Vorremmo ringraziare Changhui Pak e Alysia Vrailas Mortimer per inizialmente insegnamento SMK la tecnica di dissezione del cervello. Ringraziamo anche i membri del gruppo di Ken Moberg lab, soprattutto Chris turni, per leggere criticamente il manoscritto. Anticorpi che riconoscono Fas2 (1 4) e chaoptin (24B10) sono stati ottenuti da Developmental Studies Hybridoma Bank. Anticorpo 24B10 è stato depositato per il DSHB da Seymour Benzer e Nansi Colley24,60,61, anticorpo 1 4 è stato depositato per il DSHB da Corey Goodman 22,23,56. Stock di volare sono stati ottenuti dal centro di Stock di Bloomington. Desideriamo anche ringraziare l'Ohio Agricultural Research e Development Center (OARDC) Classifica MCIC Imaging Center per l'utilizzo del microscopio confocale all'immagine i cervelli in figura 4A e B. SMK è sostenuta da una sovvenzione NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il metodo di dissezione e visualizzazione sopra descritto può essere utilizzato in un'ampia varietà di immunostaining e vive applicazioni di imaging. Ci hanno delineato un protocollo di immunostaining generale e hanno messo in evidenza un modo in cui MARCM può essere utilizzato per visualizzare axonal morfologia dei neuroni individuali del corpo del fungo. Inoltre, queste procedure generali possono essere utilizzate anche per altre regioni del cervello in fissa di imaging o adulto appena dissecata cervelli48,65. Formazione immagine diretta può fornire un approccio più efficiente quando si analizzano i modelli di espressione di enhancer trap, geni reporter o MiMIC linee66, ad esempio. Per evitare che cattura artefatti dalla morte delle cellule durante la formazione immagine diretta di GFP in tessuto unfixed, cervelli dovrebbero essere sezionati in 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) o HL3 media48, montati su slitte di ponte in 1X PBS (o HL3) e fotografati in meno di 15-20 min cura Occorre inoltre di rimuovere tanto trachea come possibile dal cervello dissecato prima di formazione immagine, poiché può interferire con la visualizzazione della fluorescenza di GFP.
Mentre colorazione condizioni per valutare la morfologia dei neuroni del fotoricettore e corpo del fungo sono relativamente ben consolidata24,61,67, la localizzazione di una proteina specifica di interesse in queste cellule tipi possono richiedere ottimizzazione e risoluzione dei problemi completa. In particolare, diversi passaggi critici, tra cui la diluizione dell'anticorpo, blocco buffer componente concentrazione e la fissazione, dovrebbero essere ottimizzati per generare risultati più riproducibili e affidabili. In primo luogo, deve essere determinata la concentrazione ottimale di anticorpo primario. Anche se commercialmente disponibili anticorpi hanno spesso una diluizione consigliata (e spesso inizialmente iniziamo utilizzando quella concentrazione), questi valori sono raramente determinati empiricamente sui tessuti della drosofila . Di conseguenza, testare una serie di diluizioni di anticorpo primario che gamma sopra e sotto suggerimento iniziale del produttore spesso si traduce in colorazione più specifica. Mentre la diluizione di anticorpo primario può avere un effetto significativo sulla macchiatura di precisione e deve essere determinata con precisione, i cervelli di tempo vengono incubati in anticorpo primario contenente soluzioni possono variare notevolmente con scarso effetto sul risultato complessivo. Ad esempio, abbiamo osservato risultati simili quando incubando sezionati cervelli con l'anticorpo primario di anticorpo Fas2 per due, tre o anche quattro giorni a 4 ° C. Anche se si consiglia di almeno due notti, abbiamo anche incubate cervelli in soluzione di anticorpo primario per una sola notte e ottenuto macchiatura riproducibile. D'importanza, limitando la quantità di tempo cervelli sono incubati nell'anticorpo secondario a 3 h a temperatura ambiente (o una notte a 4 ° C) aiuta il legame non specifico limite di anticorpi secondari al tessuto cerebrale.
In secondo luogo, può essere necessario utilizzare altri reagenti "blocchi" per eliminare il segnale di fondo indesiderato. Le opzioni includono l'aumento della concentrazione di NGS a ~ 10%, l'aggiunta di 1-10% dell'albumina di siero bovino (BSA) per le soluzioni Anticorpo bloccante sia primario e secondario, o pre-adsorbimento di anticorpi primari durante la notte a 4 ° C con embrioni della drosofila (Vedi riferimento68, punto 2.9, passaggio 3).
Mentre abbiamo scritto il protocollo sopra utilizzando PTN del buffer suggerito per tutti i fissazione, lavaggio e fasi di incubazione dell'anticorpo, fissazione del tessuto in altri buffer (ad esempio PLP e PEM, elencati nella Tabella materiali) può provocare profonde differenze in potenza del segnale. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che la ciclina E è inosservabile in dischi immaginali larvale quando i tessuti sono stati corretti nel tradizionale paraformaldeide 4%, diluito in PBS, ma è chiaramente visibile quando i tessuti sono stati corretti nel buffer di PLP (Ken Moberg, personali comunicazione e riferimento69). Oltre alle modifiche nel buffer componenti, alterare il tempo e la temperatura per il fissaggio del tessuto possa anche significativamente influenzare immunofluorescente macchiatura e può essere determinate empiricamente se necessario. In generale, tempo di fissazione deve essere sufficientemente lungo per consentire sufficiente reticolazione delle componenti cellulari e manutenzione a lungo termine della morfologia cellulare globale pur essendo limitato abbastanza per impedire over-reticolazione e "seppellire" degli epitopi della proteina. Pertanto, quando inizialmente ottimizzazione delle condizioni di colorazione per un anticorpo primario appena acquisita, di solito limitare il tempo di fissazione a circa 20 min e spesso risolvono i tessuti alle temperature più fredde.
Diversi controlli dovrebbero essere incluso in qualsiasi esperimento di immunofluorescenza per studiare la specificità degli anticorpi primari e secondari così come l'effetto di transgeni/genetico sul fenotipo osservato. Per accertare se l'anticorpo primario utilizzato specificamente riconosce la proteina d'interesse, tessuto da mosche carenti questa proteina e/o tessuto che overexpressing la proteina dovrebbe essere incluso come controlli. L'aggiunta di proteine in eccesso di antigene purificato può anche essere incluso per determinare se l'anticorpo primario riconosce altri epitopi nel cervello volo. Infine, qualsiasi segnale fluorescente presente quando gli anticorpi primari vengono omessi rappresenta il livello di legame non specifico dagli anticorpi secondari selezionati.
Diversi controlli importanti dovrebbero essere inclusi anche per valutare il contributo del background genetico o la presenza di transgeni per intensità di colorazione o morfologia neuronale. Ad esempio, le mosche utilizzate nell'esperimento MARCM nella Figura 5 contengono transgeni multipli (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, vasca &#62; GAL80 e OK107-GAL4), ognuno dei quali dovrebbe essere analizzato separatamente per gli effetti sulla morfologia del corpo del fungo. A una morfologia molto minimo, fungo corpo di mosche che contiene OK107-GAL4 sia UAS-CD8-GFP dovrebbero essere analizzati. Può anche essere necessario valutare l'effetto di scossa di calore e produzione ricombinasi Flp sullo sviluppo del corpo del fungo analizzando Vola contenente sia hsFLP e FRT82B. Anche se MARCM può fornire la comprensione significativa in se una data proteina controlla autonomamente axonal di orientamento, il numero di controlli necessari per rendere con precisione questa conclusione può essere un limite minore di questa tecnica. Meno complicati esperimenti, controlli simili sono altresì applicabili. Ad esempio, prendere un esperimento dove il sistema GAL4/UAS viene utilizzato in combinazione con un transgene di RNAi per atterramento espressione di una proteina di interesse in tutti i neuroni. In questo esperimento, almeno due transgeni sarà presente: un pan-neuronale GAL4 driver, ad esempio di Elav-GAL4 e il transgene UAS-RNAi . La morfologia dei neuroni del corpo del fungo in mosche contenenti ciascuno di questi transgeni da solo dovrebbe essere studiata oltre alla condizione sperimentale dove mosche harbor sia transgeni al volo stesso.
Infine, per determinare se la proteina di interesse è espresso nei neuroni di corpo del fungo è solitamente necessario cervelli co-macchia con gli anticorpi al Fas2. In alternativa, le proteine fluorescenti come GFP, RFP o la membrana associato CD8-GFP possono anche essere espressa utilizzando il sistema GAL4/UAS e utilizzato in combinazione con anticorpi che riconoscono la proteina di interesse. Poiché Fas2 riconosce solo gli assoni scanditi che formano i lobi α e β del corpo del fungo, l'uso di GAL4-driven, membrana-limita CD8-GFP è stato particolarmente utile per la marcatura di neuroni del corpo del fungo.
Difetti di axonal guida spesso non sono 100% con liquidi penetranti e anche cervello dello stesso genotipo potrebbe mostrare qualche variabilità. Pertanto, quando l'analisi appena generato alleli mutanti per difetti nel corpo del fungo o path-finding del fotoricettore, dovrebbe essere utilizzata una combinazione di alleli differenti e approcci. Maggior parte degli studi nella letteratura utilizzare vari metodi per indagare se una proteina svolge un ruolo delle cellule-autonoma nel controllo Guida assonale: i) analisi di pathfinding difetti in omozigoti mosche null (preferibilmente utilizzando diversi nugli alleli ll), ii) analisi di pathfinding difetti nelle mosche manca la proteina di interesse solo in neuroni (di solito tramite RNAi), iii) analisi MARCM dei difetti di path-finding e iv) esperimenti dove il gene è riespresso nei neuroni null omozigotica di salvataggio mosche. Idealmente, dovrebbero essere analizzati diversi dozzina cervelli al genotipo per difetti nella morfologia neuronale.
Sebbene il protocollo qui descritto si concentra principalmente su immunofluorescente localizzazione delle proteine all'interno del tessuto fisso, diverse applicazioni future di questa tecnica sono state sviluppate immagine dal vivo al tessuto di cervello. Una volta cervelli vengono sezionati (solitamente in terreno di coltura delle cellule), quindi possono essere coltivate per diversi giorni a 25 ° C. Questi metodi di coltura ex vivo stanno sviluppandi per studiare una vasta gamma di processi biologici, quali attività di proteina che promuove la rigenerazione assonale dopo lesione70,71, intracellulare segnalazione dinamica72e lo sviluppo neuronale73.

Anche se il sistema nervoso di Drosophila è inferiore a quello degli esseri umani e roditori, la sua complessità fornisce un modello potente, socievole per comprendere meglio i suoi omologhi dei vertebrati. In molti casi, i genomi di vertebrati e mosche codificano proteine molto simili che dettano i meccanismi di sviluppo del sistema nervoso. Infatti, molti dei geni necessari per lo sviluppo neuronale nei vertebrati sono ortologhi in mosche, compresi quelli coinvolti in vie di segnalazione che controllo patterning, neurogenesi e orientamento axonal1,2,3 ,4,5. Ad esempio, netrina è un ligando necessario per una guida assonale in mammiferi e d. melanogaster6,7,8. Mentre netrina era originariamente isolato da pulcino embrionali cervello tessuto6, studi successivi hanno rivelato che netrina svolge un ruolo conservato durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale embrionale (CNS) in Drosophila8. Altri studi hanno utilizzato schermi genetici nell'embrionale della drosofila CNS per identificare conservati ligandi e recettori necessari per path-finding in Drosophila e vertebrati9.
Mentre la Mosca embrionale CNS è stata utilizzata ampiamente in passato per identificare ligandi, i recettori e proteine di segnalazione intracellulare necessarie per orientamento axonal8,9, lavoro recente ha studiato i modi in cui molte delle Queste proteine controllano anche decisioni di path-finding durante le fasi successive di sviluppo. In particolare, indagine del corpo del fungo (MB) e sviluppo di neurone dei fotorecettori retinici (Figura 1) ha fornito la comprensione nei meccanismi che path-finding controllo, formazione della sinapsi, potatura dell'assone e molti altri aspetti di un neurone sviluppo10,11,12,13,14,15,16,17. I neuroni del fotoricettore connettersi retina Vola in regioni del cervello adulto chiamato lamina e midollo e sono critico per l'inoltro di informazioni visive al cervello (Recensito da18,19), mentre i neuroni del corpo del fungo sono centralmente situato nel cervello volo e sono necessari per apprendimento e memoria20,21. Sia i neuroni del fotoricettore e i neuroni intrinseci dei corpi del fungo, chiamati cellule di Kenyon, utilizzano meccanismi di evolutivamente conservati Consiglio axonal diffusibile e contatto-dipendente per trovare loro obiettivi post-sinaptiche. Oltre ad essere visibile in mosche adulte, del fotoricettore e MB neuroni possono anche essere direttamente visualizzati in larve e pupe con anticorpi o geni reporter22,23,24,25. La possibilità di visualizzare facilmente questi due insiemi di neuroni in diversi momenti dello sviluppo ha promosso il loro uso come modelli superbe per molti aspetti dello sviluppo neuronale.
Oltre ad essere utilizzato come un modello per capire i meccanismi dello sviluppo normale del sistema nervoso, studi recenti hanno dimostrato che le mosche possono anche servire come modelli accurati di un'ampia varietà di malattie umane, compreso la sindrome di X Fragile (FXS)26 , Disabilità intellettuale (ID)27,28,29,30,31e gli altri32. Ad esempio, per studiare la funzione molecolare di ZC3H14, un gene recentemente collegato alla disabilità intellettuale umano, abbiamo creato un modello fly di ID utilizzando un allele nullo della Mosca dell'ortologo di ZC3H14, chiamato Nab230. Manca Nab2 mosche hanno memoria gravi menomazioni ed estesa code di poli (a), ricapitolare quello che si osserva in pazienti umani o paziente derivato cellula linee33,34. D'importanza, mosche carente Nab2 anche visualizzare severa del cervello morfologia difetti nei loro corpi fungo adulto34, simile a ciò che si osserva nelle mosche privi del gene di sindrome FXS, FMR135. Così, mosche possono servire come un importante organismo modello per studiare lo sviluppo normale del cervello e malattie che interrompono.
Infine, l'accessibilità dei metodi ad alto rendimento per monitorare il comportamento, combinato con la vasta gamma di strumenti genetici disponibili, rendono Drosophila organismo modello di scelta per l'identificazione di regioni del cervello che controllano i comportamenti complessi, come apprendimento e memoria, sonno, corteggiamento, sete e altri36,37,38,39. Uno strumento particolarmente utile che è al centro di «strumenti» di un genetista volare è il sistema GAL4/UAS (Figura 2). Questo sistema40,41 utilizza espressione specifica del tessuto dell'attivatore trascrizionale Gal4 per aumentare l'espressione di geni o transgeni a valle di una sequenza di attivazione a Monte (UAS). Le modifiche di questo sistema hanno permesso che i ricercatori, ad esempio, controllare con precisione l'eccitabilità dei neuroni specifici42,43, iperesprimere o colpo specifici geni di interesse44, 45, l'analisi del calcio in tempo reale dinamica nel vivo46ed esprimere geni reporter per contrassegnare un neurone lignaggi41. La combinazione del sistema GAL4/UAS con ricombinazione mitotica anche permesso la creazione di analisi del mosaico con un indicatore di cella reprensibile (MARCM) sistema12,47. MARCM è stato usato estesamente nell'analisi di singoli neuroni per identificare i componenti di segnalazione cellulari necessari per orientamento axonal12,47. Anche se queste e altre tecniche hanno fornito un numero di preziose informazioni sui meccanismi cellulari necessari per il funzionamento del sistema nervoso, la maggior parte richiedono che il cervello di Drosophila in primo luogo essere sezionato; rimozione accurata del cervello è necessario per mantenere corrette cervello modelli di morfologia e connessione tra regioni del cervello. Il seguente protocollo utilizza fungo neuroni del fotoricettore e corpo comepopolazioni neuronali di esempio come si guida l'utente attraverso la dissezione e cervello di Drosophila immunofluorescenza colorazione dell'adulto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Sviluppo del sistema nervoso comporta una serie sequenziale di eventi che sono coordinati da diverse vie di segnalazione e reti di regolazione. Molte delle proteine coinvolte in queste vie sono evolutivamente conservate tra mammiferi e altri eucarioti, come moscerino della frutta Drosophila melanogaster, suggerendo l'esistano di principi organizzativi simili durante lo sviluppo di questi organismi. D'importanza, Drosophila è stato usato estesamente per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano processi che sono necessari nei mammiferi, compresa la neurogenesi, differenziazione, orientamento assonale e sinaptogenesi. Mosche sono anche stati utilizzati con successo per modellare una varietà di malattie umane neurodevelopmental. Qui descriviamo un protocollo per la microdissezione passo dopo passo, fissazione e immunofluorescente localizzazione delle proteine all'interno del cervello di Drosophila adulto. Questo protocollo si concentra su due popolazioni neuronali di esempio, i neuroni del corpo del fungo e fotorecettori retinici e include passaggi facoltativi per la traccia di neuroni individuali corpo fungo usando analisi di mosaico con una tecnica di reprensibile Cell Marker (MARCM). Dati di esempio da cervelli wild-type e mutanti sono mostrati insieme con una breve descrizione di un criterio di punteggio per orientamento axonal difetti. Mentre questo protocollo mette in evidenza due anticorpi ben consolidati per indagare la morfologia del corpo del fungo e i neuroni del fotoricettore, altre regioni del cervello di Drosophila e la localizzazione delle proteine all'interno di altre regioni del cervello può anche essere studiato usando questo protocollo.

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.1K Views.  The College of Wooster. Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Video: Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

dissezione, immunoistochimica e montaggio di cervelli larvali e adulti di Drosophila per la visualizzazione del lobo ottico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...