lavare le cellule con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in media preparati al momento. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere in media preparati al momento.</li>
	<li>Permettono alle cellule di uscita S-fase per 8 h.</li>
	<li>Aggiungere della timidina (concentrazione finale: 2 mM), miscelare e incubare per 16 h.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. lavare le cellule con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in media preparati al momento. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere in media preparati al momento.</li>
	<li>Per indurre la riattivazione virale, aggiungere 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, concentrazione finale 20 ng/mL) e doxiciclina (DOX, concentrazione finale 100 ng/mL) alla coltura delle cellule, miscelare e incubare per 4 h. Per linee cellulari senza una cassetta viscoelastica K-Rta, stimolare la riattivazione tramite TPA (concentrazione finale 20 ng/mL e sodio butirrato (1 mM)).</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. lavare le cellule con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in coltura completa. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere in terreni di coltura completo.</li>
	<li>Permettono alle cellule di crescere per 24 h.</li>
</ol>3. fissazione e permeabilizzazione
Nota: Prima di procedere, verificare il fissaggio soluzione (3,7% formaldeide in PBS DEPC-trattati), dietil pirocarbonato-trattati soluzione tampone fosfato (DEPC-PBS), glicina DEPC PBS (concentrazione finale di glicina: 100 mM) e permeabilizzante soluzione (50% acetone, metanolo al 50%) sono preparati. In genere, ogni diapositiva richiederà almeno 0,5 milioni di cellule, moltiplicare se necessario e includono cellule supplementari per back up soprattutto se le cellule non sono sane.
<ol><li>Raccogliere le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 2 min a 200 x g. lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS sterile DEPC. Risospendere in 1,2 mL di PBS DEPC.</li>
	<li>Inserire il numero appropriato di vetrini coprioggetti (determinati dalla configurazione sperimentale) il fondo di una piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Dispensare 200 µ l della cella composto di DEPC PBS su ogni vetrino coprioggetti, affinché siano di almeno 0,5 milioni di cellule su ogni diapositiva. Permettono alle cellule di stabilirsi per 2 min e aspirare l'eccesso di PBS DEPC lasciando solo un sottile strato di cellule. È normale per le celle da rimuovere in questo processo. Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata.</li>
	<li>Con cura e aggiungere 1 mL di soluzione (3,7% formaldeide in PBS DEPC) per ogni vetrino coprioggetto di fissaggio. Permettono alle cellule di difficoltà per 10 min.</li>
	<li>Vetrini coprioggetto lavare 3 volte con PBS DEPC.</li>
	<li>Con attenzione aggiungere 1 mL di PBS di DEPC la glicina (concentrazione finale di glicina: 100 mM) per ogni vetrino coprioggetto. Permettono alle cellule di placare per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL di PBS DEPC e sia posto su un agitatore per 5 min o agitare con decisione ma delicatamente in mano per 1 min. aspirato il DEPC l'eccesso di PBS. Fare attenzione a non frantumare le cellule. Ripetere questo passaggio per un totale di 3 lavaggi.</li>
	<li>Attentamente e aggiungere 1 mL di soluzione (50% di acetone, metanolo al 50%) per ciascun vetrino coprioggetto di permeabilizing. Permettono alle cellule di permeabilize per 15 min. Nota: A questo punto, le lamelle possono essere memorizzate in un congelatore a-20 ° C per non più di una settimana. Evitare il congelamento o ridurre al minimo il tempo trascorso nel congelatore come qualità dell'immagine può degradare rapidamente. Assicurarsi che quando nel freezer che le cellule rimangono bagnati e coperto in metanolo/acetone e per garantire che essi reidratare correttamente con DEPC PBS dopo la rimozione dal freezer.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL di PBS DEPC e sia posto su un agitatore per 5 min o scuotete con decisione ma delicatamente in mano per 1 min. aspirare il PBS DEPC in eccesso, fare attenzione a non frantumare le cellule. Ripetere questo passaggio per un totale di 3 lavaggi.</li>
</ol>4. IFA e RNA-pesce
Nota: Per quanto riguarda etichettatura sonda RNA pesce e preparazione: per il K-Rta introne che è 959 paia di basi, 31 diverse sonde sono stati generati che 20 coppie di basi ciascuno, contenente un GC si accontentavano di circa il 50%. Soluzioni stock e funzionamento delle sonde sono stati aliquotati in 100 µM e 2,5 µM concentrazioni, rispettivamente.
<ol><li>Vetrini da microscopio etichetta con informazioni sperimentali necessarie o una sorta di etichetta distinguibile.</li>
	<li>Linea di fondo di un contenitore di plastica sigillabile con un tovagliolo di carta umida.</li>
	<li>
Preparare la soluzione di anticorpo primario (1,5 µ l di anticorpo di LANA, 0,75 µ l di anticorpo RNA Pol II, 3 µ l di baker lievito tRNA, PBS DEPC fino a 30 µ l) e moltiplicare la ricetta per ogni vetrino coprioggetti presenti. Posto 30 µ l di soluzione di anticorpo primario su ogni vetrino da microscopio con etichetta.
	<ol>
<li>Titolo l'anticorpo primario di interesse prima e utilizzare la quantità ottimale. Assicurarsi di utilizzare IgG purificata, come siero (liquido ascitico) può contenere grandi quantità di RNAsi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare il vetrino coprioggetti (cellule rivolto verso la soluzione) sui vetrini al microscopio con etichetta e spostare le diapositive nel contenitore con il tovagliolo di carta umida. Fare attenzione a non introdurre bolle. Coprire l'esterno del contenitore con involucro di plastica. Spostare il contenitore in un incubatore impostato a 37 ° C per 1 h.</li>
	<li>Preparare un tampone di lavaggio di pesce (2 x salina sodio citrato buffer (SSC) (finale), 10% formammide, 90% DEPC dH2O).</li>
	<li>Preparare il tampone di ibridazione: 2x (4 x SSC, 20% solfato di destrano).</li>
	<li>Preparare il pesce introne sonda buffer e un anticorpo secondario (20 µ l di tampone di ibridazione (finale 1 x Hyb Buffer): 2x, 4 µ l di lievito tRNA (finale 10%), 4 µ l di formamide (finale 10%), sonda introne K-Rta (finale 125 nM), 0,8 µ g di anticorpo secondario, DEPC dH2 O fino a 40 µ l). Moltiplicare la ricetta per ogni diapositiva necessario.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, lavare le cellule 3 volte con PBS DEPC in un piatto ben 6 per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Lavare con tampone di lavaggio di pesce 3 volte per 5 minuti ciascuno. Tenere vetrino coprioggetti in pesce-wash buffer sino a fine preparazione miscela in secondo luogo anticorpo e introne sonda (punto 4.7).</li>
	<li>Diapositive di vetro pulito usati per incubazione dell'anticorpo primario per l'ibridazione.</li>
	<li>Posto 40 µ l dell'anticorpo secondario e pesce introne sonda contenente soluzione su ogni lastra di vetro.</li>
	<li>Collocare i coprioggetti con le cellule sui vetrini con il lato di cella rivolto verso il basso in cima il buffer, fare attenzione a non introdurre bolle.</li>
	<li>Porre i vetrini in un contenitore di plastica con un fazzoletto di carta umido sul fondo. Avvolgere il contenitore di plastica in involucro di plastica prima e poi il foglio di alluminio.</li>
	<li>Incubare il contenitore con le diapositive a 37 ° C per 16-24 h.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, estrarre delicatamente il vetrino coprioggetto dal bordo del vetrino e rimettere in 6 piastre a pozzetti rivolto verso l'alto e lavare le cellule con tampone di pesce-lavaggio 3 volte in un piatto ben 6 per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Lavare le cellule 2 volte con 2 x SSC.</li>
	<li>Aggiungere DAPI (1:1, 000) nei 2 x SSC e lasciar per riposare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule 2 volte con 2 x SSC.</li>
	<li>Pulire le diapositive di vetro usate per l'ibridazione e aggiungere 10 µ l di soluzione sui vetrini di montaggio.</li>
	<li>Posizionare il coprioggetti capovolto sulla soluzione di montaggio. Fare attenzione a non introdurre bolle.</li>
	<li>Con un tessuto di laboratorio, rimuovere delicatamente la soluzione di montaggio in eccesso, facendo attenzione a non schiacciare le cellule.</li>
	<li>Utilizzare smalto per unghie, applicare uno strato abbondante intorno al bordo delle lamelle e lasciare per asciugare.</li>
	<li>Procedere per eseguire microscopia di fluorescenza.</li>
</ol>5. microscopia a fluorescenza 3D
Nota: Mentre protocolli variano con il tipo di sistema di microscopio di fluorescenza utilizzato, la procedura seguente contribuirà a garantire l'acquisizione di dati di immagine ottimale per l'analisi quantitativa.
<ol><li>Pretrattare i campioni fissati e montare in media anti-dissolvenza per ritardare la fluorescenza photobleaching durante la formazione immagine.</li>
	<li>Utilizzare un obiettivo di alta qualità (ad esempio una lente immersione in olio di 60 X 1,42 Nardi), che può catturare una cella intera (o nucleo) del campo di vista.</li>
	<li>Impostare i parametri di esposizione (ad es., il potere di eccitazione, tempo di esposizione) per ciascun canale di colore di fluorescenza, utilizzando campioni di controllo positivi e negativi. Acquisire immagini di fluorescenza. Nota: I campioni di controllo positivi che contengono solo un'etichetta fluorescente dovrebbero essere utilizzati anche per determinare il livello di "diafonia" tra i canali di colore. Per campioni di imaging cellulare fisso, il potere di eccitazione fluorescenza può essere ridotto (con tempi leggermente più lunghi di esposizione) per ridurre al minimo photobleaching.</li>
	<li>Una volta stabilito il protocollo di formazione immagine, mantenere gli stessi parametri di esposizione coerente per tutti i campioni in uno studio — affinché i dati di immagine possono essere accuratamente analizzati e confrontati.</li>
	<li>Eseguire l'elaborazione post-acquisizione immagine e ricostruzione 3D. Identificare le trascrizioni di K-Rta da segnale di RNA-pesce (rosso), molecole di LANA dall'immunofluorescenza (verde) e la cromatina nucleare (ove applicabile) macchiato con DAPI (blu). Nota: Regioni del nucleo della cellula, in cui K-Rta e LANA sono co-cluster, così sono credute per essere associato con fabbriche di trascrizione virale e replica complessa.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori di questa carta non hanno legami finanziari o concorrenti conflitti di interessi.

Ci sono alcuni aspetti del protocollo che può essere modificato per accogliere le circostanze insolite. La scelta di fissazione e permeabilization buffer può anche essere alterata. Per i buffer di fissazione, è efficace anche paraformaldeide ed etanolo può essere utilizzato per la permeabilizzazione.
Tempra la formaldeide con glicina che PBS è raccomandato in quanto impedisce formaldeide disabilitando gli anticorpi in assenza di albumina di siero bovino (BSA), ma se le lamelle vengono lavate accuratamente abbastanza, il passaggio di PBS di glicina può essere ignorato. Nel protocollo, evitare l'uso di albumina di siero bovino come soluzione di blocco. Studi pilota condotti in laboratorio Izumiya ha mostrato segnali più deboli di RNA-pesce, presumibilmente a causa di degradazione del RNA. Se il blocco per l'anticorpo primario è necessaria, è consigliabile utilizzare RNasi free BSA. Dall'esperienza passata, si è notato che, se l'anticorpo è specifico, l'inclusione di BSA non è necessaria nella reazione. Tuttavia, si consiglia di includere sempre una quantità eccessiva di lievito tRNA in incubazione tutti i passi per prevenire la degradazione del RNA. È stato notato che usando il tRNA come agente di blocco aumentato segnali specifici RNA-pesce.
Sincronizzazione del ciclo cellulare è stata implementata per produrre una riattivazione di KSHV sincrona e più efficiente. Per la sincronizzazione del ciclo cellulare, inedia idrossiurea o siero potrebbe essere approcci alternativi. È stato confermato che hydroxyurea è efficace come utilizzando un blocco di timidina, sebbene incubazione con il hydroxyurea solo riattiva KSHV debolmente.
Come questa tecnica può essere applicata ad altri studi? Nel più recente pubblicazione del laboratorio Izumiya, è stato dimostrato che colocalizzazione di trascrivere attivamente episomi KSHV e RNA pol II, un enzima essenziale per la trascrizione del RNA. Tuttavia, è noto che ci sono un numero di co-attivatori e co-repressori fattori trascrizionali cellulari coinvolti nella regolazione genica KSHV. RT-PCR quantitativa storicamente è stato utilizzato su una popolazione (miscela di riattivazione e latente) di cellule coltivate, quantificare trascrizioni virali e valutare gli effetti sull'espressione genica virale. Utilizzando l'approccio descritto in precedenza, l'analisi possono essere ristretto fino al livello del singolo episomal per esaminare la trascrizione virale. Pertanto, il regolamento spatiotemporal di altri enzimi cellulari e virali e può essere esaminato per guadagnare la comprensione nella loro associazione con la riattivazione di KSHV. È anche degno di menzione che perché la natura transitoria della regione RNA introne dipende dalla loro degradazione che Sonde FISH RNA si ibridano e tipicamente localizzare dove trascrizione attivo sta prendendo posto, tuttavia se gli introni non sono degradati immediatamente, Sonde FISH possono presentare segnali che non si trovano sempre nei pressi di trascrizione attivo.
Al momento, è difficile studiare la relazione tra la formazione delle fabbriche di trascrizione cellulare e l'espressione genica successiva a causa di loro genomiche dimensioni e la complessità della configurazione dei promotori cellulari. A questo proposito, episomi KSHV possono essere uno strumento ideale grazie alle loro dimensioni relativamente piccolo genoma, meccanismi di riattivazione definiti con formazioni di aggregazione RNA Pol II chiari. Utilizzando manipolabile mini-cromosoma di virale di KSHV, herpesvirologia può contribuire al campo di ricerca epigenetica cellulare da un'angolazione unica.

È diventato sempre più chiaro che l'organizzazione spazio-temporale del nucleo svolge un ruolo importante nella modulazione della espressione genica finemente sintonizzato negli eucarioti. Maggior parte dei geni specifici del tessuto sono distribuiti su molti cromosomi e devono essere disciplinati in modo sincrono al fine di rispondere a stimoli specifici in un modo coordinato1. Le cellule costruire mozzi di cromatina attiva (ACH) come un modo di riunire su un specifico spazio nucleare1geni e loro elementi cis-regolatori.
Inoltre è stato dimostrato da diversi studi che sebbene il nucleo sembra molto denso e viscoso, molecole biologicamente attive possono attraversare il nucleo piuttosto rapidamente tramite diffusione2. In conseguenza di questa struttura effimera, la maggior parte delle proteine che legano DNA 'saltare' da sito di associazione all'associazione sito, sentire loro modo intorno allo spazio nucleare, che permette per un nucleo altamente adattabile e versatile2.
Nonostante questo comportamento dinamico di biomolecole all'interno del nucleo, nucleare corpi senza membrane come (ma non limitato a) il nucleolo, i corpi di Cajal e corpi nucleari di promyelocytic leucemia (PML-NB) esistono ancora. È attraverso una varietà di meccanismi quali ripetizioni in tandem di DNA (nucleolo), rRNA (nucleolo) e proteine strutturali quali coilina (Cajal bodies) o PML proteine (PML-NB) che tengono questi costrutti insieme3,4,5 . Queste strutture e altre congregazioni come le fabbriche di trascrizione fungono da impalcature che non solo aumentano la concentrazione locale dei componenti richiesti, ma anche regolano la composizione di proteine ed acidi nucleici all'interno di essi, in definitiva, creare un sito centrale per efficienti funzioni cellulari6.
Visualizzare quando e dove il modulo di strutture nucleari fornisce una ricchezza di informazioni per i ricercatori che studiano l'epigenetica. Da una prospettiva di virologia, la riattivazione del virus latente infettati, come KSHV, altera significativamente il paesaggio del nucleo e la distribuzione di enzimi nucleari per spostare la trascrizione principalmente da geni cellulari a geni virali, in ultima analisi, per produzione di progenie virale completamente funzionale7,8. Come KSHV manipolare il macchinario di espressione di gene cellulare per facilitare l'espressione genica virale? Tali informazioni potrebbero anche far luce su meccanismi di regolazione genica cellulare temporale.
Come tutti gli altri virus erpetici, KSHV ha due cicli di vita chiamati latenza e replica litica. KSHV risiede principalmente nella fase di latenza, in cui la maggior parte del relativo gene virale espressione viene messo a tacere, tranne la latenza associata geni9,10. Durante la latenza che KSHV produce latenza associata antigene nucleare (LANA), che costitutivamente lega i genomi virali e attacchi virali della cromatina del cromosoma11. A causa della relazione intima di LANA con il genoma virale, è possibile utilizzare IFA e DAPI per macchiare ed individuare dove gli episomi virali erano in relazione la cromatina di host.
Per studiare la riattivazione di KSHV a livello di singolo episome e l'associazione con altri episomi virali in una cellula infetta, è stata stabilita una strategia per individuare attivamente trascrizione virale della cromatina in situ . Di conseguenza, sono stati combinati LANA e RNAPII IFA con introne RNA-pesce, generando sonde di RNA-FISH che si legano alla regione dell'introne (sonda esatta sequenze possono essere trovate in più recente pubblicazione8 del laboratorio Izumiya) di KSHV K-Rta-la proteina virale chiave che è essenziali e sufficienti per KSHV riattivazione-era possibile identificare dove trascrizione in realtà stava prendendo posto8,11,12,13,14,15 . Questa tecnica di RNA-pesce introne consente ai ricercatori di visualizzare dove mRNA è essere trascritte immediatamente prima di essere impiombato ed esportato in citoplasma16,17.
KSHV può essere riattivato da vari stimoli chimici tra cui esteri di phorbol come 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) e inibitori delle deacetilasi istoniche quale il butirrato di sodio, inoltre KSHV possono essere indotte a riattivare dall'iperespressione di il fattore di trascrizione virale, K-Rta19. I ricercatori hanno aumentato con successo l'efficienza della riattivazione di KSHV sincronizzando cicli della cella prima di indurre la riattivazione18. Così, per questi studi particolari, le cellule sono state sincronizzate utilizzando un blocco di doppia timidina (protocollo descritto di seguito) e incubati con TPA e doxiciclina (Dox) per un breve periodo. Doxycyline è stato utilizzato perché la linea cellulare utilizzata in questi esperimenti ha una cassetta di K-Rta doxiciclina-inducibile, che è stata clonata da cDNA e non include la regione di introne di K-Rta. Anche se è possibile riattivare KSHV utilizzando solo ha indotto l'espressione di K-Rta, è stato dimostrato da altri ricercatori che a causa di una varietà di differenti fattori biochimici espressione K-Rta da solo dimostra di essere un debole riattivazione stimoli20. Combinando tutte queste e limitando le incubazioni di droga per un breve periodo di tempo, una riattivazione di KSHV robusta ma non eccessivamente artificiale è stata realizzata per l'imaging.
Dopo l'etichettatura LANA, RNAPII, K-Rta introni e DNA come descritti in questa carta, fluorescenza 3D imaging è stata eseguita utilizzando un microscopio di deconvoluzione widefield. Dopo l'elaborazione con software di imaging, la distribuzione spaziale degli episomi virali attive possa essere valutata correttamente. Utilizzando questa tecnica, le questioni centrali per quanto riguarda la natura fondamentale della formazione della cromatina attiva mozzi e altre strutture nucleari possono essere studiate. Avendo identici episomi virali in una singola cella che elabora gli stessi elementi normativi può rappresentare uno strumento di ricerca unico per approfondire la comprensione dei meccanismi di regolazione genica spatiotemporal.
Una limitazione di imaging più campioni di cella fissati in diversi momenti per caratterizzare un processo intrinsecamente dinamico molecolare è che sottili o piccoli cambiamenti nella distribuzione di fluorescenza sono inosservati o ritenute insignificanti. Questo è vero a meno che nel caso raro, ogni cellula osservato Visualizza lo stesso cambiamento sottile. Così, il rapporto completo spatiotemporal di trascrizione virale attiva e altre strutture nucleari non può essere valutato criticamente usando la formazione immagine fissa. Per affrontare queste sfide tecniche, l'approccio migliore è di cellule vive di immagine che hanno segnato episomi virali e di seguire la posizione di enzimi cellulari chiave nel corso del tempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">RPMI medium 1650 GlutaMAX</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:167px;">Needs to be warmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Omega Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FB-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10378-016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Thymidine&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">TPA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium Butyrate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde Solution&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">252549</td>
			<td style="width:167px;">Corrosive, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-5758</td>
			<td style="width:167px;">Acute toxicity&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">410225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">179124</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td>
			<td style="width:71px;">Advanced Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">13-210-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">05-623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ribonucleic acid, transfer from baker&#8217;s yeast (S. cerevisiae)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9014-25-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15557044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formamide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">295876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">1916C093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DAPI (4&#8217;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">slowFade Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micro cover glass 22x22</td>
			<td style="width:71px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">C022221</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">VoloCITY</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">3D imaging software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DeltaVision microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Superfrost/Plus microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

È noto che la regolazione spaziale e temporale dei geni è parte integrante di che regolano l'espressione genica corretto. Di conseguenza, è prezioso per comprendere dove e quando trascrizione avviene all'interno dello spazio nucleare e per visualizzare la relazione tra episomi infettata all'interno del nucleo della cellula stessa. Qui, l'immunofluorescenza (IFA) e RNA-pesce sono stati combinedto identificare attivamente trascrivere episomi herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV). Dalla macchiatura antigene nucleare associato latenza KSHV (LANA), è possibile individuare dove episomi virali esistano all'interno del nucleo. Inoltre, progettando sonde di RNA-pesce di destinazione della regione di introne di un gene virale, che è espressa solo durante l'infezione produttiva, nascente trascrizioni del RNA possono essere situate. Utilizzando questa combinazione di sonde molecolari, è possibile visualizzare l'assemblaggio di fabbriche di grande trascrizione virale e analizzare il regolamento spaziale dell'espressione genica virale durante la riattivazione di KSHV. Includendo la macchiatura dell'anticorpo di anti-RNA polimerasi II, si può anche visualizzare l'associazione fra l'aggregazione di RNA polimerasi II (RNAPII) e la trascrizione di KSHV durante la riattivazione.

Un protocollo leggermente abbreviato è stato eseguito dove sono state utilizzate cellule BCBL-1 e solo LANA e K-Rta RNA erano macchiate (Figura 1). Questo esperimento ci permette di esaminare dove sono attivamente trascrizione episomi virali e l'eterogeneità della risposta a stimoli di riattivazione di KSHV in una popolazione delle cellule. Nella cella indicata dalla freccia nella Figura 1, la fluorescenza di K-Rta distinta nelle regioni che rispecchiano fedelmente la distribuzione degli episomi virali (contrassegnato con LANA) è prova per trascrizione attivo che si svolgono nei pressi di genomi KSHV. Nello stesso campione, cellule come quello indicato dalla freccia nella Figura 1 possono essere osservate, che esibiscono molto più debole e diffusa fluorescenza K-Rta che significativamente non si sovrapponga con LANA. Ciò illustra la constatazione generale che all'interno di una popolazione di cellule c'è una notevole variazione del grado di risposta agli stimoli di riattivazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> Figura 1: Visualizzazione attiva trascrizione di episomi virali. IFA e RNA-pesce è stata eseguita su cellule BCBL-1. Le cellule BCBL-1 non sono state sincronizzate ma trattate con TPA e sodio butirrato per 4 h. utilizzando LANA immunostaining, genomi virali sono stati visualizzati in verde, mentre RNA-pesce è stato effettuato targeting introni K-Rta Situato trascrizione attivo in rosso. Cromatina cellulare era macchiata post fissazione e permeabilizzazione con DAPI. Introne K-Rta e LANA macchie erano fuse insieme. I punti della freccia completo a una cella che è completamente riattivato e si sta formando VTFs. Mentre la punta della freccia è rivolta verso una cella che sta solo cominciando a riattivare, come suggerito dal debole segnale K-Rta. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Successiva è stata esaminata l'efficacia di sincronizzazione della timidina visualizzando l'espressione della proteina virale K-Rta (Figura 2). Dopo un blocco doppio della timidina è stato effettuato per sincronizzare cellule TREX BCBL-1 presso la transizione di fase G1/S, il protocollo descritto in precedenza è stato eseguito (senza LANA e RNAPII colorazione). Esaminando la macchiatura K-Rta, è chiaramente evidente che cellule sincronizzate più risposto agli stimoli riattivazione rispetto alla popolazione non sincronizzato. Da precedenti studi condotti in laboratorio Izumiya (dati non mostrati), che è stato convalidato che RNAPII anche colocalizza più frequentemente con K-Rta dopo la sincronizzazione del ciclo cellulare.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig2.jpg" style="font-size: 14px;"> Figura 2: L'efficacia della timidina. RNA-pesce è stato effettuato sulle cellule K TREX-Rta BCBL-1. Le cellule (indicato dal "2x Thy" titolo) sono stati sincronizzati con un blocco di timidina doppia. Entrambe le popolazioni delle cellule non sincronizzate e sincronizzati sono state trattate con TPA e DOX per introni 4 h. K-Rta sono stati ibridati a RNA FISH sonde. Le cellule che sono uniformemente luminoso rosso non sono che overexpressing K-Rta, invece sono morti, convalidato con DAPI colorazione (non mostrato). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Come nota generale, è molto importante macchiare le cellule con DAPI durante l'esecuzione di questo protocollo. Apototic cellule possono essere riconosciute facilmente blebbing e frammentazione nucleare. Dato il pesante induzione stimoli e pratiche di cultura generale delle cellule, è comune per alcune cellule morte essere visto. È importante sempre macchia con DAPI come metodo primario di discernere tra le celle di vivi e morte. A volte gli anticorpi o le sonde del RNA saranno catturate in cellule apoptotiche e producono segnali che, di conseguenza è importante escludere quelle cellule dall'analisi. DAPI macchiatura può servire diverse funzioni aggiuntive, ad esempio in Figura 3, è chiaro che l'oggetto indicato dalla freccia è in realtà tre celle separate invece di uno.
È importante notare che le immagini mostrate in Figura 3 e Figura 4 sono stata deconvolute creando così un modello più punctato. Esaminando la macchia RNAPII, la differenza tra le celle indicato dalla freccia e le altre cellule circostanti possono essere visto. È degno di menzione che il segnale RNAPII è molto più pronunciato rispetto al normale a causa di deconvoluzione.
Usando la microscopia 3D a fianco di questa tecnica permette di interrogare il rapporto spaziale fra RNAPII, LANA e K-Rta. Ad esempio, in Figura 4, anello-come le strutture RNAPII possono essere visto con genomi KSHV punteggiati sulla periferia. In generale, la LANA in genere colocalizza con RNAPII in fabbriche di trascrizione di sviluppo delle cellule. Tuttavia, non tutti i punti di LANA colocalize con RNAPII, studi compreso il 4th dimensione (tempo) sarebbe necessario chiarire questo fenotipo. È importante aggiungere che i pochi punti di LANA che non colocalize con segnali K-Rta rappresentano l'eterogeneità episomal in risposta a stimoli di riattivazione anche all'interno di una singola cella (Figura 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig3.jpg"> Figura 3: Combinato IFA e introne RNA-pesce. IFA e RNA-pesce è stata eseguita su cellule K TREX-Rta BCBL-1. Genomi virali sono stati individuati con immunostaining di LANA (verde), attiva trascrizione è stato visualizzato con RNA-pesce della regione introne di K-Rta mRNA (giallo), congregazioni RNAPII (rosso) sono stati etichettati con IFA e le cellule erano macchiate infine utilizzando DAPI per immagine DNA (blu). Cellule K TREx-RTA BCBL-1 sono state sincronizzate utilizzando un blocco di timidina doppia, quindi le cellule sono state riattivate tramite incubazione con TPA e DOX per 4 h, e 24 ore più tardi, le cellule sono state fissate, permeabilizzate e cuoi preparati per l'imaging. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig4.jpg"> Figura 4: La visualizzazione 3D delle fabbriche di trascrizione virale. Introne RNA-pesce usando K-Rta introne sonde (blu chiaro), immunostaining del RNAPII (rosso) e LANA (verde) e il DNA di DAPI colorazione (blu scuro). Deconvoluti rendering 3D di uno stack Z preso sul microscopio, elaborato e costruito su software commerciale di imaging (vedere la tabella dei materiali). Cellule di TREx K-Rta BCBL-1 timidina doppia sincronizzato e quindi trattati con TPA e DOX per 4 h. cellule sono state elaborate 28H dopo riattivazione è stata stimolata. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/Figure.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

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Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Fabbriche di transcriptional virali sono strutture discrete che sono arricchiti con cellulare RNA polimerasi II per aumentare la trascrizione genica virale durante la riattivazione. Qui, è descritto un metodo per individuare i siti di trascrivere attivamente della cromatina virale nello spazio 3D nucleare da una combinazione di ibridazione di RNA immunofluorescenza colorazione ed in situ .

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K Views.  University of California, Davis. Fabbriche di transcriptional virali sono strutture discrete che sono arricchiti con cellulare RNA polimerasi II per aumentare la trascrizione genica virale durante la riattivazione. Qui, è descritto un metodo per individuare i siti di trascrivere attivamente della cromatina virale nello spazio 3D nucleare da una combinazione di ibridazione di RNA immunofluorescenza colorazione ed in situ .

Video: Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...