Este proyecto ha recibido financiación de la Asociación de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE y programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea bajo la Marie Sklodowska-Curie proyecto IMPRESS (GA n 642893). Nos gustaría agradecer al equipo de científico de PROiSER, específicamente para el estudiante Alberto Vendrell Bernabéu, para su participación activa en la grabación de vídeo de este proyecto.

Procedimientos relacionados con temas de animales han sido aprobados (2015/VSC/guisante/00064) por la Dirección General de producción agrícola y ganadera en la Universitat Politècnica de València.
1. recoger esperma de anguilas europeas maduras en cautiverio
Nota: Uso anguila europea los machos mantenidos en tanques con agua de mar y un sistema de recirculación a temperatura constante (20 ° C). Tratar con hormonas por inyección intraperitoneal semanal (gonadotropina coriónica humana (hCG); 1,5 UI / g de peso de pescado). Aclimatarse gradualmente a partir de 3 días en agua dulce peces seguido del reemplazo con agua de mar (1/3 del agua total en el tanque) cada 2 días hasta llegar a una salinidad de 37,0 g/mL.
<ol><li>Anestesiar la anguila 24 h después de la inyección de hormonas para obtener muestras de mejor calidad de esperma.<ol>
<li>Preparar previamente la anestesia: Añadir 300 mg de benzocaína a 100 mL de etanol al 70%. Mezclar bien y guardar a 4 ° C.</li>
		<li>Diluir la benzocaína en una cubeta flexible con 5 L de agua del sistema para obtener una concentración final de 60 mg/L y mezclar correctamente.</li>
		<li>Transferencia de los peces al cubo con agua del sistema y benzocaína. Espere unos minutos hasta que el pescado calma abajo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpiar el área genital con agua y secar con papel absorbente para evitar la contaminación de las muestras de esperma por las heces, orina o agua de mar.</li>
	<li>Aplique presión suave en la zona abdominal y recoger las muestras de esperma en tubos de plástico de 15 mL con la bomba de vacío. Volumen de esperma hasta 6-7 mL, dependiendo el hombre.</li>
	<li>Mantener muestras de esperma a 4 ° C durante al menos 1 h hasta que se realizan el análisis de la motilidad.</li>
</ol>2. refrigerar y diluir las muestras de esperma
<ol><li>Preparar previamente la solución diluyente. Nota: Las muestras de esperma deben ser diluidas en la solución diluyente específica para cada especie.<ol>
<li>Prepare el soporte no activador para las muestras de esperma de anguila (medio de P1). Añadir 0,42 g de bicarbonato de sodio, 1,828 g de cloruro de sodio, 0,127 g de cloruro de magnesio, 0,56 g de cloruro de potasio y 0,037 g de cloruro de calcio a 250 mL de agua destilada. Mezclar bien para disolver. Almacenar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establecer el bloque refrigerador a 4 ° C para mantener las muestras a una temperatura constante. Espere hasta que la temperatura se estabilice.</li>
	<li>Diluir las muestras de semen con el diluyente específico de la solución para cada especie. Nota: La relación de dilución es especie específica y debe ser definida para estandarizar el protocolo. En primer lugar, estimar la concentración espermática basada en la concentración obtenida en el análisis previo de la motilidad, utilizando el software, como se explica en los pasos 3 y 4. Con este análisis, también es posible seleccionar las mejores muestras de esperma, basadas en el porcentaje de motilidad. Después de esto, el investigador puede comenzar a recopilar datos para el experimento con las mejores muestras de la concentración correcta.<ol>
<li>Diluir las muestras de esperma de la anguila en el medio de P1 con una proporción de 1:50. Para preparar 500 μl de semen diluido de Anguila, añada 50 μl de la muestra de semen fresco y 450 μl de P1. Mezclar bien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. evaluar los parámetros de motilidad de espermatozoides
<ol><li>
Configuración del módulo de movilidad del Software
	<ol>
<li>Establecer la etapa de refrigerador a 4 ° C y esperar hasta que se estabilice.</li>
		<li>Abra el software y seleccione Módulo motilidad. Crear nombre de usuario y contraseña si es necesario.</li>
		<li>Seleccione propiedades y elija los parámetros deseados antes de iniciar el análisis de esperma.<ol>
<li>Haga clic en especies | Pescado.</li>
			<li>Seleccionar los Cuadros por segundo y el Número de imágenes, según las mejores condiciones técnicas para cada especie. Configurar ambas opciones en 120 imágenes por segundo.</li>
			<li>Elegir el contraste negativo. Es obligatorio para la reconstrucción exacta de los espermatozoides trayectorias16.</li>
			<li>Seleccione la correspondiente Cámara de recuento y escala de la cámara. Calibrar la cámara para la lente de aumento utilizado en el experimento. Establezca SpermTrack10 como cámara de recuento y la escala X 10. Nota: en general, una profundidad de 10 μm en la cámara de recuento y una lente de 10 X son las condiciones recomendadas ya que proporcionan la mejor focalización de los espermatozoides y capturar el mayor número de células. Sin embargo, se recomienda hacer un estudio previo de las condiciones óptimas para el análisis de la motilidad de cada especie.</li>
			<li>Ajustar el Área de la partícula y la Conectividad para cada especie. Establecer el área de la partícula mínimo en conectividad a 7 μm y μm2 2. Nota: Para los peces, el valor mínimo de rangos de área de partículas entre 2-5 μm y la conectividad depende de la velocidad de los espermatozoides y la velocidad de fotogramas.</li>
			<li>Guardar la configuración.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Seleccione capturar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analizar el esperma de la anguila europea con Software
	<ol>
<li>Preparar la solución de activador (agua de mar artificial) mediante la adición de 0,946 g de sal comercial a 25 mL de agua destilada con 2% BSA.</li>
		<li>Tomar 500 mL de solución de activador (agua de mar artificial) y en el bloque frío. Nota: en general, esperma de pez es activada por un evento de choque osmótico, aunque para algunas especies la concentración del ion también podría ser importante. Para especies de agua dulce, el medio activador debe tener osmolalidad hipotónica, mientras que para especies marinas, el medio debe ser hipertónico.</li>
		<li>Coloque la cámara cuenta en la etapa de enfriamiento y espere hasta que se estabilice la temperatura a 4 ° C.</li>
		<li>Mezcle el activador y activar espermatozoides y empezar el grabación entre 5-10 s después de la activación de vídeo motilidad esperma diluida.<ol>
<li>Tomar 4 μL de solución de activador y lugar en la cámara de conteo.</li>
			<li>Homogeneizar suavemente el esperma diluido agitando la microcentrífuga 3 veces para evitar daños en las células de espermatozoides.</li>
			<li>Tomar 0,5 μl de semen diluido, mezclar con el activador y poner la tapa de la cámara de conteo rápido. Nota: Este paso no debe tomar más de 5 s para iniciar el análisis tan pronto como sea posible.</li>
			<li>En las células de espermatozoides y encontrar la mejor zona visual, que se define por un número bajo de espermatozoides (150-200 células) para evitar la intercepción entre las células (suplementario Figura 1A). Seleccionar Captura de Video para obtener las pistas de espermatozoides, que están separadas según la velocidad.</li>
			<li>Seleccione capturar para obtener campos de 3 a 7, que son el intervalo óptimo para obtener una menor variabilidad en los resultados y proceder como antes. Grabar videos de hasta 120 activación posterior de s con el fin de evitar la condensación en la tapa de la cámara de conteo.</li>
			<li>Seleccione salir para tener una visión general de todos los campos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. obtener los datos de motilidad
<ol><li>Seleccionar campos de | Parcial | Guardar y elegir un nombre de archivo. Haga clic en Guardar. Nota: La hoja de cálculo proporciona valores medios de datos, gráficos e imágenes de pistas de espermatozoides.</li>
	<li>Seleccione datos generales | Nombre de archivo | Guardar. Nota: Los datos proporcionan valores cinéticos para espermatozoides individuales de todos los campos.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El software de análisis de esperma utilizado en este protocolo ha sido utilizado por investigadores en todo el mundo para diferentes especies, incluyendo peces. Sin embargo, los peces tienen algunas características específicas que pueden afectar la evaluación de espermatozoides. Espermatozoides de peces mostraron alta velocidad en el momento de la activación que declina rápidamente y conduce a un corto plazo de la movilidad después de la activación. Además, la temperatura de la reproducción depende de la especie y, en algunos casos, podría ser alrededor de 4 ° C2,4,8,12. Por lo tanto, es necesario hacer algunas adaptaciones para mejorar la eficiencia de un sistema computarizado para análisis de la esperma de peces. El principio básico de los parámetros de motilidad es la adquisición y análisis de imágenes sucesivas de espermatozoides móviles. Mayoría de los sistemas utiliza velocidades de fotogramas estándar (16, 25, 30, 50 o 60 fps) debido a limitaciones de hardware y software17,18,19,20,21,22. Sin embargo, algunos estudios mostraron que una mayor velocidad aumenta algunos parámetros de velocidad, como VCL, STR, FBC15,23,24. Esto es particularmente importante cuando es necesario evaluar el hyperactivation de espermatozoides y la velocidad máxima de espermatozoides11,17,18,19, 25. en relación con la temperatura de análisis, una placa de enfriamiento para el microscopio óptico y una nueva tecnología para refrigerar las muestras a temperatura constante también podría mejorar el análisis en el tiempo. El presente trabajo ofrece un acercamiento para resolver dos de los principales problemas asociados con el pescado esperma motilidad temperatura y análisis de sensibilidad. A pesar de los resultados centrándose en algunas especies de agua dulce, esta metodología podría utilizarse para especies marinas, aunque el medio de la activación debe ser adaptado para cada especie.
En el mercado, hay una gama de productos o incluso diferentes versiones de un mismo producto. Aunque los sistemas tengan el mismo principio, cada uno tiene diferentes detalles que resulta de la incompatibilidad de resultados26,27,28. Además, la evaluación de la calidad del esperma de pescado todavía podría tener limitaciones metodológicas y técnicas. La técnica de activación del espermatozoide y el momento del análisis después de la activación son dos factores esenciales que afectan esperma calidad evaluación29,30. El tiempo entre la activación de muestras de esperma y la estabilización de imagen para grabaciones de vídeo debe ser alrededor 5 s desde los primeros segundos (intervalo de tiempo de 5-20 s) proporciona los datos más útiles2,4. El tiempo de análisis de la esperma puede ser limitado debido a problemas de condensación en el portaobjetos de cristal. Sin embargo, espermatozoides de peces permanecen activos con un movimiento vigoroso por menos de dos minutos2. A nivel técnico, es necesario conocer la velocidad de fotogramas «óptimo» para obtener información de detalle que da una reconstrucción exacta de los espermatozoides trayectorias15. En menores tasas de marco, los detalles de la trayectoria se pierden, particularmente para espermatozoides rápidas y no lineales, mientras que a tasas más altas de la estructura, la información se convierte en redundante15,31. Para algunas especies de peces, el marco de la tarifa (hasta 250 fps) no sería suficiente para encontrar la velocidad máxima de los espermatozoides de algunas especies de peces, como tímalo y salmón. Esta variación es especie específica y debe definirse para que cada especie estandarizar el protocolo y obtener resultados confiables15,23,24. La profundidad de la cámara de conteo puede limitar el movimiento del flagelo grande de los peces y los espermatozoides no podían alcanzar la velocidad máxima11,32,33. Además, el software puede tener algunas limitaciones en la detección de espermatozoides real cuando hay una intersección de las células.
Clásica evaluación de la calidad del esperma es un análisis subjetivo basado en la estimación de la concentración y el porcentaje de motilidad, que puede producir variabilidad en los resultados. Sin embargo, un sistema computarizado proporciona mediciones rápidas, exactas y cuantitativas de los parámetros de motilidad. Este análisis objetivo da una gran cantidad de datos y reduce la variabilidad de resultados34,35,36,37. La respuesta de comportamiento de la motilidad del esperma depende de la temperatura del análisis y varía entre especies38,39,40. Temperatura óptima de los análisis de esperma podría proporcionar esperma velocidad y duración del periodo de movilidad similar a las condiciones naturales de reproducción38,40. Por lo tanto, software de análisis de esperma con dispositivos de refrigeración mejora la evaluación de la calidad del esperma de pescado.
Los resultados de análisis de calidad de la esperma podrían mejorar el conocimiento sobre características del esperma de pescado y calidad basada en subpoblaciones de espermatozoides, que puede ser el futuro de la evaluación de semen en todas las especies animales41,42. En un nivel práctico, esta técnica podría ser un indicador de los ganaderos de alta calidad y ayuda a obtener más información sobre espermatozoides proceso de selección, cálculo de dosis seminales para inseminación artificial, competición espermática basada en la velocidad y progresividad y fertilidad potencial. Todo este conocimiento se puede aplicar a los campos de investigación, incluyendo programas de acuicultura y la conservación, lo que estimuló el interés en el almacenamiento de esperma de peces y criopreservación en las últimas décadas2,13. Efectos toxicológicos también están recibiendo especial interés debido a los problemas ambientales, así como estudios el desarrollo de estudios filogenético basado en esperma motilidad características43,44.
Este trabajo ha mostrado cómo la optimización de un software automático para análisis de motilidad de la esperma de pescado mejora los resultados. Estandarización del protocolo debe tener en cuenta la temperatura de análisis y de la velocidad de fotogramas, que podría ser diferente dependiendo de la especie. Sin embargo, el análisis de la motilidad del esperma de pescado tiene dos pasos críticos que el investigador debe prestar atención. Recogida de esperma es el primer paso crítico que puede destruir la muestra debido a la contaminación por heces, orina y agua (agua de mar o agua dulce). El otro punto crítico se asocia con el momento de la activación de la esperma y el inicio de grabaciones de vídeo. Este paso debe realizarse tan pronto como sea posible recolectar datos cuando los espermatozoides tienen movimiento vigoroso.

La eficacia de la reproducción depende de la calidad de ambos gametos (óvulos y espermatozoides)1,2. Este es el principal factor que contribuye a la fertilización exitosa, permitiendo el desarrollo de crías viables3,4. La conveniente evaluación de la calidad de gametos es la mejor herramienta para definir el potencial de fertilidad de una muestra.
Mezclando la esperma de varios machos es una práctica común en la producción de muchas especies comerciales4. Sin embargo, la variabilidad de esperma entre los hombres puede conducir a la competencia de esperma y, en consecuencia, no todos los varones están contribuyendo igualmente a la piscina de gene5. En este sentido, la correcta evaluación de características de eyaculado/espermatozoides individuales, tales como movilidad, es fundamental obtener información discriminatoria con respecto a la fertilidad masculina individual posibles. Observación directa de la motilidad espermática puede producir datos imprecisos y subjetivos ya que requiere tiempo y experiencia, que conduce a una falta de coherencia e incompatibilidad de resultados6,7. Sin embargo, hay muchas técnicas innovadoras, rápidas y cuantitativas que pueden proporcionar una calidad de esperma confiable análisis2,4.
Análisis de los espermatozoides asistido por ordenador fue desarrollado para ofrecer datos precisos sobre esperma calidad8. Esta tecnología incluye el desarrollo de software asociado con un microscopio de contraste de fase que permite la evaluación de la motilidad espermática. Sin embargo, un factor limitante del parámetro de movilidad es la velocidad de fotogramas de la cámara. Los espermatozoides trayectorias se basan en espermatozoides cabeza posición centroide en fotogramas consecutivos de grabaciones de vídeo, que se correlaciona con el movimiento flagelar patrones3,9,10, 11. los principales parámetros cinéticos medidos son la velocidad de línea recta (VSL), velocidad curvilínea (VCL) y velocidad promedio ruta (VAP). VSL es la distancia entre el inicio y el punto final de los espermatozoides divididos por tiempo. VCL es la velocidad real a lo largo de la trayectoria exacta tomada por los espermatozoides. VAP es la velocidad a lo largo de una trayectoria suavizada derivada de trayectoria. Estos parámetros permiten obtener información cinética adicional, incluyendo linealidad (LIN), rectitud (STR), bamboleo (WOB) y mediciones de golpeo como amplitud del movimiento lateral de la cabeza (ALH) y frecuencia de ritmo-Cruz (BCF)4,10.
El sistema de análisis de esperma se utilizó originalmente para especies de mamíferos, y uno de los requisitos para el sistema debe funcionar a la temperatura del cuerpo del donante (unos 37 ° C). Este software también podría ser utilizado para especies de peces; Aunque, es necesario hacer algunas adaptaciones para reducir el error de los resultados de análisis de esperma. En algunas especies de peces como los salmónidos y anguila8,12, la fertilización se produce a baja temperatura (alrededor de 4 ° C)2,4. Así, equipos de refrigeración deben ser desarrollado para evitar las condiciones de trabajo incómodas. Además, fish de espermatozoides son fijos en el líquido seminal y requieren un choque osmótico para activar la motilidad. Para especies de agua dulce, el medio activador debe tener osmolalidad hipotónica, mientras que para especies marinas, el medio debe ser hipertónico. Sin embargo, para algunas especies, como los salmónidos, la concentración del ion también podría ser importante3,4,9. Después de la activación, esperma de pez se caracteriza por una rápida disminución de motilidad (menos de 2 min)13,14 y alta velocidad, siendo vital para determinar la velocidad de fotogramas óptima para obtener datos confiables15.
Los objetivos de este estudio están diseñar y aplicar sistemas de refrigeración para las muestras de esperma de peces. Además, este protocolo define cómo determinar las tarifas de marco óptimo para el establecimiento de los protocolos dependiendo de la especie. El uso de este protocolo abre nuevas puertas en el contexto de la evaluación seminal de peces, utilizando la anguila europea como modelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:179px;">Argent Chemical Laboratories</td>
			<td style="width:151px;">hCG</td>
			<td style="width:167px;">Hormone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzocaine</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">E1501 Sigma</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">S5761 Sigma&#160;</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1.06406 EMD Millipore</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1374248 USP</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">P3911-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">commercial salt</td>
			<td style="width:179px;">Aqua Medic&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Meersalz</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">05470 Sigma</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes 15 ml</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T1943-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes support</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">R5651-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Eppendorfs</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">PIPETMAN&#174; Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z683787-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740030-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740028-2000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Spermtrack</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Counting chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">TruMorph</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">TruMorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Microscope UB 200i Serie</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler plate</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler block</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISAS v1</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">ISAS</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

Para la evaluación de la calidad de gametos, hay técnicas innovadoras, rápidas y cuantitativas que pueden proporcionar datos útiles para la acuicultura. Sistemas computarizados para el análisis de la esperma se desarrollaron para medir varios parámetros y uno de los más comúnmente medido es la movilidad de los espermatozoides.
Inicialmente, esta tecnología fue diseñada para especies de mamíferos, aunque también puede ser utilizado para el análisis de esperma de peces. Peces tienen características específicas que pueden afectar el esperma evaluación como un momento de poca motilidad después de la activación y, en algunos casos, adaptación a temperaturas más. Por lo tanto, es necesario modificar los componentes tanto de software como de hardware para hacer análisis de motilidad más eficientes para el análisis de esperma de peces. Mamíferos de los espermatozoides, la placa de calefacción se utiliza para mantener temperaturas óptimas de los espermatozoides. Sin embargo, para algunas especies de peces, es ventajoso utilizar una temperatura más baja para prolongar la duración de la movilidad, ya que los espermatozoides permanecen activos por menos de 2 min. Por lo tanto, dispositivos de enfriamiento están necesarios refrigerar las muestras a temperatura constante durante el tiempo de análisis, incluyendo en el microscopio óptico. Este protocolo describe el análisis de la motilidad del esperma de pescado utilizando el software para el análisis de la esperma y refrigeración nuevos dispositivos para optimizar los resultados.

Análisis del efecto de tiempo en la motilidad del esperma
En el caso de la anguila europea, el porcentaje de espermatozoides estáticos aumentó de 15 s a 120 s después de la activación (de 24,4% a 40,7%) y el porcentaje de espermatozoides móviles de progresivas disminución (de 36,9% a 20,9%) (Figura 1A y 1B). Basada en la velocidad, las células espermatozoides demostraron una disminución en la velocidad con el tiempo (figura 1C y 1D) disminuido. El porcentaje de espermatozoides con velocidad rápida disminuyó alrededor del 23% (de 49.4% a 26.6%) y el porcentaje de espermatozoides con velocidad medio aumentó alrededor 7%.
El efecto de la velocidad de fotogramas y la cámara de conteo
Diferentes especies requieren velocidades de fotogramas diferentes para obtener resultados óptimos. Esturión ruso requiere 150 fotogramas por segundo (fps; Figura 2A); carpa común requiere 100 fps (figura 2B); y para el grayling, 200 fps no fue suficiente para obtener resultados óptimos de cinéticos (figura 2). Estos resultados no eran dependientes en la profundidad de la cuenta cámara de prueba (figura 2A-2 C).
Estructura de las subpoblaciones de espermatozoides
La identificación de la subpoblación de espermatozoides se basa en el análisis estadístico. El primer paso es la determinación de los principales componentes (análisis de componentes principales; PCA) desde el conjunto completo de datos de la movilidad. Luego, se realizan los procedimientos de agrupamiento con los índices derivados del esperma obtenidos después del PCA.
Para este estudio, se utilizó esperma de salmón del Atlántico que mostró cuatro subpoblaciones diferentes, llamadas: lenta no lineal (baja LIN, STR y VCL), rápido no lineal (baja STR, VCL alta), rápido lineal (LIN, STR y VCL) y más rápido lineal (LIN más alta STR y VCL). La distribución de estas subpoblaciones variada a lo largo de generaciones de animales silvestres a cultivadas unos (figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig1.jpg"> Figura 1 : Efecto de la activación después de tiempo en la progresividad y la motilidad de los espermatozoides de la anguila europea. A y B) porcentaje de progresividad a s 15 y 120, respectivamente; y C y D) el porcentaje de motilidad basada en la velocidad con el tiempo (15 y 120 s tras la activación, respectivamente). La progresividad se dividió en tres grupos: células móviles progresivas (blanco; VCL media ± SD de valor: 114,5 ± 18.2 y 101,4 ± 34.5 μm/s s 15 y 120, respectivamente), sin células móviles progresivas (gris; VCL media ± SD de valor: 84,8 ± 17,4 μm/s, 15 s y 84.6 ± 16.5 μm/s por 120 s) y los espermatozoides estáticos (negro). La velocidad de los espermatozoides se dividió en 4 grupos: rápido (VCL media ± SD de valor: 119.3 ± 13,7 μm/s, 15 s y 118,9 ± 13.3 μm/s por 120 s; blanco), medio (VCL media ± SD de valor: 79,7 ± 15.5 μm/s, 15 s y 120 μm/s 79.6 ± 15.5 s; gris claro) , lento (VCL media ± SD de valor: 32,9 ± 6.5 μm/s, 15 s y 32,6 ± 6.6 μm/s por 120 s; gris oscuro) y estática (negro). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig2.jpg"> Figura 2 : El efecto de la velocidad de fotogramas y la cámara de conteo en tres especies de peces de agua dulce: (A) esturión ruso (B) carpa y (C) tímalo. Análisis de la esperma se hizo en 50, 100, 150 y 200 fps, con cuenta comercial dos cámaras con distintas profundidades (10 y 20 μm). El círculo negro representa la mejor velocidad de fotogramas para cada especie. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56823/56823fig3.jpg"> Figura 3 : Estructura de las subpoblaciones de espermatozoides de tres generaciones de salmón del Atlántico: los machos salvajes (F0) y las dos primeras generaciones en cautiverio (F1 y F2). Después de análisis de conglomerados, se observaron cuatro subpoblaciones: lento espermatozoides no lineales (baja de LIN, STR y VCL; cluster 1; negro), rápido espermatozoides no lineales (STR inferior, VCL alta cluster 2; gris oscuro), rápido espermatozoides lineares (LIN alta STR y VCL; cluster 3; intermedios de gris) y más rápidos lineales espermatozoides (mayor LIN STR y VCL; grupo 4, gris claro). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56823/56823figsup1.jpg"> Suplementario figura 1. Diferentes áreas visuales a partir del análisis de la motilidad de espermatozoides de anguila europea definidas como mejor (A) y (B) el peor celular concentración. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56823/56823figsup1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

El presente Protocolo describe un procedimiento de evaluación del esperma de pescado utilizando el análisis de los espermatozoides asistido por ordenador y equipos de refrigeración. El software ofrece una rápida, precisa y análisis cuantitativo de la calidad del esperma de pescado basada en motilidad de espermatozoides, que puede ser una herramienta útil en la acuicultura para mejorar el éxito de la reproducción.

Evaluación del esperma de pescado utilizando Software y equipos de refrigeración

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K vistas.  PROiSER R+D S.L.. El presente Protocolo describe un procedimiento de evaluación del esperma de pescado utilizando el análisis de los espermatozoides asistido por ordenador y equipos de refrigeración. El software ofrece una rápida, precisa y análisis cuantitativo de la calidad del esperma de pescado basada en motilidad de espermatozoides, que puede ser una herramienta útil en la acuicultura para mejorar el éxito de la reproducción.

Video: Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals. Peromyscus species are used in a wide range of research including toxicology, epidemiology, ecology, behavioral, and genetic studies. Here they provide a useful model for demonstrations of artificial insemination. 

Methods similar to those displayed here have previously been used in several deer mouse studies, yet no detailed protocol has been published. Here we demonstrate the basic method of artificial insemination. This method entails extracting the testes from the rodent, then isolating the sperm from the epididymis and vas deferens. The mature sperm, now in a milk mixture, are placed in the female&#x2019;s reproductive tract at the time of ovulation. Fertilization is counted as day 0 for timing of embryo development. Embryos can then be retrieved at the desired time-point and manipulated.

Artificial insemination can be used in a variety of rodent species where exact embryo timing is crucial or hard to obtain. This technique is vital for species or strains (including most Peromyscus) which may not mate immediately and/or where mating is hard to assess. In addition, artificial insemination provides exact timing for embryo development either in mapping developmental progress and/or transgenic work. Reduced numbers of animals can be used since fertilization is guaranteed. This method has been vital to furthering the Peromyscus system, and will hopefully benefit others as well.

This protocol demonstrates methods for extracting sperm from the testes of males and then inseminating female mice. This procedure is useful when precise time is needed in developmental studies as well as transgenic work.

Los espermatozoides de cosecha y la inseminación artificial de los ratones

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Investigación

Biología

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the number of successful mating events rather than on maximizing survival and viability 1. Sperm competition represents the competition between males after copulating with the same female 2, in which their sperm are coincidental in time and space. This phenomenon has been reported in multiple species of plants and animals 3. For example, wild-caught D. melanogaster females usually contain sperm from 2-3 males 4. The sperm are stored in specialized organs with limited storage capacity, which might lead to the direct competition of the sperm from different males 2,5.
Comparing sperm competitive ability of different males of interest (experimental male types) has been performed through controlled double-mating experiments in the laboratory 6,7. Briefly, a single female is exposed to two different males consecutively, one experimental male and one cross-mating reference male. The same mating scheme is then followed using other experimental male types thus facilitating the indirect comparison of the competitive ability of their sperm through a common reference. The fraction of individuals fathered by the experimental and reference males is identified using markers, which allows one to estimate sperm competitive ability using simple mathematical expressions 7,8. In addition, sperm competitive ability can be estimated in two different scenarios depending on whether the experimental male is second or first to mate (offense and defense assay, respectively) 9, which is assumed to be reflective of different competence attributes.
Here, we describe an approach that helps to interrogate the role of different genetic factors that putatively underlie the phenomenon of sperm competitive ability in D. melanogaster.

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Differential sperm competitive ability among Drosophila males with distinct genotypes can be ascertained through double-mating experiments. Each of these experiments involves one of the males of interest and a reference male. Readily identifiable markers in the progeny allow inference of the fraction of individuals fathered by each male.

Diferencias Evaluación de Capacidad Competitiva de espermatozoides en<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Evaluar Aportes específicos de la especie para el desarrollo craneofacial Utilizando quimeras Quail-pato

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocolo para el uso de gen Set enriquecimiento análisis para identificar el modelo Animal adecuado para la investigación traslacional

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...