Ringrazio Alex L. Kolodkin, mentre ho imparato questo protocollo di preparazione filato nel suo laboratorio. Ringrazio anche Young Gi Hong per l&#39;assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).

1. Preparazione <ol><li> Preparare 500 ml di soluzione fisiologica tamponata (PBS) con la soluzione di t-Octilfenossipolietossietanolo (PBT) aggiungendo 0,5 g di albumina bovina serum (BSA) e 0,5 ml di t-Octilfenossipolietossietanolo (vedere tabella dei materiali) a 500 ml di 1X PBS E mescolando per almeno 30 minuti. Conservare a 4 ° C. Utilizzare quando è relativamente fresco e conservare la soluzione in una bottiglia pulita. </li><li> Preparare 10 ml di 4% di paraformaldeide aggiungendo 2,5 ml di soluzione di paraformaldeide di riserva del 16% e 1 ml di 10 volte PBS a 6,5 ​​ml di acqua deionizzata. Conservare a 4 ° C e utilizzare entro una settimana. ATTENZIONE: Evitare il contatto con la soluzione di paraformaldeide perché è altamente tossico. </li><li> Realizzare il substrato X-Gal (10% in peso di X-Gal in dimetilsolfossido (DMSO)) sciogliendo 0,1 g di substrato X-Gal per 1 mL di DMSO. Conservare a -20 ° C in aliquote di 100 μL. </li><li> Realizzare la soluzione di colorazione X-Gal utilizzando buffer di fosfato 10 mM (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK 4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] e 0,3% t-Octilfenossipolietossietanolo. Conservare a 4 ° C al buio. </li><li> Fai una soluzione di perossido di idrogeno al 3% diluendo 30% di perossido di idrogeno di riserva 1:10 con acqua deionizzata. </li><li> Creare una soluzione di 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) completamente dissolvendo 1 compressa (10 mg) di DAB in 35 ml di soluzione PBT fresca. Filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm e conservare a -20 ° C in aliquote di 910 μL. ATTENZIONE: Smaltire tutti i rifiuti DAB in candeggina per distruggere il DAB. </li><li> Fare piastre d&#39;uovo con succo di mela. Aggiungete 35 g di agar e 1 L di acqua deionizzata in una fiala da 2 L. Aggiungere 33 g di saccarosio, 2 g di tegosept e 375 ml di succo di mela a una fiala da 1 L. Sciogliere con autoclave per 30 min. Lasciare entrambe le soluzioni a raffreddarsi a circa 60 ° C. Combinate e mescolate bene queste soluzioni mescolando. Versare 11 ml di soluzione combinata per piatto di coltura da 60 mm. </li><li> Fare la pasta del lievito mescolando yea del panettiereSt in acqua deionizzata (rapporto 1: 0,8) e conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. Collezione di embrioni (Day 1) <ol><li> Raccogli le mosche femminili e maschili (meno di 5 giorni) e per 1-2 giorni, mantenerle in una gabbia di plastica con un piatto d&#39;uovo (60 mm x 15 mm) che contiene una piccola quantità di pasta di lievito al centro. </li><li> Per la raccolta ottimale degli embrioni a tarda fase 16, impostare una gabbia di bottiglia con mosche (&gt; 50) alle circa 5 PM e lasciarle gettare le uova a 25 ° C per 3 ore. </li><li> Trasferite le mosche in una bottiglia di cibo fresca. </li><li> Chiudere la piastra di uovo con il coperchio e incubarla a 25 ° C in un incubatore umidificato (~ 70% di umidità) durante la notte. </li></ol> 3. Preparazione degli embrioni per l&#39;immunodoscrizione (giorno 2) <ol><li> Aggiungere 1,8 ml di soluzione PBT alla piastra d&#39;uovo intorno alle 10:20 e utilizzare un tampone di cotone per allentare gli embrioni dalla piastra mentre inclinandolo. Nota: mescolando delicatamente la pasta del lievito usando un cottSul tampone, scioglietelo nel caso in cui si trovino un gran numero di embrioni. Iniziare a raccogliere gli embrioni ~ 40 min prima della fissazione (intorno alle 11:00). </li><li> Trasferire gli embrioni dalla piastra d&#39;uovo in un microprocessore da 1,5 ml utilizzando una punta da 1 ml. </li><li> Consentire agli embrioni di saldare e aspirare il più possibile la soluzione PBT. Risciacquare gli embrioni due volte con 1 mL di soluzione PBT. Aspirare il più possibile la soluzione PBT. </li><li> Riempire il tubo con 1 ml di candeggina del 50% (diluito in acqua deionizzata) e decifrare gli embrioni incubandoli su un nutatore per 3 minuti a temperatura ambiente (RT). Nota: questo passaggio non uccide gli embrioni esauriti. </li><li> Consentire agli embrioni esauriti di saldare, aspirare il candeggiante del 50% il più possibile e sciacquare gli embrioni 3 volte con 1 mL di soluzione PBT. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di eptano e successivamente aggiungere 0,5 ml di soluzione paraformaldeide al 4% al tubo a RT intorno alle 11:00. </li><li> IncubareEmbrioni su un nutatore per 15 minuti a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione 4% di paraformaldeide (lo strato inferiore). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di metanolo al 100% e devitellinare gli embrioni scuotendo il tubo vigorosamente per 30 s. </li><li> Rimuovere l&#39;eptano ( cioè il livello superiore). </li><li> Aggiungere 0,5 mL di metanolo al 100% e scuotere il tubo vigorosamente per 10 s. </li><li> Lasciare che gli embrioni si stabiliscano toccando il tubo e aspirano il metanolo il più possibile. Sciacquare gli embrioni con 1 ml di metanolo al 100%, scuotendo per meno di 10 s. Nota: L&#39;esposizione prolungata al metanolo distrugge l&#39;attività di β-Gal. </li><li> Rimuovere il metanolo e sciacquare gli embrioni devitellinizzati 3 volte con 1 mL di soluzione PBT. </li></ol> 4. Genotipizzazione degli embrioni usando la colorazione LacZ (Day 2) <ol><li> Aggiungere 1 ml di soluzione PBT al tubo e incubare il tubo in un blocco termico a 37 ° C o in bagno d&#39;acqua per 15 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, posizionare la soluzione di colorazione X-Gal (1 mL per tuEssere a 65 ° C in un bagno d&#39;acqua fino a diventare nuvoloso. Incubare in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione PBT e aggiungere 1 ml di soluzione di colorazione X-Gal e 20 μl di substrato X-Gal al tubo. </li><li> Incubare il tubo a 37 ° C con il nodo fino a che non sia evidente un precipitato azzurro. Nota: l&#39;intervallo di incubazione per i balanceri blu e secondi in generale varia da 2-4 h. </li><li> Rimuovere la soluzione di colorazione X-Gal e risciacquare gli embrioni 3 volte con 1 mL di soluzione RT PBT. </li><li> Utilizzando una sonda o una pinza ad ago, ordinate gli embrioni del genotipo desiderato ( cioè, embrioni bianchi non macchiati) con un microscopio di dissezione di luce (obiettivi 1.6X-2.5X). Nota: poiché alcuni balanceri blu, come CyO, actin-LacZ e TM3, actin-LacZ , trasportano un costrutto transgenico che esprime batteri β-Gal (LacZ) sotto il controllo del promotore di actina , gli embrioni colorati blu in modo ubiquo contengonoUna o due copie di cromosomi blu balancer. Pertanto, gli embrioni bianchi non macchiati sono omozigoti per l&#39;allele letale desiderato. </li></ol> 5. Immunostaining di embrioni con Anti-Fasciclin II Antibodies (Day 2-3) <ol><li> Raccogliere e trasferire gli embrioni del genotipo desiderato ( cioè, embrioni bianchi non macchiati) in un microtubo da 0,5 mL usando una punta di pipetta da 1 ml. Nota: In questa fase, gli embrioni possono essere approssimativamente pianificati secondo criteri morfologici, inclusi i pattern di segmentazione della cuticola e le strutture della testa e della coda 9 . Durante l&#39;involuzione della testa, tra i 10 ei 16 h dopo la posa delle uova, l&#39;embrione subisce una notevole riduzione del segmento anteriore più anziano 9 . </li><li> Lavare gli embrioni una volta con 0,4 ml di soluzione PBT e aggiungere 0,3 ml di soluzione di blocco (5% di capra normale di capra e 5% di DMSO in soluzione PBT). </li><li> Bloccare gli embrioni con la nutrazione a RT per 15 minuti. </li><li&gt; Aggiungere 75 μL di anti-Fasciclin II anticorpo e incubare il tubo con la nutrazione a RT durante la notte. </li><li> Lavare gli embrioni 4 volte con 0.4 mL di soluzione PBT per almeno 20 minuti per lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,3 ml di soluzione di blocco (5% di siero di capra normale in soluzione PBT) contenente anticorpi anti-mouse-HRP di capra (2 μg / mL) e incubare il tubo con la nutrazione a RT per una notte. </li><li> Lavare gli embrioni 6 volte con 0.4 mL di soluzione PBT per almeno 20 minuti per lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,3 ml di soluzione DAB al tubo. ATTENZIONE: Indossare guanti e mettere tutti i rifiuti / tubi / punte DAB in candeggina. </li><li> Aggiungere 2 μl di 3% di perossido di idrogeno e incubare il tubo al buio con la nutrazione a RT fino a produrre la quantità desiderata di precipitato. Nota: Il tempo di incubazione per immunohistochemistry 1D4 in generale varia da 0,5 a 1 h. </li><li> Lavare gli embrioni 4 volte con 0.4 mL di soluzione PBT. ATTENZIONE: Rimuovere la soluzione DAB e le prime due lavaggi con pipetta e diScardarli in candeggina. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di fissaggio al 70% di glicerolo / PBS al tubo e conservare a RT oa 4 ° C. Nota: Tenere il tubo lontano dalla luce. Possono essere ottenute preparazioni più chiare posizionando gli embrioni in una soluzione al 90% di glicerolo / PBS 10 . Tuttavia, è più difficile disseccare gli embrioni eliminati in soluzione al glicerolo / PBS del 90% rispetto a quelli eliminati nella soluzione 70% di glicerolo / PBS 10 . </li></ol> 6. Stage, dissezione, montaggio e imaging degli embrioni (giorno 4) <ol><li> Per la messa in scena, trasferire gli embrioni equilibrati con il 70% di glicerolo / PBS su una vetrata. </li><li> Raccogli gli embrioni di fase 16 che hanno nervi addominali 7 (A7), A8 e A9 ISN convergenti a toccarsi e / o avere midgut suddiviso in tre bande. Nota: Gli embrioni macchiati con anticorpo 1D4 possono essere eseguiti in base ai modelli di proiezione degli assoni del motore ISN e ISNb. Dopo aver lasciato il CNS, A7, A8 e A9 ISN neI reti degli embrioni a tarda fase 16 convergono a toccarsi e successivamente si divergono per estendersi fino ai muscoli dorsali (la freccia in figura 1A ). Negli embrioni a metà stadio 16, tuttavia, i nervi ISN A7 si estendono in parallelo con i nervi A8 / A9 (staffa quadrata nella Figura 1B ). Inoltre, gli assi di proiezione di A6 ISNb nervi (perpendicolari ai muscoli ventrolaterali) in entrambi i hemisegment sono in linea di massima allineati con l&#39;estremità posteriore delle fascette longitudinali dell&#39;assone longitudinale del CNS (frecce e una linea in figura 1C ). Questi criteri morfologici sono leggermente diversi tra diversi genotipi. In alternativa, gli embrioni possono essere organizzati sulla base della morfologia dell&#39;intestino 9 , 11 . Prima della fase 17, il midgut ha una forma simile a cuore, mentre il midgut è suddiviso in tre fasce dalla fase 17 12 . </li><li> Disseccare gli embrioni. <ol><li> Utilizzando un 1 mL, spostare ogni embrione dalla goccia di glicerolo e posizionare l&#39;embrione ventral-face verso l&#39;alto. Tagliare la parte anteriore a 1/4 della lunghezza del corpo e la regione più posteriore senza assoni motori. </li><li> Usando una sonda dell&#39;ago, spostare l&#39;embrione terminato dalla goccia di glicerolo, rotolare per orientarlo con il lato dorsale e posizionarlo orizzontalmente nel campo. Nota: quando l&#39;embrione viene spostato dalla goccia di glicerolo, un po &#39;di glicerolo associato all&#39;embrione lo rende appiccicoso. </li><li> Tagliare l&#39;embrione lungo la linea mediana dorsale usando un singolo ago tungsteno molto fine 13 . Fare un piccolo taglio alla parte posteriore dell&#39;embrione e poi continuare a tagliare la linea mediana dorsale verso l&#39;anteriore; Taglio nella direzione opposta è anche bene. </li><li> Usando una sonda di ago, spostare l&#39;embrione tagliato a metà linea nella goccia di glicerolo, posizionarlo con il lato dorsale verso l&#39;alto e staccare l&#39;intestino dalla parete del corpo espellendo ogni parete del corpo in direzione ventrolaterale (diagonale) (2Obiettivo .5X). Nota: Assicurarsi che la linea mediana dorsale sia completamente tagliata, con conseguente completa separazione tra le pareti del corpo sinistro e destro. </li><li> Spostare con cautela l&#39;embrione tagliato a metà linea dalla gocce di glicerolo e quindi posare due appendici della parete del corpo sullo scivolo in vetro utilizzando una sonda fine dell&#39;ago (obiettivo 2.5X). </li><li> Utilizzando un ago di tungsteno molto fine, rimuovete gli organi interni dall&#39;embrione sezionato spingendoli lateralmente (obiettivo 5X). Nota: Una descrizione più dettagliata di un&#39;altra procedura di dissezione simile può essere trovata sul sito web 5 . </li></ol></li><li> Per il montaggio, aggiungere 2-3 μL di 70% di glicerolo / PBS per embrioni puliti e sezionati e, utilizzando una sonda fine ago, trasferirli in una nuova vetrata su cui è stata diffusa 8 μL di 70% di glicerolo / soluzione PBS Il centro (obiettivo 2.5X). </li><li> Mettere una copertura (18 mm x 18 mm). Sigillare i bordi della copertura con un rasoio regolareChiaro o colorato va bene). </li><li> Cattura immagini con obiettivi ad alta risoluzione (20X, 40X e 63X) con un microscopio leggero a contrasto di interferenza (DIC), secondo le istruzioni del produttore. Nota: Una migliore visualizzazione e caratterizzazione fenotipica, in particolare per gli assoni del motore ISNb, può essere prodotta usando un obiettivo 63X di immersione ad olio. </li></ol>

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L&#39;autore dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

I dettagli dei difetti di guida dell&#39;assone motorico sono segnati più velocemente e con maggiore precisione dalla preparazione filettata di embrioni macchiati da DAB che dalla scansione laser di microscopia confocale di etichette fluorescenti. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi e 1D4 è più adatta per la caratterizzazione funzionale delle molecole di cue di guida. Quattro grandi classi di indici di orientamento, compresi i netrini, i fessure, i semafori (Semas) e le efrine e i loro recettori cognati hanno ruoli evolutamente conservati da worm, mosche e vertebrati 20 . Tra molecole familiari rotonde (Robo) che fungono da recettori per le fessure, Drosophila Robo è stata identificata per mediare la funzione di guida repulsiva nel CNS 6 , 21 . I semas sono una grande famiglia di molecole di guida che si legano a complessi recettori contenenti plexin 22 . La funzione di guida dell&#39;assone di SemasFu scoperto per la prima volta nella cavalletta CNS 14 . Successivamente, la semafora transmembrana di classe 1 Sema-1a è stata ampiamente caratterizzata in Drosophila . Sema-1a, che funziona non solo come un ligando per plexin A, ma anche come un recettore per un ligando sconosciuto, svolge un ruolo importante nella repulsione dell&#39;assone-axon a punti specifici di scelta durante lo sviluppo neuronale embrionale 15 , 16 , 17 , 18 ( Figura 2C ). Ci sono alcuni passaggi comuni di risoluzione dei problemi che possono verificarsi con il protocollo corrente. Innanzitutto, nei passaggi 3.9-3.13, gli embrioni possono essere devitellinizzati con una bassa efficienza se si utilizzano embrioni troppo o troppo piccoli nella procedura di devilitellizzazione in metanolo. In questo caso si raccomanda di utilizzare un volume di letto di 40-80 μL di embrioni fissi per la devitellinizzazione al punto 3.5. Secondo, in stePs 3.9-3.13, la debolezza di X-Gal può verificarsi in caso di esposizione più lunga al metanolo o alla rimozione incompleta di eptano, poiché il metanolo utilizzato come fissativo distrugge l&#39;attività di β-Gal. In questo caso, è meglio che la procedura di devitellinizzazione con metanolo nei punti 3.9-3.13 sia eseguita il più rapidamente possibile. Inoltre, l&#39;eptano residuo che è solubilizzato in metanolo può interferire con la colorazione; Quindi, è meglio rimuovere il maggior quantità di metanolo possibile nei passaggi 3.11-3.13. Il protocollo di preparazione del filetto attuale può essere applicato a schermate genetiche perdite di funzionalità e di guadagno di funzionalità per identificare nuovi geni coinvolti nella percorrenza dell&#39;assone motore e nel riconoscimento di bersagli. Tuttavia, uno svantaggio di questo protocollo è che richiede molto tempo per disseccare gli embrioni fissi per generare preparazioni filettate. Per ovviare a questo problema, la caratterizzazione fenotipica delle proiezioni assonali può essere monitorata in una preparazione a tutto sesto di 1D4 macchiato embRyos, anche se questo metodo fornisce una visualizzazione a bassa risoluzione delle proiezioni assonali nella periferia. Tuttavia, il protocollo di preparazione a tutto il montaggio si è dimostrato un approccio efficiente per la screening dei geni di orientamento dell&#39;assone 4 . È stato recentemente sviluppato un protocollo alternativo che utilizza la dissezione in diretta di embrioni etichettati con fluorescenza per lo screening sistematico 11 . Il protocollo di dissezione vivo consente una preparazione relativamente rapida per l&#39;analisi fenotipica 11 . Tuttavia, questo protocollo non è sufficiente per gli embrioni più vecchi dell&#39;inizio della fase 17 11 . Il protocollo di preparazione del filetto descritto qui può essere utilizzato per esaminare i modelli di espressione proteica con diversi anticorpi. Inoltre, questo protocollo può essere applicato anche agli embrioni di Drosophila in varie fasi di sviluppo.

Collegamenti precisi e selettivi tra gli assi del motore e i muscoli target durante lo sviluppo embrionale sono essenziali per la normale locomozione nelle larve Drosophila . Il pattern embrionale di 30 fibre muscolari in ciascuno dei due emisegmenti addominali A2-A7 è stabilito dalla fase 16 1 . I 36 neuroni motori generati nel cavo del nervo ventrale estendono gli assoni nella periferia per innervare i muscoli specifici 2 . Il percorso dell&#39;assonamento del motore e il riconoscimento del bersaglio possono essere visualizzati mediante immunohistochemistry con un anticorpo (anticorpo monoclonale del mouse 1D4) 3 , 4 . Sono disponibili molteplici immagini dei motori di proiezione dell&#39;assone motore in embrioni di tipo selvatico sul web 5 . L&#39;anticorpo 1D4 etichetta tutti gli assoni motori e tre fascette longitudinali di assoni su ciascun lato della linea mediana del sistema nervoso centrale embrionale (CNS) 4 </sUp&gt; , 6 ( Figura 1C e Figura 2A ). Pertanto, immunohistochemistry con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per identificare i geni necessari per la connivenza neuromuscolare per dimostrare i meccanismi molecolari alla base di guida axon motore e riconoscimento target. In ciascuno degli emisferi addominali A2-A7, gli assi del motore si disegnano e selettivamente fascicolano in due rami nervose principali, il nervo segmentale (SN) e il nervo intersegmentale (ISN) 2 , 4 e un ramo nervoso minore, il nervo trasversale (TN ) 7 . La SN defascicola in modo selettivo per dare origine a due rami nervosi denominati SNa e SNC, mentre l&#39;ISN si divide in tre rami nervosi denominati ISN, ISNb e ISNd 2 , 4 . Tra questi, ISN, ISNb e SNA motor axonI modelli di proiezione sono mostrati in modo più preciso quando gli embrioni a tarda fase 16 sono macchiati con FasII e sono filettati ( Figura 1C e Figura 2A ). I neuroni motori ISN estendono i loro assoni per innervare i muscoli dorsali 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 e 20 2 , 4 ( Figura 2A ). I neuroni motori ISNb innervano i muscoli ventrolaterali 6, 7, 12, 13, 14, 28 e 30 2 , 4 ( Figura 2A e 2B). Il ramo nervo SNa proietta innervare i muscoli laterali 5, 8, 21, 22, 23 e 24 2 , 4 ( Figura 2A ). Il TN, costituito da due assi motori, proietta ipsilateralmente lungo il bordo segmentale per innervare il muscolo 25 e fa sinapsi con il neurone dendritico bipolare laterale (LBD) nelPeriferia 7 ( figura 2A ). Queste innervazioni muscolari del bersaglio richiedono non solo la defasciculazione selettiva di assoni motori a punti specifici di scelta ma anche il riconoscimento muscolare. Inoltre, alcune cellule di guidepost mesodermiche putative che fungono da bersagli intermedi sono state trovate sia nei percorsi ISN che SNa, ma non lungo il percorso ISNb 4 . Ciò potrebbe suggerire che l&#39;indirizzamento dell&#39;asse axon del motore ISNb può essere regolato in maniera distinta rispetto alla guida dell&#39;assone motore ISN e SNa e indica anche che la guida per l&#39;asse del motore periferico fornisce un attraente modello sperimentale per studiare i ruoli differenziali o conservati di una singola indicazione di guida Molecola 8 . Questo lavoro presenta un metodo standard per visualizzare gli schemi di proiezione axon dei neuroni motori embrionali in Drosophila . I protocolli descritti includono come disseccare gli embrioni fissi macchiati con 1D4 aE trasformato in 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) per preparazioni di filetti. Un vantaggio critico delle preparazioni piane di embrioni fissi è la migliore visualizzazione delle proiezioni assonali e dei modelli muscolari nella periferia. Inoltre, questo lavoro mostra anche come genotipare gli embrioni fissi per ordinare gli embrioni mutanti desiderati utilizzando il metodo di colorazione LacZ.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal Substrate</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Tricon Beaker</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf Instant Yeast Red</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FasciculinII Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4 anti-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)&lt;br/&gt; (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Duran Group</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Duran Group</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>Tungsten Wire, &amp;oslash;0.13mm/6.1m (&amp;oslash;.005&quot;/20 ft.)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Korean Science</td><td>KO.VS-96TWS</td><td>Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

La creazione di circuiti neuromuscolari funzionali si basa su precisi collegamenti tra assoni motori in sviluppo e muscoli target. I neuroni motori estendono i coni di crescita per navigare lungo percorsi specifici rispondendo a un gran numero di segnali di guida dell&#39;assone che emanano dall&#39;ambiente extracellulare circostante. Il riconoscimento del bersaglio di cono di crescita inoltre svolge un ruolo fondamentale nella specificità neuromuscolare. Questo lavoro presenta un protocollo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. Questo protocollo comprende alcuni passaggi chiave, tra cui una procedura di genotipizzazione, per ordinare gli embrioni mutanti desiderati; Una procedura di immunostaining, per etichettare gli embrioni con l&#39;anticorpo fasciclin II (FasII); E una procedura di dissezione, per generare preparazioni filettate da embrioni fissi. Le proiezioni dell&#39;assone motorio e le forme muscolari della periferia sono molto meglio visualizzate in preparazioni piatte di embrioni di filetti che in whOle-mount embrioni. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell&#39;assone motore e il riconoscimento del bersaglio e può anche essere applicato sia a schermi genetici di perdita di funzionalità e di guadagno di funzionalità .

Le connessioni precise tra gli assi del motore e i muscoli del bersaglio durante lo sviluppo neurale dipendono dalla repulsione selettiva dell&#39;assone-axone e dal riconoscimento dei bersagli in punti specifici 4 . In Drosophila , la repulsione selettiva tra gli assoni motori è parzialmente regolata dall&#39;azione combinata dei semafori di classe 1 e 2 (Semas), inclusi Sema-1a, Sema-2a e Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Pertanto, la perdita della funzione Sema-1a comporta spesso il guasto degli assoni ISNb a defascicolare in determinati punti di scelta, causando una morfologia anormalmente densa (la freccia in figura 2C ). Negli embrioni di tipo selvaggio, almeno 7 neuroni motori si estendono e fascicolano i loro assoni per formare un ISNB del ramo nervoso ( Figura 2A ). Quando il ramo nervo ISNb raggiunge un punto di scelta che si trova tra i muscoli 6 e 7, due assoni selettivamente defascicano dal fascio principale ISNb e innervano poi i muscoli 6 e 7 ( Figura 2B ). Al punto di scelta successivo, che si trova tra i muscoli 6, 13 e 30, altri tre assi motori defascicano selettivamente per innervare i muscoli 13, 14 e 30 ( figura 2B ). I rimanenti due assi si estendono dorsalmente per raggiungere l&#39;ultimo punto di scelta vicino al bordo del muscolo 12, innervando così il muscolo 12 nella direzione opposta ( figura 2B ). Questi risultati mostrano chiaramente che il protocollo di preparazione filettato fornisce uno strumento utile per studiare i geni necessari per la guida dell&#39;assone motore. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig1.jpg" /> <strOng&gt; Figura 1: Stabilimento di embrioni basati sugli schemi di proiezione degli assoni del motore ISN e ISNb. ( A ) Negli embrioni di tipo wildtype a tarda fase 16, i nervi ISN (frecce) A7, A8 e A9 si convergono a toccarsi a vicenda (punta di freccia). L&#39;anteriore è sinistra e la ventrale è in discesa. La barra di scala = 15 μm. ( B ) Negli embrioni di tipo selvatico di mid-stage-16, il nervo ISN A7 si estende in parallelo con i nervi A8 / A9 (staffa quadrata). Le frecce indicano i nervi A7, A8 e A9 ISN. L&#39;anteriore è sinistra e la ventrale è in discesa. La barra di scala = 15 μm. ( C ) Preparazione di filetti di embrioni di tipo wildtype a tarda fase 16 macchiati con FasII anticorpo. Gli assi di proiezione (frecce) dei nervi ISNb di sinistra e di destra A6 sono grossolanamente allineati con l&#39;estremità posteriore dei fascicoli longitudinali dell&#39;assone longitudinale CNS (linea nera). I segmenti addominali A1-A7 sono etichettati in cima. L&#39;anteriore è rimasta. La barra di scala = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55830/55830fig1large.jpg" target="_blank">richiesta</a>Se clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig2.jpg" /> Figura 2: Schemi di proiezione dell&#39;assone di motori negli embrioni mutati di tipo selvatico e Sema-1a . ( A - C ) Preparazione filettata di embrioni a tarda fase 16 macchiati con FasII anticorpo. L&#39;anteriore è sinistra e la ventrale è in discesa. Schemi schemi che mostrano i modelli di proiezione assonale rappresentati in ciascun pannello. Le barre Scala = 15 μm. ( A ) Una fotografia a campo luminoso di due emisegmenti addominali sequenziali, A3 e A4, in embrioni di tipo selvatico. Nel CNS sono presenti tre fasci longitudinali bilateralmente simmetrici. I normali schemi di innervazione degli assoni del motore ISNb, SNa, ISN e TN sono indicati dalle scatole e da una freccia nella periferia. Il neurone dendrite bipolare laterale (LBD), che innerva i muscoli alari, è indicatDa una freccia. Nello schema, vengono presentati i rami nervosi e gli schemi di innervazione dei neuroni motori ISNb (in marrone), SNa (in blu), ISN (in verde) e TN (in giallo) e dei loro muscoli target. Le posizioni del corpo cellulare di questi neuroni motori nel CNS sono anche mostrati nei loro colori. ( B ) Negli embrioni di tipo selvatico gli assoni ISNb proiettano i muscoli ventrolaterali, numerati e innervati in punti specifici (frecce nell&#39;immagine DIC). ( C ) Nelle mutanti di perdita di funzione Sema-1a , gli assoni ISNb spesso non riescono a scorporsi l&#39;uno dall&#39;altro tra i muscoli 6 e 13 (punta di freccia nell&#39;immagine DIC). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55830/55830fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell&#39;assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K Views.  Chonbuk National University.  Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale. 

Video: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Ricerca

Neuroscienze

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Biologia dello sviluppo

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Preparazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni centrali per<em&gt; In situ</em&gt; Patch di serraggio

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Visualizzare Drosophila gamba del neurone di motore assoni attraverso la cuticola adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Tracciamento retrogrado dei neuroni motori embrionali della Drosophila utilizzando coloranti fluorescenti lipofilici

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

<a href='https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60716/retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using'>Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)</a>This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video ...

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in

Riepilogo

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Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3^Rd Instar Drosophila I preparativi larvali