Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dall'associazione di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE, programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea sotto il Marie Sklodowska-Curie progetto IMPRESS (GA No 642893). Vorremmo ringraziare il team scientifico di PROiSER, in particolare allo studente Alberto Vendrell Bernabéu, per la sua partecipazione attiva nella registrazione video di questo progetto.

Procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati (2015/VSC/pisello/00064) dalla direzione generale della produzione agricola e del bestiame presso la Universitat Politècnica de València.
1. raccogliere lo sperma da anguille adulte europee in cattività
Nota: Maschi di anguilla europea uso mantenuti in vasche con acqua di mare e un sistema di ricircolo a temperatura costante (20 ° C). Trattare con gli ormoni attraverso iniezione intraperitoneale settimanale (gonadotropina corionica umana (hCG); 1,5 IU / g del peso corporeo di pesce). Acclimatare pesci gradualmente, cominciando con 3 giorni in acqua dolce seguita da sostituzione con acqua di mare (1/3 del totale dell'acqua del serbatoio) ogni 2 giorni fino a raggiungere una salinità di 37,0 g/mL.
<ol><li>Anestetizzare l'Anguilla 24 h dopo l'iniezione di ormone per ottenere campioni con migliore qualità dello sperma.<ol>
<li>Preparare in anticipo l'anestesia: aggiungere 300 mg di benzocaina per 100 mL di etanolo al 70%. Mescolare bene e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Diluire benzocaina in un secchio flessibile con 5 L di acqua dell'impianto per ottenere una concentrazione finale di 60 mg/L e mescolare bene.</li>
		<li>Trasferire il pesce al secchio con acqua dell'impianto e benzocaina. Attendere alcuni minuti fino a quando il pesce si calmi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cancellare l'area genitale con acqua e asciugare con carta assorbente per evitare la contaminazione dei campioni di sperma da feci, urine o acqua di mare.</li>
	<li>Applicare una leggera pressione nella zona addominale e raccogliere i campioni di sperma in tubi di plastica da 15 mL con la pompa a vuoto. Volume di sperma fino a 6-7 mL, a seconda del maschio.</li>
	<li>Mantenere i campioni di sperma a 4 ° C per almeno 1 h fino a motilità analisi viene svolta.</li>
</ol>2. mettere in frigorifero e diluire i campioni di sperma
<ol><li>Preparare la soluzione di diluente in anticipo. Nota: I campioni di sperma devono essere diluiti in soluzione di estensione specifica per ciascuna specie.<ol>
<li>Preparare il supporto non-attivatore per campioni di sperma di Anguilla (P1 medio). Aggiungere 0,42 g di bicarbonato di sodio, 1,828 g di cloruro di sodio, 0,127 g di cloruro di magnesio, 0,56 g di cloruro di potassio e 0,037 g di cloruro di calcio a 250 mL di acqua distillata. Miscela bene per dissolvere. Conservare a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare il blocco di raffreddamento a 4 ° C per mantenere i campioni a temperatura costante. Attendere che la temperatura si stabilizzi.</li>
	<li>Diluire i campioni di sperma usando il DILUENTE soluzione specifici per ogni specie. Nota: Il rapporto di diluizione è specie specifico e deve essere definito per standardizzare il protocollo. In primo luogo, stimare la concentrazione di spermatozoi basata sulla concentrazione ottenuta in pre-analisi della motilità utilizzando software, come spiegato nei passaggi 3 e 4. Con questa analisi, è anche possibile selezionare i migliori campioni di sperma sulla base della percentuale di motilità. Dopo questo, il ricercatore può iniziare a raccogliere dati per l'esperimento con i migliori campioni con la giusta concentrazione.<ol>
<li>Diluire i campioni di sperma di Anguilla in mezzo P1 con un rapporto di 01:50. Per preparare 500 µ l di sperma diluito di Anguilla, aggiungere 50 µ l del campione di sperma fresco e 450 µ l di P1. Mescolare bene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. valutare i parametri di motilità dello sperma
<ol><li>
Set-up del modulo di motilità del Software
	<ol>
<li>Impostare la fase di raffreddamento a 4 ° C e attendere finché non si stabilizza.</li>
		<li>Aprire il software e selezionare il Modulo di motilità. Se necessario, creare nome utente e password.</li>
		<li>Selezionare Proprietà e scegliere i parametri desiderati prima di iniziare l'analisi dello sperma.<ol>
<li>Fare clic su specie di | Pesce.</li>
			<li>Selezionare i Fotogrammi al secondo e il Numero di immagini, a seconda delle condizioni tecniche migliori per ciascuna specie. Impostare entrambe le opzioni 120 immagini al secondo.</li>
			<li>Scegliere contrasto negativo. È obbligatorio per la ricostruzione accurata delle traiettorie spermatozoi16.</li>
			<li>Selezionare la corrispondente Camera di conteggio e la scala della videocamera. Calibrare la videocamera per la lente di ingrandimento usata nell'esperimento. Impostare SpermTrack10 come camera di conteggio e 10 X scala. Nota: In generale, una profondità di 10 µm nella camera di conteggio e una lente di ingrandimento di 10x sono condizioni raccomandate poiché forniscono la migliore messa a fuoco di tutti gli spermatozoi e catturare il maggior numero di cellule. Tuttavia, si consiglia di fare uno studio precedente delle condizioni ottimali per l'analisi di motilità di ogni specie.</li>
			<li>Regolare l'Area delle particelle e la connettività per ciascuna specie. Impostare area minima particella a 2 µm2 e connettività a 7 µm. Nota: Per i pesci, il valore minimo di particelle zona varia tra 2-5 µm e connettività dipende la velocità di spermatozoi e il frame rate.</li>
			<li>Salvare il set-up.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selezionare cattura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analizzare lo sperma di anguilla europea con Software
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) aggiungendo 0,946 g di sale commerciale a 25 mL di acqua distillata con 2% BSA.</li>
		<li>Prendere 500 mL di soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) e nel blocco di raffreddamento. Nota: In generale, la sperma di pesce viene attivato da un evento shock osmotico, anche se per alcune specie la concentrazione di ioni potrebbe inoltre essere importante. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico.</li>
		<li>Mettere la vaschetta del conteggio sotto la fase di raffreddamento e attendere che la temperatura si stabilizza a 4 ° C.</li>
		<li>Mescolare l'attivatore e sperma diluito per attivare gli spermatozoi e avviare la registrazione tra 5-10 s dopo l'attivazione del video di motilità.<ol>
<li>Prendere 4 µ l di soluzione attivatore e posto nella camera di conteggio.</li>
			<li>Delicatamente e omogeneizzare lo sperma diluito agitando microcentrifuga 3 volte per evitare danni in cellule di spermatozoi.</li>
			<li>Prendere 0,5 µ l di sperma diluito, mescolare con l'attivatore e riporre il coperchio della camera di conteggio rapidamente. Nota: Questo passaggio non dovrebbe richiedere più di 5 s per avviare l'analisi appena possibile.</li>
			<li>Concentrarsi sulle cellule degli spermatozoi e trovare la migliore area visiva, che è definito da un numero basso di spermatozoi (150-200 celle) per evitare l'intercettazione tra cellule (Supplemental Figura 1A). Selezionare Acquisisci Video per ottenere le tracce di spermatozoi, che sono separate in base alla velocità.</li>
			<li>Selezionare Capture per ottenere campi da 3 a 7, che sono l'intervallo ottimale per ottenere una bassa variabilità nei risultati e procedere come prima. Registrare video fino a 120 post-attivazione s al fine di evitare fenomeni di condensa sul coperchio della camera di conteggio.</li>
			<li>Selezionare uscita per avere una visione generale di tutti i campi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ottenere i dati di motilità
<ol><li>Selezionare campi di | Parziale | Salvare e scegliere un nome di file. Fare clic su Salva. Nota: Il foglio di calcolo fornisce i valori medi di dati parziali, grafici e immagini di tracce di spermatozoi.</li>
	<li>Selezionare dati generali | Nome del file | Salvare. Nota: I dati forniscono valori cinetici per spermatozoi individuali di tutti i campi.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il software di analisi dello sperma utilizzato in questo protocollo è stato utilizzato dai ricercatori in tutto il mondo per le diverse specie, tra cui pesce. Tuttavia, i pesci hanno alcune caratteristiche specifiche che possono influenzare la valutazione di sperma. Spermatozoi di pesce ha mostrati ad alta velocità al momento dell'attivazione che declina rapidamente e conduce ad un a breve termine della motilità dopo l'attivazione. Inoltre, la temperatura della riproduzione è specie-dipendente e, in alcuni casi, potrebbe essere intorno a 4 ° C2,4,8,12. Pertanto, è necessario effettuare alcuni adattamenti per migliorare l'efficienza di un sistema computerizzato per l'analisi dello sperma dei pesci. Il principio di base del parametro di motilità è l'acquisizione e l'analisi di immagini successive degli spermatozoi mobili. Maggior parte dei sistemi utilizza standard frame rate (16, 25, 30, 50 o 60 fps) a causa di limitazioni di hardware e software17,18,19,20,21,22. Tuttavia, alcuni studi hanno mostrato che un frame rate più elevato aumenta di alcuni parametri di velocità, come VCL, STR, BCF15,23,24. Ciò è particolarmente importante quando è necessario valutare l'iperattivazione di spermatozoi e trovare la velocità massima di spermatozoi11,17,18,19, 25. in relazione alla temperatura di analisi, una piastra di raffreddamento per il microscopio ottico e una nuova tecnologia di refrigerare i campioni a temperatura costante potrebbe anche migliorare l'analisi nel tempo. Il presente lavoro propone un approccio per risolvere due dei problemi principali connessi con la sensibilità di pesce sperma motilità analisi e temperatura. Nonostante i risultati concentrandosi su alcune specie d'acqua dolce, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per le specie marine, anche se il mezzo di attivazione dovrebbe essere adattato per ogni specie.
Nel mercato, ci sono una gamma di prodotti o anche diverse versioni dello stesso prodotto. Anche se i sistemi possono avere lo stesso principio, ognuno ha diversi dettagli conseguente l'incompatibilità dei risultati26,27,28. Inoltre, la valutazione della qualità dello sperma di pesce potrebbe ancora avere limitazioni metodologiche e tecniche. La tecnica di attivazione dello sperma e il tempo di analisi dopo l'attivazione sono due fattori essenziali che possono influenzare lo sperma qualità valutazione29,30. Il tempo tra l'attivazione di campioni di sperma e la stabilizzazione dell'immagine per le registrazioni video dovrebbe essere circa 5 s dopo i primi secondi (intervallo di tempo di 5-20 s) fornisce i dati più utili2,4. Il tempo di analisi dello sperma può essere limitato a causa di problemi di condensa su vetrino. Tuttavia, gli spermatozoi pesce rimangono attivi con un vigoroso movimento per meno di due minuti2. A livello tecnico, è necessario conoscere la frequenza di fotogrammi "ottimale" per ottenere informazioni di dettaglio che dà un'accurata ricostruzione delle traiettorie spermatozoi15. A basso frame rate, i dettagli della traiettoria sono persi, in particolare per gli spermatozoi non lineari e veloci, mentre al frame rate più elevati, le informazioni diventano ridondanti15,31. Per alcune specie di pesci, il frame rate (fino a 250 fps) potrebbe non essere sufficiente per trovare la velocità massima di spermatozoi per alcune specie di pesci, come il temolo e salmone. Questa variazione è specie specifico e deve essere definita per ciascuna specie di standardizzare il protocollo e ottenere risultati affidabili15,23,24. La profondità della camera di conteggio può limitare il movimento del grande flagello di pesce e gli spermatozoi non potevano raggiungere la velocità massima11,32,33. Inoltre, il software potrebbe avere alcune limitazioni nella rilevazione degli spermatozoi reale quando c'è un incrocio delle cellule.
Valutazione classica di qualità dello sperma è un'analisi soggettiva basata sulla stima della concentrazione e della percentuale di motilità, che può determinare una variabilità dei risultati. Tuttavia, un sistema computerizzato fornisce misurazioni rapide, precise e quantitative dei parametri di motilità. Questa analisi obiettiva dà una grande quantità di dati e riduce la variabilità dei risultati34,35,36,37. La risposta del comportamento di motilità dello sperma dipende dalla temperatura dell'analisi e varia tra le specie38,39,40. Temperatura ottimale dell'analisi dello sperma potrebbe fornire velocità di sperma e la durata del periodo di motilità, simile alle condizioni naturali di riproduzione38,40. Di conseguenza, software di analisi dello sperma con dispositivi di raffreddamento migliora la valutazione della qualità dello sperma di pesce.
I risultati delle analisi di qualità dello sperma potrebbero migliorare la conoscenza circa le caratteristiche dello sperma di pesce e qualità basato su sottopopolazioni di sperma, che può essere il futuro della valutazione di sperma in tutte le specie animali41,42. A livello pratico, questa tecnica potrebbe essere un indicatore di qualità allevatori e aiuta ad ottenere ulteriori informazioni su sperma processo di selezione, calcolo di dosi seminale per inseminazione artificiale, competizione spermatica basato su velocità e progressività e fertilità potenziale. Tutta questa conoscenza può essere applicata a diversi campi di ricerca inclusi programmi di conservazione e dell'acquacoltura, che ha stimolato l'interesse nella conservazione dello sperma di pesce e la crioconservazione nelle ultime decadi2,13. Effetti tossicologici sono anche sempre interesse speciale a causa di problemi ambientali, come pure gli studi lo sviluppo di studi successivo basato su spermatozoi motilità caratteristiche43,44.
Questo lavoro ha dimostrato come l'ottimizzazione di un software automatico per analisi di motilità dello sperma di pesce migliora i risultati. Standardizzazione del protocollo deve tener conto della temperatura di analisi e il frame rate, che potrebbe essere diverso a seconda della specie. Tuttavia, l'analisi di motilità dello sperma di pesce ha due passaggi critici che il ricercatore dovrebbe prestare attenzione. Raccolta di sperma è il primo passo fondamentale che può distruggere il campione a causa di contaminazioni da feci, urine e acqua (acqua di mare o acqua dolce). L'altro punto critico è associato al momento dell'attivazione dello sperma e l'inizio delle registrazioni video. Questo passaggio dovrebbe essere fatto appena possibile per raccogliere i dati quando gli spermatozoi hanno movimento vigoroso.

L'efficacia di riproduzione dipende dalla qualità dei due gameti (uova e spermatozoi)1,2. Questo è il fattore principale che contribuisce alla fecondazione, permettendo lo sviluppo di prole vitale3,4. Il conveniente valutazione della qualità dei gameti è lo strumento migliore per definire il potenziale di fertilità di un esemplare.
Miscelazione di sperma da più maschi è una pratica comune nella produzione di molte specie acquatiche commerciali4. Tuttavia, la variabilità di sperma tra maschi può portare a concorrenza dello sperma e, di conseguenza, non tutti i maschi sono ugualmente contribuendo al pool genico5. In questo senso, la corretta valutazione delle caratteristiche individuali eiaculare/spermatozoi, come motilità, è fondamentale per ottenere informazioni discriminatorie per quanto riguarda la fertilità maschile individuale potenziale. Osservazione diretta di motilità dello sperma può produrre dati inesatti e soggettivi come richiede tempo ed esperienza, che porta a una mancanza di coerenza e incompatibilità di risultati6,7. Tuttavia, ci sono molte tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire un affidabile sperma qualità analisi2,4.
Analisi computerizzata dello sperma è stata sviluppata per offrire dati accurati su sperma qualità8. Questa tecnologia comprende lo sviluppo di software associato con un microscopio di contrasto di fase che permette la valutazione della motilità spermatica. Tuttavia, un fattore limitante del parametro motilità è la frequenza dei fotogrammi della telecamera. Individuali degli spermatozoi traiettorie si basano su spermatozoi testa posizione di baricentro in fotogrammi consecutivi di registrazioni video, che è correlata con il movimento flagellare modelli3,9,10, 11. i principali parametri cinetici misurati sono la velocità lineare (VSL), la velocità curvilinea (VCL) e la velocità di percorso medio (VAP). VSL è la distanza tra l'inizio e il punto finale presi dagli spermatozoi divisi da tempo. VCL è la reale velocità lungo la traiettoria precisa presa di spermatozoi. VAP è la velocità lungo un percorso levigato derivata della traiettoria. Questi parametri consentono ulteriori informazioni cinetiche, tra cui linearità (LIN), rettilineità (STR), wobble (WOB) e misurazioni di battitura come ampiezza di movimento laterale della testa (ALH) e frequenza di battimento-Croce (BCF)4,10.
Il sistema di analisi dello sperma è stato originariamente utilizzato per specie di mammiferi, e uno dei requisiti per il sistema è quello di operare alla temperatura corporea del donatore (circa 37 ° C). Questo software potrebbe essere utilizzato anche per le specie ittiche; anche se, è necessario effettuare alcuni adattamenti per ridurre l'errore di risultati di analisi dello sperma. In alcune specie di pesci, come i salmonidi e anguille8,12, la fecondazione avviene a bassa temperatura (circa 4 ° C)2,4. Così, dispositivi di raffreddamento dovrebbero essere sviluppato per evitare scomode condizioni di lavoro. Inoltre, gli spermatozoi di pesce sono immotile nel liquido seminale e richiedono un shock osmotico per attivare la motilità. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico. Tuttavia, per alcune specie, come i salmonidi, la concentrazione di ioni potrebbe anche essere importante3,4,9. Dopo l'attivazione, sperma di pesce è caratterizzato da una rapida diminuzione della motilità (meno di 2 min)13,14 e ad alta velocità, essendo essenziale per determinare la frequenza di fotogrammi ottimale per ottenere dati affidabili15.
Gli obiettivi di questo studio sono per progettare e applicare sistemi di refrigerazione per campioni di sperma di pesce. Inoltre, il presente protocollo definisce le modalità determinare i tassi di fotogrammi ottimale per l'istituzione di protocolli standard a seconda della specie. L'utilizzo di questo protocollo apre nuove porte nel contesto della valutazione seminale pesce, utilizzando l'anguilla europea come un modello.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:179px;">Argent Chemical Laboratories</td>
			<td style="width:151px;">hCG</td>
			<td style="width:167px;">Hormone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzocaine</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">E1501 Sigma</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">S5761 Sigma&#160;</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1.06406 EMD Millipore</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1374248 USP</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">P3911-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">commercial salt</td>
			<td style="width:179px;">Aqua Medic&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Meersalz</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">05470 Sigma</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes 15 ml</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T1943-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes support</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">R5651-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Eppendorfs</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">PIPETMAN&#174; Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z683787-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740030-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740028-2000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Spermtrack</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Counting chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">TruMorph</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">TruMorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Microscope UB 200i Serie</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler plate</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler block</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISAS v1</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">ISAS</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

Per la valutazione della qualità dei gameti, esistono tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire dati utili per l'acquacoltura. Sistemi computerizzati per l'analisi dello sperma sono stati sviluppati per misurare diversi parametri e uno dei più comunemente misurato è la motilità degli spermatozoi.
Inizialmente, questa tecnologia informatica è stata progettata per specie di mammiferi, anche se può anche essere utilizzato per l'analisi dello sperma dei pesci. I pesci hanno caratteristiche specifiche che possono influenzare la sperma valutazione come un momento di breve motilità dopo l'attivazione e, in alcuni casi, adattamento a temperature più basse. Pertanto, è necessario modificare i componenti hardware e software per analisi di motilità più efficiente per l'analisi dello sperma dei pesci. Per gli spermatozoi dei mammiferi, la piastra di riscaldamento viene utilizzata per mantenere la temperatura ottima di spermatozoi. Tuttavia, per alcune specie di pesci, è vantaggioso utilizzare una temperatura più bassa per prolungare la durata della motilità, dato che gli spermatozoi rimangono attivi per meno di 2 min. Di conseguenza, dispositivi di raffreddamento sono necessari per refrigerare i campioni a temperatura costante sopra il tempo di analisi, tra cui il microscopio ottico. Questo protocollo descrive l'analisi di motilità dello sperma di pesce utilizzando il software per l'analisi dello sperma e nuovi dispositivi per ottimizzare i risultati di raffreddamento.

Analisi dell'effetto tempo sulla motilità dello sperma
Nel caso l'anguilla europea, la percentuale degli spermatozoi statici aumentato da 15 s a 120 s dopo l'attivazione (dal 24,4% al 40,7%) e la percentuale di spermatozoi mobili progressivi è diminuito (da 36,9% al 20,9%) (Figura 1A e 1B). Basato su velocità, le cellule degli spermatozoi hanno mostrato una diminuzione nella velocità nel tempo (Figura 1 e 1 D) è diminuito. La percentuale di spermatozoi con rapida velocità diminuita di circa il 23% (da 49,4% al 26,6%) e la percentuale di spermatozoi con velocità medio aumentato circa 7%.
L'effetto della frequenza dei fotogrammi e camera di conteggio
Diverse specie richiedono diversi frame rate per ottenere risultati ottimali. Storione russo richiede 150 fotogrammi al secondo (fps; Figura 2A); carpa comune richiede 100 fps (Figura 2B); e per il temolo, 200 fps non era sufficiente per ottenere risultati ottimali di cinetici (Figura 2). Questi risultati non erano dipendenti dalla profondità del conteggio camera testato (Figura 2A-2 C).
Struttura di sottopopolazioni di sperma
L'identificazione della sottopopolazione di sperma si basa sull'analisi statistica. Il primo passo è la determinazione dei principali componenti (analisi delle componenti principali; PCA) dall'insieme completo dei dati di motilità. Quindi, vengono eseguite le procedure di clustering con gli indici di sperma-derivati ottenuti dopo la PCA.
Per questo studio, abbiamo usato lo sperma di salmone atlantico che ha mostrato quattro sottopopolazioni differenti, che si chiamano: lento non lineari (basso LIN, STR e VCL), veloce non lineari (STR inferiore, alta VCL), rapido lineare (alta LIN, STR e VCL) e più rapida lineare (LIN più alta, STR e VCL). La distribuzione di queste sottopopolazioni variato lungo generazioni dagli animali selvatici d'allevamento ones (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig1.jpg"> Figura 1 : Effetto di post-attivazione time sulla progressività e motilità degli spermatozoi di anguilla europea. A e B) percentuale di progressività alle 15 e 120 s, rispettivamente; e C e D) la percentuale di motilità basata sulla velocità nel tempo (15 e 120 post-attivazione s, rispettivamente). La progressività è stato diviso in tre gruppi: cellule motili progressive (bianco; VCL significa valore ± SD: 114,5 ± 18,2 e 101.4 ± 34.5 µm/s per 15 e 120 s, rispettivamente), senza cellule motili progressive (grigio; VCL significa valore ± SD: 84,8 ± 17.4 µm/s per 15 s e 84,6 ± 16,5 µm/s per 120 s) e gli spermatozoi statici (nero). La velocità degli spermatozoi è stato diviso in 4 gruppi: rapido (VCL significa valore ± SD: 119,3 ± 13,7 µm/s per 15 s e 118,9 ± 13,3 µm/s per 120 s; bianco), medio (VCL significa valore ± SD: 79,7 ± 15,5 µm/s per 15 s e 79,6 ± 15,5 µm/s per 120 s; grigio chiaro) , lento (VCL significa valore ± SD: 32,9 ± 6,5 µm/s per 15 s e 32,6 ± 6,6 µm/s per 120 s; grigio scuro) e statico (nero). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig2.jpg"> Figura 2 : L'effetto del frame rate e la camera di conteggio in tre specie di pesci d'acqua dolce: (A) storione russo (B) Common carp e (C) Temolo. Analisi dello sperma sono stata effettuata a 50, 100, 150 e 200 fps, utilizzando due conteggio commerciale chambers con diverse profondità (10 e 20 µm). Il cerchio nero rappresenta la migliore frequenza di fotogrammi per ogni specie. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig3.jpg"> Figura 3 : Struttura di sottopopolazioni di sperma di tre generazioni di salmone atlantico: maschi selvatici (F0) e le prime due generazioni prodotte in cattività (F1 e F2). Dopo analisi dei cluster, sono state osservate quattro sottopopolazioni: rallentare gli spermatozoi non lineari (basso LIN, STR e VCL; cluster 1; nero), veloce gli spermatozoi non lineari (STR inferiore, alta VCL; cluster 2; grigio scuro), veloce spermatozoi lineari (LIN alta, STR e VCL; cluster 3; intermedio di grigio) e più veloce degli spermatozoi lineari (più alto LIN, STR e VCL; cluster 4; grigio chiaro). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56823/56823figsup1.jpg"> Supplementare nella figura 1. Diverse aree visive dall'analisi della motilità degli spermatozoi di anguilla europea definiti come migliore (A) e (B) peggiore della concentrazione cellulare. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823figsup1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Il presente protocollo descrive una procedura di valutazione di sperma di pesce mediante analisi computerizzata dello sperma e dispositivi di raffreddamento. Il software dà un rapido, accurato e l'analisi quantitativa della qualità dello sperma di pesce basata sulla motilità degli spermatozoi, che può essere un utile strumento nel settore dell'acquacoltura per migliorare il successo di riproduzione.

Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Views.  PROiSER R+D S.L.. Il presente protocollo descrive una procedura di valutazione di sperma di pesce mediante analisi computerizzata dello sperma e dispositivi di raffreddamento. Il software dà un rapido, accurato e l'analisi quantitativa della qualità dello sperma di pesce basata sulla motilità degli spermatozoi, che può essere un utile strumento nel settore dell'acquacoltura per migliorare il successo di riproduzione.

Video: Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals. Peromyscus species are used in a wide range of research including toxicology, epidemiology, ecology, behavioral, and genetic studies. Here they provide a useful model for demonstrations of artificial insemination. 

Methods similar to those displayed here have previously been used in several deer mouse studies, yet no detailed protocol has been published. Here we demonstrate the basic method of artificial insemination. This method entails extracting the testes from the rodent, then isolating the sperm from the epididymis and vas deferens. The mature sperm, now in a milk mixture, are placed in the female&#x2019;s reproductive tract at the time of ovulation. Fertilization is counted as day 0 for timing of embryo development. Embryos can then be retrieved at the desired time-point and manipulated.

Artificial insemination can be used in a variety of rodent species where exact embryo timing is crucial or hard to obtain. This technique is vital for species or strains (including most Peromyscus) which may not mate immediately and/or where mating is hard to assess. In addition, artificial insemination provides exact timing for embryo development either in mapping developmental progress and/or transgenic work. Reduced numbers of animals can be used since fertilization is guaranteed. This method has been vital to furthering the Peromyscus system, and will hopefully benefit others as well.

This protocol demonstrates methods for extracting sperm from the testes of males and then inseminating female mice. This procedure is useful when precise time is needed in developmental studies as well as transgenic work.

Lo sperma raccolto e l&#39;inseminazione artificiale di topi

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the number of successful mating events rather than on maximizing survival and viability 1. Sperm competition represents the competition between males after copulating with the same female 2, in which their sperm are coincidental in time and space. This phenomenon has been reported in multiple species of plants and animals 3. For example, wild-caught D. melanogaster females usually contain sperm from 2-3 males 4. The sperm are stored in specialized organs with limited storage capacity, which might lead to the direct competition of the sperm from different males 2,5.
Comparing sperm competitive ability of different males of interest (experimental male types) has been performed through controlled double-mating experiments in the laboratory 6,7. Briefly, a single female is exposed to two different males consecutively, one experimental male and one cross-mating reference male. The same mating scheme is then followed using other experimental male types thus facilitating the indirect comparison of the competitive ability of their sperm through a common reference. The fraction of individuals fathered by the experimental and reference males is identified using markers, which allows one to estimate sperm competitive ability using simple mathematical expressions 7,8. In addition, sperm competitive ability can be estimated in two different scenarios depending on whether the experimental male is second or first to mate (offense and defense assay, respectively) 9, which is assumed to be reflective of different competence attributes.
Here, we describe an approach that helps to interrogate the role of different genetic factors that putatively underlie the phenomenon of sperm competitive ability in D. melanogaster.

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Differential sperm competitive ability among Drosophila males with distinct genotypes can be ascertained through double-mating experiments. Each of these experiments involves one of the males of interest and a reference male. Readily identifiable markers in the progeny allow inference of the fraction of individuals fathered by each male.

Differenze valutando in capacità competitiva sperma in<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Valutare Contributi specie-specifiche per lo sviluppo craniofacciale Uso Chimere Quaglia-anatra

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...