Gli autori ringraziano i membri passati e presenti del laboratorio per i contributi allo sviluppo della metodologia qui delineato e Alan Cochrane per un consiglio. LA è destinatario di un Canadian Institutes of Health Research (CIHR) dottorato e AJM è supportato da un premio alla carriera Fraser, Monat e MacPherson. Questo lavoro è supportato da un finanziamento della CIHR (sovvenzione # MOP-56974).

1. Preparazione della sonda <ol><li> Digest 1 ug del vettore in trascrizione in vitro, pKS (+) pol 236nt 9 con Kpn1 enzima a 37 ° C per 1 ora ed eseguire il prodotto linearizzato DNA su un gel di agarosio. Il frammento dovrebbe essere di circa 2500 bp. </li><li> Tagliare il frammento dal gel e purificare mediante la Roche Eluire Micro Gel Extraction Kit (tutti i reagenti usati sono elencati nella Tabella 1). Eseguire l&#39;eluizione finale in 30 microlitri tampone di eluizione. Esegui 5 pl del prodotto su un gel di agarosio per verificare la purificazione. </li><li> Mescolare in uno reazione di trascrizione in vitro (vedi ricetta sotto) usando la Roche DIG RNA etichettatura kit e incubare a 37 ° C per 2 ore. </li></ol> In reazione di trascrizione in vitro: <table border="1"><tbody><tr><td> Linearizzato DNA </td><td> 23 microlitri </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA etichettatura mix (Roche) </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Tra 1Xnscription tampone </td><td> 8 microlitri </td></tr><tr><td> 20U RNasi OUT </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA polimerasi </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 40 microlitri </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Aggiungere 228 U di DNasi I e incubare a 37 ° C per 15 min. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo EDTA pH 8,0 ad una concentrazione finale di 20 mM. </li><li> Purificare la reazione utilizzando le colonne semplice Spin Roche come specificato dal costruttore. </li><li> Purificare la sonda per precipitazione con 1/10 del volume trattata con DEPC NaOAc 3M pH 5.2 e 2.5 volumi di ghiacciata etanolo al 95%. Mescolare e incubare a -80 ° C per 30 minuti per una notte. </li><li> Centrifugare la sonda per 15 min a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare il pellet in ghiacciato etanolo al 70%. Centrifugare ancora per 5 minuti a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet. Risospendere il pellet in 50 microlitri water (DNase / RNase free) contenente 10 U Invitrogen RNasi OUT. </li><li> Stimare la concentrazione di sonda mediante spettrofotometria (RNA misura a 260 nm), e portare a una concentrazione di ng / pl 5. Conservare in aliquote a -20 ° C per uso a breve termine, o -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Si raccomanda di eseguire confronti tra l&#39;analisi in modo da conservare una aliquota per questo. </li></ol> 2. Cella Fixation <ol><li> Inizialmente è importante per le cellule di sementi non trattate, aderenti su vetrini sterili in modo che la confluenza finale sulla raccolta è di circa 70-80%. Per le cellule non aderenti, crescere come normale e quando è pronto a raccogliere, loro incubare con vetrini coprioggetto che sono stati trattati con 0,01% w / v poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Inc.) per 1 ora. Per un tipico 12-pozzetti coltura tissutale polistirene (3,8 cm 2), 150.000 cellule HeLa (ad esempio) vengono piastrate a 24 ore prima della trasfezione. Cellule non aderenti possono essere infettate o transfettate come di consueto e lasciata adqui per scivola in vetro di copertura prima di fissaggio 3. </li><li> Eliminare il supporto e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato 1X preparato in acqua bidistillata (DPBS) per 1 min. Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-trattati 1X PBS possono anche essere utilizzati, ma non trattata PBS non può in quanto può contenere enzimi RNasi. </li><li> Eliminare il PBS e aggiungere paraformaldeide al 4%, sufficiente a coprire le cellule completamente. Incubare per 15-20 minuti. </li><li> Eliminare il paraformaldeyhyde e lavare le cellule con 1X DPBS per 1 min. </li><li> Eliminare le DPBS e aggiungere 0,1 M glicina (sciolto in DPBS 1X). Incubare per 10 min. </li><li> Eliminare la glicina e lavare le cellule con 1X DPBS per 1 min. </li><li> Eliminare le DPBS e aggiungere 0,2% Triton-X (sciolto in DPBS 1X). Incubare per 5-10 min. Se colorazione per proteine ​​dell&#39;involucro nucleolari o nucleare, permeabile con Triton X-100 per non più di 5 minuti o la localizzazione proteina sarà diffusa. </li><li> Scartare Triton X-100 e lavare una volta in1X DPBS per 1 min. </li><li> Per la conservazione a lungo termine, sostituire PBS con il 70% di etanolo e conservare a 4 ° C per un massimo di quattro mesi. In alternativa, lavare una volta di più con 1X DPBS e procedere alla FISH. </li></ol> 3. Ibridazione fluorescente in situ (FISH) <ol><li> Se i coprioggetti sono stati memorizzati in etanolo, sostituire l&#39;etanolo con 1X DPBS e consentire alle cellule reidratare per 30 min. Reidratazione può essere fatta durante la notte se i coprioggetti sono conservati a 4 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti con 1x DPBS per 1 min. </li><li> Preparare i vetrini per incubare i coprioggetti, avendo cura di pulire ed etichettare bene. </li><li> Per un vetrino 18mm, aggiungere 50 ml di soluzione DNasi (25 unità / coprioggetti, disponibili in commercio) alla diapositiva. Aggiungere il coprioggetti, facendo attenzione a posizionarlo lato della cella verso il basso, ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i coprioggetti con 1x DPBS per 1 min. </li><li> Aggiungere 50 microlitri mix di ibridazione (vedi ricetta di seguito) per coprioggetto suuna diapositiva e incubare lato cella coprioggetto basso per 16-18 ore a 42 ° C. L&#39;incubazione dovrebbero essere eseguite in un vassoio contenente un 50% formammide, 2X SSPE miscela (12,5 ml formammide deionizzata, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml di acqua). </li></ol> Ibridazione Mix (per un vetrino, 50 pl): <table border="1"><tbody><tr><td> Quantità di magazzino </td><td> Materiale (a concentrazione finale) </td></tr><tr><td> 25 pl </td><td> Formammide, 50% (deionizzata; qualsiasi fonte) </td></tr><tr><td> 5 microlitri (di 10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 microlitri (di 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 microlitri (di 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 pl (di 5 unità) </td><td> RNasi OUT </td></tr><tr><td> 5 microlitri (25 ng di 5 ng / pl) </td><td> Sonda </td></tr><tr><td> 5 pl </td><td> H 2 O DEPC, per rendere il finalevolume di 50 pl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Incubare coprioggetti lato della cella verso il basso in 50 microlitri formammide 50% (diluito in DPBS 1X) per 15 min a 42 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti due volte in 2X SSPE incubando loro lato della cella verso il basso in 50 microlitri 2X SSPE (20X SSPE diluito in DPBS 1X) per 5 minuti ciascuna a 42 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti in 1X DPBS per 1 min. </li></ol> 4. Immunofluorescenza <ol><li> Bloccare i coprioggetti mettendoli lato della cella verso il basso in 50 microlitri soluzione 1X blocco Roche (Roche 10X soluzione diluita in blocco 1X DPBS) per 30 min. </li><li> Incubare lato coprioggetti cella verso il basso in 50 ul di soluzione anticorpo primario per 1 ora a 37 ° C. Anti-DIG anticorpo deve essere diluito in base alla direzione del produttore in 1X soluzione bloccante. Se gli anticorpi altri vengono utilizzati per colorare le proteine, possono essere aggiunte alla concentrazione corretta condizione che tutti gli anticorpi utilizzati sono derivati ​​da spec host differentiIES. </li><li> Lavare i coprioggetti per 10 min in 1X DPBS. </li><li> Incubare il lato coprioggetto cella verso il basso in 50 ul di soluzione anticorpo secondario per 1 ora a 37 ° C. Alexa anticorpi coniugati (Invitrogen) può essere utilizzato per generare una gamma di colori e vengono utilizzati a 1:500 in 1X soluzione bloccante e DPBS 1X. </li><li> Lavare i coprioggetti due volte per 10 minuti in ciascuna DPBS 1X. </li><li> Asciugare il lato della cella coprioggetto su carta Whatman. Assicurarsi di coprire i coprioggetti per evitare l&#39;esposizione alla luce e sbiancamento. </li><li> Una volta che tutto il liquido è evaporato, montare i coprioggetti su vetrini fresche con 8 ImmunoMount microlitri (Thermo Scientific, Inc.). Battere delicatamente lungo il vetrino per eliminare eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Applicare lo smalto ai bordi del coprioggetto per fissarlo in posizione. </li><li> La visualizzazione di RNA e proteine ​​mediante tecniche di microscopia è anche critica per il successo di questa tecnica. Impostazioni sul microscopio utilizzato può aiutare o ostacolare la visualizzazione è quindi fondamentale che ilimpostazioni del microscopio essere impostato correttamente ed essere coerenti da un campione all&#39;altro in un dato esperimento. Per le impostazioni dettagliate microscopia, ottica e combinazioni di anticorpi vedere riferimenti 1,10. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di RNA virale colorazione può essere visto in Figura 2. Le RNA virale per HIV-1 è visto in tutto il citoplasma visualizzata diffusamente per la maggior parte, anche se piccola punctae citoplasmatica non sono infrequenti. La specificità può essere visto confrontando cellule positive per cellule circostanti che non esibiscono fluorescenza. Come accennato nell&#39;introduzione, HIV-1 che manca la proteina regolatrice Rev produce RNA che è trattenuta nel nucleo: Questo può essere visualizzato come un segnale luminoso nel nucleo, e una mancanza di segnale RNA fluorescenza nel citoplasma. La sovraespressione di proteine ​​cellulari è anche capace di spostare la distribuzione dei HIV-1 RNA virale. In figura 2 </strong&gt;, l&#39;iperespressione delle proteine ​​coinvolte nel traffico vescicolare endosomal (ad esempio, Rab7-interazione proteina lisosomiale (RILP) 11 o N-terminale cancellato RILP (RILPN) 11, e le proteine ​​che interferiscono con la funzione dineina motore [es p50/dynamitin 1, 12], interferire con il normale regime di localizzazione degli RNA genomici virali come determinato dalle analisi FISH espressione RILP porta alla ri-localizzazione delle RNA genomico virale al microtubulo organizzazione centrale (MTOC) 13;. RILPN disperde endosomi all&#39;interno del citoplasma a causa della incapacità di legarsi a p150 incollata del motore dineina complesso 14 e blocca p50/dynamitin la subunità grande della dineina motore e rilasci endosomi ritardo, ma anche l&#39;RNA genomico virale di HIV-1 e proteine ​​strutturali alla periferia cella 1 (figura 2). La manipolazione della steady-state localizzazione degli RNA genomico virale, un elemento chiave per l&#39;infettività delparticelle virali, sarebbe la chiave per l&#39;eventuale sviluppo di terapie. Nelle nostre mani, di RNA virale viene visualizzato nella cella già 3 ore dopo la trasfezione ed infezione 10 e diventa facilmente osservabile da questa tecnica FISH di 12 ore. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo per la FISH / se la co-analisi. Le cellule sono coltivate su vetrini coprioggetto e poi fissate con paraformaldeide. Trattamenti di glicina e Triton-X vengono eseguite prima che le cellule vengono utilizzate sia per la FISH / IF o memorizzato in etanolo 70% per lo stoccaggio. Le cellule disidratate per lo stoccaggio vengono reidratati in 1X DPBS (trattata con DEPC PBS) prima di proseguire per FISH / IF. Le cellule vengono trattate con DNasi I e lasciata per una notte per ibridarsi con sonda. Dopo ibridazione è completa, le cellule vengono lavate con formammide, nonché con SSPE, e un risciacquo finale 1X DPBS. Soluzione bloccante è applicata alle celle, seguita da incubazione congli anticorpi primari. Dopo il lavaggio, gli anticorpi secondari sono applicati. Due lavaggi finali in 1X DPBS completare la procedura di colorazione, dove al momento i coprioggetti vengono essiccati e montati su vetrini per l&#39;imaging. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figura 2. Risultati rappresentativi utilizzando FISH / IF co-analisi. A) HIV-1 viene transfettato in cellule HeLa e in alcuni casi con costrutti che causano la sovraespressione di proteine ​​cellulari (RILP, p50/Dynamitin e RILPΔN (uno ammino-terminale mutante di delezione)) . PESCE / IF co-analisi è stata effettuata: RNA è identificato in verde con uno o G3BP LAMPADA1 (rosso) per differenziare. B) HIV-1 è espresso in cellule HeLa e raccolti in punti temporali diversi. Espressione di RNA virale viene tracciato in verde, mentre la proteina cellulare, hnRNP A1, viene colorato in rosso. Dimensione barre sono 10 micron. Immagini modificate dai riferimenti 1 (dati selezionare dal pannello di A; RILP, p50/Dynamitin e RILP deltaN)e 17 (pannello B).

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

PESCE / IF co-analisi è un metodo affidabile per visualizzare l&#39;RNA virale nelle cellule che ora è stato perfezionato 9,15,16. Nel corso di diversi anni, abbiamo sviluppato un metodo raffinato di colorazione per l&#39;RNA. Questa tecnica può essere usata su una vasta gamma di tipi cellulari purché la sonda è specifico per la RNA bersaglio 17. Per l&#39;etichettatura la sonda con DIG, siamo in grado di visualizzare i RNA mediante colorazione semplice. Quando colorazione per l&#39;RNA e altre proteine ​​si combinano, FISH / se la co-analisi diventare un potente strumento per osservare le strutture cellulari e le proteine ​​/ RNA di localizzazione. La specificità della rivelazione RNA è piuttosto elevato. Questo è illustrato nella figura 2. In una parte del lavoro originale che si è concentrato sulla localizzazione genomico virale RNA, FISH stabilito che la mancanza di Rev intrappolato RNA virale nel nucleo 18. Dal momento che questo, abbondante nuove informazioni sulla localizzazione virale RNA genomico è stato ottenuto utilizzando il technique qui delineato. Con overesprimenti proteine ​​cellulari, specifiche e le popolazioni non tutti, gli RNA virali possono essere costretti a localizzarsi a differenti regioni della cella. Sovraespressione RILP, che ricorda il fenotipo ottenuto quando hnRNP A2 è esaurito da siRNA in HIV-1-cellule che esprimono 13, fa sì che il RNA di accumulare visibilmente al MTOC. Le RNA genomici virali possono essere spinti alla periferia cellulare disabilitando il minus-end proteina motore, dineina: sovraespressione p50/Dynamitin o knockdown delle pesanti catene dineina 1 risultati nel rilascio di RNA genomici virali provenienti da domini intracellulari alla periferia cellulare ( Figura 2). Un mutante di RILP, RILPΔN, che non lega più il motore dineina, si disperde endosomi (contrassegnati da LAMPADA1) nel citoplasma perché non sono più attivo localizzato a domini juxtanuclear. Questi risultati indicano l&#39;idea di una popolazione di plastica di HIV-1 RNA genomici e in particolare, che diversi gruppi di HIV-1 genomicaRNA presenti con ruoli a volte identificabili nel ciclo di replicazione virale. Queste nozioni stesse sono già stati individuati per la proteina codificata da questo mRNA, Gag 19. Ci sono limitazioni agli usi di FISH / se la co-analisi che sono legati alla scelta degli anticorpi e la disponibilità. L&#39;ottimizzazione della migliore combinazione di anticorpi primari e secondari, e le loro concentrazioni, ci vorrà del tempo per ottimizzare (vedi Tabella 1 e 2). Anticorpi a base di ibridomi o prodotte da grandi aziende possono avere concentrazioni che variano ovunque da 1:2 a 1:2000, ma essere sicuri di seguire le linee guida fornite dal produttore per i migliori risultati. L&#39;host in cui si produce l&#39;anticorpo deve essere presa in considerazione. Pecore di miscelazione con anticorpi di capra dovrebbe anche essere evitato in anticorpi primari e secondari, come questo si traduce in combinazione fondo elevato a causa di cross-riconoscimento della specie (dati non riportati). Per Alexa-Fluor Secondaanticorpi Ry, la concentrazione può essere utilizzato a 1:500 per quasi tutte anticorpo nel set. Lo svantaggio a pescare / IF co-analisi, come descritto nella presente relazione è cattura le RNA nella sua posizione allo stato stazionario, dopo che le cellule sono state fissate e permeabilizzate con paraformaldeide e detergente (Figura 1). Tuttavia, RNA di imaging in cellule vive è stato ottenuto attraverso una varietà di mezzi 20-22, principalmente utilizzando varianti di genomi virali RNA che sono contrassegnati da proteine ​​fluorescenti come la GFP. Tuttavia, ulteriori mezzi per identificare la localizzazione di RNA in cellule vive continuano ad emergere. Questi nuovi metodi coinvolgere i tag RNA per mezzo di Spinaci 23, 24, o SNAP MTRIP 2. Queste tecniche soffrono anche di alcuni inconvenienti tra cui il requisito di permeabile cellule prima di aggiungere substrati o una porzione che deve essere progettato per codificare l&#39;mRNA per rilevare l&#39;mRNA da microscopia. Infatti, la maggiore ADVAntage di analisi FISH descritte nella presente relazione risiede nel fatto che l&#39;RNA nativo è inalterata porta ai risultati più fisiologicamente rilevanti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Coprioggetti 18mm </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Per fare 4%: sciogliere 20g in 1XDPBS 500ml a 60 ° C con 5 gocce di NaOH. pH a 7,2 dal fuoco e conservare a -20 ° C. Non superare i 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluire Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Etichettatura Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> T7 polimerasi trascrizione di RNA </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Colonne Spin veloci </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent Antibody Enhancer impostate per il rilevamento DIG # 4 (soluzione bloccante) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor anticorpi secondari </td><td> Invitrogen </td><td> Vedere la Tabella 2 </td><td></td></tr><tr><td> Ibridazione Forno </td><td> Boekel Sciscientifica </td><td> Modello 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Identificazione di reagenti e attrezzature specifiche <table border="1"><tbody><tr><td> Specie di anticorpi anti-DIG (diluizione; società, numero di catalogo) </td><td> Colori </td><td> Alexa Fluor usato (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Mouse (1:500, Sigma, B7405) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 asino anti-topo (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rosso </td><td> Alexa Fluor 594 asino anti-topo (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blu </td><td> Alexa Fluor 647 asino anti-topo (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sheep (1:200; Roche, 11376623) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 asino anti-pecora (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rosso </td><td> Alexa Fluor 594 asino anti-pecora (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blu </td><td> Alexa Fluor 647 asino anti-pecora (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Combinazioni Tabella 2. Di anticorpi secondari e anti-DIG elencati con numeri di catalogo e le concentrazioni.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

I virus che infettano le cellule sollecitare modifiche specifiche funzioni cellulari normali che servono a deviare l&#39;energia e le risorse per la replicazione virale. Molti aspetti della funzione della cellula ospite sono comandati da virus, di solito l&#39;espressione di prodotti genici virali che reclutano le proteine ​​della cellula ospite e macchinari. Inoltre, virus organelli membrana ingegnere tag specifiche o di vescicole su cellulari e proteine ​​motrici a regioni bersaglio della cellula (durante l&#39;infezione de novo, i virus cooptare proteine ​​motore molecolare per colpire il nucleo, poi, durante l&#39;assemblaggio del virus, saranno dirottare cellulare macchinari che aiuteranno nel montaggio di virus). Minore è inteso come il virus, in particolare quelli con genomi di RNA, coordinare il traffico intracellulare di proteine ​​e componenti RNA e come ottenere assemblaggio di particelle infettive in loci specifici nella cellula. Lo studio della localizzazione RNA è iniziato nel lavoro precedente. Sviluppare em eucariotici inferioribryos e cellule neuronali fornito importanti informazioni biologiche, e ha anche sottolineato l&#39;importanza della localizzazione RNA nella programmazione delle cascate di espressione genica. Lo studio in altri organismi e sistemi cellulari ha prodotto simile informazioni importanti. I virus sono parassiti obbligati e devono utilizzare le loro cellule ospiti per replicare. Pertanto, è fondamentale per comprendere come RNA virus dirigere loro genomi RNA dal nucleo, attraverso il poro nucleare, attraverso il citoplasma e su una delle sue destinazioni finali, in particelle di virus progenie 1. FISH serve come uno strumento utile per identificare i cambiamenti a regime localizzazione di RNA virale. Quando combinato con immunofluorescenza (IF) analisi 22, FISH / IF co-analisi fornirà informazioni sulla co-localizzazione delle proteine ​​con l&#39;RNA virale 3. Questa analisi fornisce quindi un buon punto di partenza per verificare le interazioni RNA-proteina da loro o biochimica-biofisicaprove di 4,5, in quanto co-localizzazione di per sé non è una prova sufficiente per essere certi di una interazione. Nello studiare la localizzazione di RNA virale utilizzando un metodo come questo, molte informazioni sono state acquisite da entrambi i virali e cellulari RNA 6 eventi di traffico. Ad esempio, HIV-1 RNA produce nel nucleo delle cellule infette, ma l&#39;RNA viene soltanto tradotta nel citoplasma. Quando una proteina chiave virale manca (Ap) 7, FISH del RNA virale ha rivelato che il blocco di replicazione virale è dovuto alla ritenzione di HIV-1 RNA genomici nel nucleo 8. Qui, presentiamo il metodo per l&#39;analisi visiva di RNA genomico virale in situ. Il metodo fa uso di una sonda marcata RNA. Questa sonda è progettata per essere complementare alle RNA genomico virale. Durante la sintesi in vitro di RNA antisenso sonda, il ribonucleotide che viene modificato con digossigenina (DIG) è incluso in uno in vitro transcription reazione. Una volta che la sonda si è ibridata con il mRNA bersaglio in cellule, successive fasi di etichettatura anticorpo (Figura 1) rivelerà la localizzazione del mRNA e proteine ​​di interesse durante l&#39;esecuzione di FISH / IF.

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescenza<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (FISH) metodo è stato sviluppato per rilevare visivamente virali RNA genomico mediante microscopia a fluorescenza. Una sonda è fatta con specificità per gli RNA virali che possono poi essere identificati utilizzando una combinazione di tecniche di ibridazione e di immunofluorescenza. Questa tecnica offre il vantaggio di individuare la localizzazione di RNA o DNA virale allo steady-state, fornendo informazioni sul controllo di eventi intracellulari traffico di virus.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.5K Views.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. A fluorescenza In situ (FISH) metodo è stato sviluppato per rilevare visivamente virali RNA genomico mediante microscopia a fluorescenza. Una sonda è fatta con specificità per gli RNA virali che possono poi essere identificati utilizzando una combinazione di tecniche di ibridazione e di immunofluorescenza. Questa tecnica offre il vantaggio di individuare la localizzazione di RNA o DNA virale allo steady-state, fornendo informazioni sul control...

Video: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Ricerca

Biologia

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Veloce fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione per Xist RNA combinata con immunofluorescenza di istone modifica in cromosoma X inattivazione

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.