Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione della ricerca tedesca (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Gli esperimenti animali presentati qui sono stati riesaminati e consentiti in maniera indipendente da un comitato istituzionale e governativo per la cura degli animali e sono stati condotti secondo le linee guida dell&#39;Associazione federale delle scienze animali animali (FELASA). Tutte le misure possibili sono state prese per ridurre al minimo la sofferenza, inclusa l&#39;anestesia e l&#39;analgesia o, se necessario, l&#39;eutanasia precoce. 1. Preparazione delle cellule e degli organoidi NOTA: utilizzare un volume di 20 μL con 100.000 celle per ogni iniezione. Utilizzare la matrice della membrana basamento (BMM) per evitare perdite e assicurare l&#39;iniezione standardizzata. Al fine di garantire risultati riproducibili, eseguire test di autenticazione delle linee cellulari ( ad esempio , tramite profilatura STR) a intervalli regolari. <ol><li> Preparazione di sospensioni cellulari primarie da tessuti freschi NOTA: lavorare sempre in condizioni sterili. Trasferimento immediato del frescoIl tessuto resecato dalla sala operatoria al laboratorio sul ghiaccio è necessario per garantire un&#39;elevata vitalità delle cellule. Il benessere del paziente e il trattamento ottimale devono sempre essere la prima priorità. Pertanto, i campioni di tessuto per la ricerca devono essere ottenuti in modo da non interferire con il successivo processo di formazione patologica e la messa a punto del tumore resecato. Nella maggior parte dei casi è pertanto ragionevole avere i campioni per la ricerca ottenuta da un patologo addestrato al fine di garantire la non interferenza con la diagnosi patologica. <ol><li> Immediatamente dopo la rimozione sterile dal campione resecato (idealmente ~ 1 cm 3 ), posizionare il campione di tessuto in un tubo da 50 ml pre-riempito con 20-30 ml di soluzione salina fosfato-tamponata (PBS). Conservare il tubo sul ghiaccio e trasferirlo immediatamente nel laboratorio. </li><li> Mettere il tessuto in un piatto di Petri e lavare due volte con abbondante PBS per rimuovere il sangue rimanente. </li><li> Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (~ 2-4 mm) con uno scaLpel ( ad esempio , con una lama # 20 o # 36). </li><li> Utilizzare il dissociatore secondo le istruzioni del produttore allo scopo di dissociare ulteriormente il tessuto tumorale a una sospensione a singola cellula. In alternativa, utilizzare altri protocolli di digestione tumorale enzimatica. </li><li> Conte le cellule della sospensione a singola cellula risultante ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro). </li><li> Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS. </li><li> Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparazione delle linee cellulari per iniezione <ol><li> Crescere tutte le linee cellulari del cancro colorettale in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ) e prepararle al giorno della chirurgia. </li><li> Raccogliere le cellule secondo protocolli standard della coltura cellulare, contare le cellule ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro) e calcolare il reqPer tutte le iniezioni a seconda del numero di animali da iniettare. </li><li> Preparare 3-5 volte il volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite e del volume morto della siringa d&#39;iniezione. </li><li> Centrifugare (5 minuti a 1.500 g) e lavare due volte la cellula con PBS. </li><li> Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparazione dell&#39;organoide NOTA: Tutte le colture organoide 3D sono coltivate in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ). I protocolli dettagliati per la cultura organoide sono stati pubblicati prima. 18 , 19 , 20 Simile alle linee cellulari convenzionali, si consiglia un volume di 20 μL BMM con 100.000 cellule per iniezione. Gli organoidi vengono preparati al giorno della chirurgia come segue: <ol><li> Preparare il seguente supporto (nel seguito riportatoA DMEM / F12 +++): Medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamina (200 mM) + 1% Penicillina / Streptomicina. </li><li> Pre-riempire i tubi da 15 mL con 1 mL di DMEM / F12 +++. </li><li> Aspirare con cura gli organoidi dalla superficie della piastra di coltura e trasferire il contenuto di 3 a 5 pozzetti in un tubo da 15 ml. </li><li> Coltivare con cura gli organoidi in pezzi più piccoli pipettandoli su e giù con una pipetta di vetro estesa. </li><li> Aggiungere 5 mL DMEM / F12 +++ al tubo, seguita da centrifugazione a 1000 xg per 5 min. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 600 μl di tampone enzimatico di dissociazione e trasferire la sospensione in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1-5 minuti e poi pipettare con cura la sospensione in modo da sciogliere gli organoidi. NOTA: Verificare la digestione tramite microscopio; È completo quando tutti i cluster di cellule sono stati dissociatiD alle singole celle. </li><li> Al termine della digestione, aggiungere 1.4 mL di DMEM / F12 +++ per fermare la digestione. Quindi trasferire tutti i pozzetti degli organoidi digeriti in un tubo da 50 ml. </li><li> Conte le celle e calcolare l&#39;importo richiesto per tutte le iniezioni. </li><li> Preparare 3 - 5x del volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite di pipettazione e del volume morto della siringa d&#39;iniezione </li><li> Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS. </li><li> Resuspendevano le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e li mantengono in ghiaccio. </li></ol></li></ol> 2. Modello ortotopico del mouse <ol><li> Preparazione degli animali destinatari per la chirurgia NOTA: utilizzare i topi 6-8 settimanali NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) come destinatari. 21 NSG sono tra i topi più immunocompromessi, privi di mature cellule B, T e NK insieme a molte altre proteine ​​immunitariefetti. 21 Essi aumentano in modo affidabile i tumori anche se vengono iniettati numeri di cellule basse e sono altamente inclini a metastasi distanti. I topi NSG sono erbivori eccellenti e possono essere conservati in unità convenzionali non specifiche per agenti patogeni (SPF). <ol><li> Prima della prima incisione, iniettare 0.05 mg / kg di buprenorfina sottocutanea. </li><li> Utilizzare sevoflurano a 3-3,5 vol% per l&#39;anestesia generale. Una perdita del riflesso del pizzico del piede indica un&#39;anestesia sufficiente. </li><li> Coprire gli occhi dei topi anestetizzati con unguento ophtalmico per evitare l&#39;essiccazione della cornea. </li><li> Restringere i topi in posizione supina su un piccolo tavolo. </li><li> Rasare l&#39;addome con un rasoio elettrico (la crema depilatoria può essere utilizzata alternativamente) e disinfettare con almeno 3 volte la cloressina / iodio e l&#39;alcool del 70% in alternativa. </li><li> Coprire il campo chirurgico con tende sterili. NOTA: l&#39;uso di antibiotici perioperatori è facoltativo e soggetto a linee guida istituzionali. </li></ol></li><li> Laparotomia midline e esposizione del cecum <ol><li> Usare forbici (bisturi possono essere usati alternativamente) per effettuare una piccola incisione mediana (3 - 5 mm) della pelle sull&#39;addome inferiore. Prendete la muscolatura della parete addominale con le pinze e accuratamente incise con forbici, aprendo così la cavità addominale. </li><li> Identificare e attentamente esternalizzare il cecum con pinze atraumatiche. Posizionare la cassa cieca del cecum sull&#39;addome che punta cranialmente. </li><li> Una volta esteriorizzato, mantenere il cecum umido utilizzando tamponi salini caldi in ogni momento. </li></ol></li><li> Iniezione ortotopica, chiusura dell&#39;addome e recupero postoperatorio <ol><li> Per l&#39;iniezione intracecale, utilizzare una siringa standard da 1 ml con una cannula da 30 G. Montare questa siringa su una pompa di microinjection, che viene a sua volta montata su un micromanipulator. </li><li> Cogliere con cautela la punta del cecum con le pinze atraumatiche e lisciandola delicatamente accarezzandola in discesaD con un secondo set di pinze inumidito con salina calda. </li><li> Posizionare la cannula direttamente sopra il cecum. </li><li> Eseguire le seguenti operazioni sotto controllo visivo con un microscopio chirurgico binoculare. </li><li> Afferrare con cautela il cecum con due pinze atraumatiche ad entrambe le estremità della parte esterna del cecum, leggermente allungare e poi lentamente tirarlo sopra la cannula posta in posizione parallela e direttamente sopra. È fondamentale non perforare l&#39;intera parete intestinale (iniettando le cellule nel lumen) e non perforare la serosa oltre il punto iniziale di penetrazione, in quanto ciò porterebbe alla perdita e alla diffusione peritoneale. <ol><li> Spostare l&#39;intestino verso la cannula, non la cannula verso l&#39;intestino. Tenere e allungare l&#39;intestino tra due pinze. Le mani del chirurgo devono poggiare su una superficie per ridurre il tremito. </li></ol></li><li> Iniettare le cellule tra la serosa (considerata come sottile strato traslucido sopra il thE vasi sanguigni intramurali) e la muscularis. La cannula deve quindi essere visivamente posta sopra i vasi sanguigni e sotto la sottile membrana traslucida. </li><li> Utilizzare un interruttore a pedale per avviare l&#39;iniezione per ridurre il tremito mentre la cannula è all&#39;interno della parete intestinale. </li><li> Una volta che la cannula è in posizione, avviare l&#39;iniezione. Utilizzare una durata di 20 s, con conseguente impostazione di 1 μL / s sull&#39;unità di controllo della pompa. NOTA: L&#39;iniezione in o in prossimità di un vascello sanguigno danneggiato porta ad una diffusione intravascolare diretta e a metastasi distanti e pertanto deve essere evitata. </li><li> Dopo aver completato l&#39;iniezione, rimuovere attentamente la cannula tirandola indietro. </li><li> Posizionare un tampone asciutto sotto il cecum e poi sciacquare accuratamente il cecum con acqua distillata per liscivare le cellule perdute e quindi evitare la diffusione peritoneale artificiale. </li></ol></li><li> Chiusura dell&#39;addome e recupero postoperatorio <ol><li> Dopo rInserire, riportare delicatamente il cecum alla cavità addominale. </li><li> Chiudere la parete addominale con suture da 6-0 rapidamente assorbibili. </li><li> Chiudere la pelle con le ferite chirurgiche. </li><li> Posizionare il mouse su una mappa di riscaldamento impostata a 38 ° C finché non sia stata completamente recuperata dall&#39;anestesia. </li><li> Osserva attentamente la condizione postoperatoria dei topi per i prossimi 48 h. In caso di disturbi, trattare con 0,05 mg / kg di buprenorfina ogni 12 ore. </li><li> Monitorare i topi almeno una volta al giorno per segni di sofferenza a causa della crescita del tumore. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento delle cellule tumorali circolanti da campioni di sangue intero NOTA: Ottenere il sangue mediante puntura cardiaca transcutanea su topi anestetizzati, seguita da eutanasia. Idealmente, 1.000 μL di sangue vengono prelevati in una siringa pre-riempita con 100 μL di un anticoagulante (acido etilendiammetraceico (EDTA) o eparina). Utilizzare una EpCAM anti-umana (adesione delle cellule epitelialiMolecola) per identificare i CTC. Questo funziona molto bene se le linee cellulari epiteliali umane vengono utilizzate nel modello del mouse. Per altri apparecchi potrebbero essere necessari diversi anticorpi. <ol><li> Arricchimento CTC: <ol><li> Pre-riempire i tubi da 15 mL con un campione di gradiente di densità di 5 mL e trasferire con cura il sangue nel tubo da 15 mL. </li><li> Centrifugare (30 min a 300 xg senza freno) e rimuovere con cura il supernatante superiore. </li><li> Versare il resto in un nuovo tubo da 15 ml e centrifugare (15 min, 300 xg con freno). </li><li> Recuperare l&#39;interfaas contenente le cellule mononucleari (scartare il resto) e lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Resuspendere il pellet in 200 μl PBS / 1% EDTA e aggiungere 4 μL di anticorpo EpCAM. Incubare 20 minuti sul ghiaccio al buio. </li></ol></li><li> Screening e raccolta <ol><li> Preparare il seguente buffer (in seguito denominato buffer picking): PBS + 10% siero di vitello fetale (FCS) + 1% Penicillina / STreptomicina (1%) + 0,8% EDTA. </li><li> Utilizzare una penna PAP per disegnare un cerchio di ~ 1 cm in un piatto di Petri sterile da 6 cm (impedisce la dispersione del liquido nel piatto) e pipetta 700 μL di tampone raccoglitore in questo cerchio. </li><li> Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare al tampone di raccolta di 700 μl all&#39;interno del cerchio. Controllare la densità delle cellule con il microscopio. Distribuire il campione in piatti diversi se è troppo denso. </li><li> Attendere che le cellule si stabiliscano (~ 5 min). </li><li> Schermate la goccia di sospensione cellulare per le cellule colorate (= EpCAM). </li><li> Una volta trovata una cellula, raccogliere la cellula con il micromanipolatore e metterla in un buffer di 50 μL a seconda dell&#39;analisi a valle ( ad es. , Tampone di estrazione RNA o campione di coltura). </li><li> A seconda delle analisi a valle previste, isolare le cellule e / o il mezzo negativo di EpCAM come controlli negativi. </li><li> Procedere con analisi a valle ( ad esempio , cultura cellulare, PCR). </li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine.">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research.">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nonostante la loro attività preclinica dimostrata nei modelli del topo sottocutaneo, la grande maggioranza dei nuovi composti non riesca a sperimentare cliniche e non raggiunge mai la clinica. 11 Questa evidente insufficienza dei modelli del topo sottocutaneo per simulare accuratamente i modelli di biologia e crescita dei tumori ha portato allo sviluppo di modelli ortotopici a base di iniezione di cellule tumorali direttamente nell&#39;organo originale. I modelli di topo ortotopico sono in grado di simulare la biologia e la diffusione di tumori solidi molto più accuratamente che i modelli sottocutanei. 15 Tuttavia, i principali svantaggi sono una scarsa riproducibilità soprattutto nei organi tecnicamente impegnativi come gli organi cavi e dal monitoraggio tecnicamente impegnativo della crescita tumorale. Nel nostro modello abbiamo quindi concentrato la dimensione del tumore in un punto temporale prefissato piuttosto che ripetute procedure di imaging, che limita il numero di tecnicheElaborare e per gli esami stressanti degli animali. Il modello qui descritto può essere utilizzato per varie applicazioni, come la caratterizzazione delle linee cellulari tumorali, 15 indagini sulla biologia tumorale e sulla diffusione nonché sulle prove terapeutiche. I punti endpoint evidenti sono la dimensione del tumore primario e il numero di metastasi distanti, ma possono anche essere impiegati punti finali più elaborati come i numeri CTC 17 o le modalità di imaging. La fase più critica del nostro protocollo è l&#39;iniezione di cellule tumorali sottosterosali. Richiede la pratica e deve essere eseguito in ogni momento sotto controllo visivo diretto. Se il deposito è in qualsiasi altra parte ma sotto la serosa, ma al di sopra della mucosa, non ci sarà né crescita tumorale né crescita né diffusione imprevedibile, rendendo i risultati incomparabili. Altri possibili motivi per la mancanza di sviluppo del tumore includono cellule non vitali ( ad esempio &lt;/ Em&gt;, a causa dell&#39;intervallo di tempo lungo tra il raccolto e l&#39;iniezione delle cellule) o non toglie completamente i muscoli singenici. Ciò è possibile se vengono usati i topi C57Bl / 6; Poiché esistono più sottostanti di C57B1 / 6 ( es . C57B1 / 6J e C57B1 / 6N) che mostrano differenze distinte genetiche e fenotipiche 22 che si riflettono anche nei tassi di cattura tumorale. 23 La tecnica di iniezione altamente controllata descritta qui descrive una crescita e una diffusione del tumore altamente riproducibile e distingue questo modello dai modelli orthotopici descritti in precedenza. 24 Inoltre, risciacquo cieco con acqua distillata dopo l&#39;iniezione delle cellule tumorali riduce drasticamente il tasso di diffusione peritoneale artificiale; Quindi, se la carcinomatosi peritoneale si verifica nel nostro modello, è probabilmente un risultato della biologia della linea cellulare piuttosto che una perdita di cellule tumorali iatrogene. Limitazioni di questo mOdel sono i topi riceventi che devono essere immunodeficienti se le linee cellulari umane devono essere utilizzate. Ciò limita gravemente l&#39;applicazione del modello negli studi immunologici. Tuttavia, questa limitazione può essere superata dall&#39;uso di linee cellulari murine sinergiche o organoidi (dati non pubblicati). Un&#39;altra limitazione è l&#39;uso delle stele cellulari stesse. Le linee cellulari tumorali sono spesso altamente anaplatiche, che lasciano dubbi sulla loro rappresentatività della biologia originale del tumore. Questa limitazione non è presente nei modelli di topi geneticamente modificati (GEMM), che sviluppano un nuovo tumore con l&#39;introduzione di mutazioni oncogene specifiche del tessuto. 12 Tali GEMM sono di solito basati su mutazioni condizionali a base di germi ( ad es. Un gene Aplc floccato) e attivazione mediata da Cre-mutazioni, per via dell&#39;infezione locale con adeno-cre 25 , 27 , 28 o un promotore specifico del tissueespressione. 29 , 30 , 31 Tuttavia, questi modelli richiedono spesso attraversamenti estesi e hanno una biologia altamente variabile. Se le linee cellulari primarie sono utilizzate nel modello presentato qui, la limitazione della bassa rappresentatività può essere superata senza la perdita degli altri vantaggi del nostro modello, come la riproducibilità e la relativa efficienza economica. Un&#39;altra limitazione della tecnica qui proposta è la dipendenza da EpCAM come marcatore di superficie. È ben noto che EpCAM può essere persa durante EMT e che esiste una frazione di CTC che sono EpCAM negativi. 10 , 15 Pertanto, a seconda dello scopo dell&#39;esperimento e delle linee cellulari utilizzate per l&#39;iniezione, possono essere utilizzati altri mezzi di identificazione ( ad esempio , etichettatura GFP delle cellule prima dell&#39;iniezione). In conclusione, il modello qui presentato cSostituisce uno strumento flessibile per studiare lo sviluppo e la diffusione del tumore nel contesto del microambiente originale del tumore nel colon. Se vengono utilizzate linee metastatiche, simula fedelmente la diffusione delle cellule tumorali in tutti i siti rilevanti per CRC, inclusi i CTC nel flusso sanguigno. È quindi uno strumento utile per studiare i cambiamenti fenotipici durante la crescita e la diffusione del tumore e consente di ripetuto isolamento e caratterizzazione di CTC in CRC. 15

Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle cause più comuni della morte del cancro nei paesi occidentali. 1 Mentre il tumore primario può spesso essere ripreso, il verificarsi di metastasi distanti peggiora drasticamente la prognosi e spesso porta alla morte. 2 , 3 Il correlato biologico della metastasi è la circolazione delle cellule tumorali (CTC), che si staccano dal tumore, sopravvivono in circolazione, si attaccano all&#39;epitelio nell&#39;organo bersaglio, invadono l&#39;organo e, in ultima analisi, superano le nuove lesioni. 4 Anche se i CTC sono noti per essere di rilevanza prognostica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 la loro biologia è solo in parte capita a causa della loro estrema rarità nel CRC. 10 I modelli del mouse sono un potente tOol per studiare vari aspetti della biologia del cancro. I modelli classici tumorali sottocutanei vengono prodotti mediante iniezione sottocutanea di cellule tumorali in topi riceventi, che possono essere immunocompetenti (se vengono utilizzate cellule tumorali murine singeniche) o immunodeficienti. I modelli tumorali sottocutanei sono poco costosi e producono dati veloci; La loro crescita del tumore a punto finale può essere facilmente misurata e non invasiva. Tuttavia, l&#39;88% dei nuovi composti che hanno dimostrato un&#39;attività antitumorale in tali modelli non riescono a studi clinici. 11 Ciò è in parte dovuto alle differenze tra le specie umane e topi; Tuttavia, gran parte di questo fallimento è dovuto al basso valore predittivo dei modelli del topo sottocutaneo. I modelli di topo ortotopico, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nell&#39;organo d&#39;origine e quindi crescono nel loro microambiente originale, sono quindi sempre più utilizzate nella ricerca sul cancro. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 I modelli ortotopici non solo simulano le condizioni di crescita tumorale locale; Come risultato del sito anatomicamente corretto della crescita tumorale, i modelli ortotopici del mouse permettono anche una simulazione realistica di metastasi e sono quindi utilizzati per studiare la biologia CTC 8 , 15 , 16 o la loro risposta a diversi trattamenti in CRC. 13 , 17 Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi ortotopici è la loro complessità tecnica. A seconda dell&#39;organo in cui le cellule devono essere iniettate, la curva di apprendimento finché lo sperimentatore non è in grado di indurre tumori riproducibili è piuttosto lunga. Ciò vale in particolare per i modelli del cancro del colon-retto, in quanto le cellule tumorali devono essere iniettate nella parete intestinale, che spesso provoca perforazioni, perdite di cellule tumorali o perdita cellulare tumorale endoluminale. Questo unL&#39;obiettivo è quello di descrivere il metodo di preparazione cellulare dai campioni di tessuto primario, dalle linee cellulari 2D e dalla cultura organoidea 3D e dalla loro iniezione nel cecum dei topi. La tecnica qui descritta porta a tumori altamente uniformi e, a seconda della biologia tumorale della linea cellulare utilizzata per l&#39;iniezione, la riproducibile formazione di metastasi distinte e CTC nei topi riceventi. 15

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1294">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Cell culture Media and Components</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:457px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Advanced DMEM F12</td>
			<td style="width:297px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634010</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">HEPES (1 M)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15630056</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Glutamax-I Supplement (200 mM)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">35050038</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:457px;">DMEM/ F12 +++ medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">61965026</td>
			<td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:297px;">BIOCHROM AG</td>
			<td style="width:119px;">S 0115</td>
			<td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">TrypLE Express enzymatic dissociation buffer</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free)</td>
			<td style="width:297px;">CORNING B.V. Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">6-/48-well plates with lid</td>
			<td style="width:297px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">3516/3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cell culture flask 75cm&#178;, 250 mL</td>
			<td style="width:297px;">VWR International GmbH</td>
			<td style="width:119px;">734-2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cell culture flask 150cm&#178;, 600 mL</td>
			<td style="width:297px;">Corning B.V. Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL</td>
			<td style="width:297px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400/ 72.695.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">15 ml, 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td style="width:119px;">188271/227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad Laboratories GmbH</td>
			<td style="width:119px;">1450016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Pasteur pipettes (glass, 150 mm)</td>
			<td style="width:297px;">Fisher Scientific GmbH</td>
			<td style="width:119px;">11546963/ FB50251</td>
			<td>thinly pulled by using a bunsen burner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentleMACS C Tubes</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Tumor Dissociation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-929</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 70&#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:297px;">Corning B.V. Life Sciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>for primary tumor tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Surgical Equipment</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Sevoflurane</td>
			<td style="width:297px;">AbbVie Germany GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Medical oxygen</td>
			<td style="width:297px;">Air Liquide Medical GmbH</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:297px;">Temgesic</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Bepanthen - opthalmic ointment</td>
			<td style="width:297px;">Bayer Vital GmbH</td>
			<td style="width:119px;">10047757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Normal saline 0.9% (E154)</td>
			<td style="width:297px;">Serumwerk Bernburg AG</td>
			<td style="width:119px;">10013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Aqua ad injectabilia</td>
			<td style="width:297px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">235144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO</td>
			<td style="width:297px;">Braun/neoLab</td>
			<td style="width:119px;">194291661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">30G injection needle</td>
			<td style="width:297px;">BECTON DICKINSON</td>
			<td style="width:119px;">304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">cellulose swabs</td>
			<td style="width:297px;">Lohmann &#38; Rauscher Deutschland</td>
			<td style="width:119px;">13356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Micro-Adson Forceps</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Iris Scissor - ToughCut</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Olsen-Hegar Needle Holder</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">AutoClip Kit</td>
			<td style="width:297px;">FST - Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture)</td>
			<td style="width:297px;">Johnson &#38; Johnson Medical GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Z1012H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:297px;">Parkland Scientific</td>
			<td style="width:119px;">V3000PS/PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">UltraMicro Pump with Micro4 Controller</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-4</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Footswitch for SYS-Micro4 Controller</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">15867</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Three-axis Manual Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">M325</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Magnetic Stand for Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">M10</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand</td>
			<td style="width:297px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">5479</td>
			<td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Hot Plate 062</td>
			<td style="width:297px;">Labotect</td>
			<td style="width:119px;">13854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Isis - Hair shaver</td>
			<td style="width:297px;">AESCULAP - Braun</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Binocular Surgical Microscope</td>
			<td style="width:297px;">Parkland Scientific</td>
			<td style="width:119px;">VS-2Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">CTC isolation</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">EDTA</td>
			<td style="width:297px;">Roth</td>
			<td>8040.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Density gradient medium &#8211; Ficoll</td>
			<td>StemCell - Lymphoprep</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:421px;">Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">118210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, &#248; 60 x 15 mm, 21 cm&#178;, Vent</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Cell Culture Microscope</td>
			<td style="width:297px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferman 4r Micromanipulator</td>
			<td style="width:297px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTram Air</td>
			<td style="width:297px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:457px;">aspiration pump connected to the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dmz Universal Microelectrode Puller</td>
			<td style="width:297px;">Dagan Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism Glass Capillaries</td>
			<td style="width:297px;">Dagan Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">PAP pen</td>
			<td style="width:297px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">14190169</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:297px;">BIOCHROM AG</td>
			<td style="width:119px;">S 0115</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td style="width:297px;">Life Technologies GmbH</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">EDTA</td>
			<td style="width:297px;">Roth</td>
			<td>8040.1</td>
			<td>picking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:421px;">Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:297px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">324201</td>
			<td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:421px;">HRP rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:297px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97046</td>
			<td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of circulating tumor cells in an orthotopic mouse model of colorectal cancer

Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo sottocutaneo presentano gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli di topo ortotopico sono stati introdotti per superare queste limitazioni; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente negli organi cavi come il grande intestino. Al fine di produrre tumori uniformi che crescono e metastasiano in modo affidabile, le tecniche standardizzate per la preparazione e l&#39;iniezione delle cellule tumorali sono critiche. Abbiamo sviluppato un modello di topo orthotopico del cancro del colon-retto (CRC) che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale e studi terapeutici. Le cellule tumorali da tumori primari, linee cellulari 2D (2D) o organoidi tridimensionali (3D) vengono iniettati nel cecum e, a seconda del potenziale metastatico delle cellule tumorali iniettate, formano tumori altamente metastatici. Inoltre,I CTC possono essere trovati regolarmente. Qui descriviamo la tecnica della preparazione delle cellule tumorali da entrambe le linee cellulari 2D e dagli organoidi 3D, nonché dal tessuto tumorale primario, le tecniche chirurgiche e di iniezione, nonché l&#39;isolamento di CTC dai topi tumorali e suggerimenti per la risoluzione dei problemi.

La generazione di tumori colorettali di successo e riproducibile in questo modello dipende in maniera critica da un&#39;iniezione precisa delle cellule senza perdite o perdite. Se questo è stato raggiunto, questo modello è estremamente affidabile e molto raramente si traduce in una diffusione peritoneale artificiale. La cinetica di crescita dei tumori così come i loro modelli di disseminazione dipendono dalla biologia degli organoidi e delle cellule usate. 15 Mentre le cellule HCT116 in modo affidabile metastatizzano il fegato in questo modello, la cellula SW620 forma tumori ortotopici, ma non metastasizza. 15 L&#39;uso di cellule HCT116 in questo modello rende affidabile i topi moribund entro 35 giorni dall&#39;iniezione di cellule tumorali. I tumori primari misurano circa 10 mm di dimensione ( Figura 1A e Figura 2A ), metastasi epatiche ( Figura 1B </str<html> Ong&gt; e Figura 2B ), metastasi polmonari ( Figura 1C e Figura 2C ) e cellule tumorali circolanti ( Figura 3 ) sono quasi invariabilmente presenti. Nei topi contenenti i tumori HCT116, 35 giorni dopo l&#39;iniezione di cellule tumorali sono presenti in alta frequenza e quantità e possono essere facilmente isolati per analisi a valle ( Figura 3 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig1.jpg" /> Figura 1: Immagini macroscopiche dopo la dissezione 35 giorni dopo l&#39;iniezione ortotopica delle cellule CRC Human HCT116 nei topi NSG. ( A ) Tumore primario (linea tratteggiata) nel cecum. ( B ) Fegato con molte metastasi. ( C ) Metastasi polmonari (frecce).1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig2.jpg" /> Figura 2: immagini istologiche degli organi mostrate in figura 1 . ( A ) Tumore primario (H &amp; E). ( B ) Metastasi epatiche (H &amp; E). ( C ) metastasi polmonare (immunohistochemistry anti-EpCAM). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55357/55357fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55357/55357fig3.jpg" /> Figura 3: Cellule tumorali circolanti (cellule HCT116 in topi NSG, 35 giorni dopo iniezione cellulare tumorale). Campo luminoso ( A </Forte&gt;) e immunofluorescenza (immagini anti-hEpCAM-Alexa488 ( B )) di CTC nella frazione di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55357/55357fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l&#39;iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.9K Views.  Technische Universität Dresden.  Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello. 

Video: Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip for downstream analysis and/or culture. The strategy employs the use of a novel Parylene C membrane slot pore microfilter to capture CTC and a coating of poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) for thermoresponsive viable release of the captured CTC. The capture of live cells is enabled by leveraging the design of a slot pore geometry with specific dimensions to reduce the shear stress typically associated with the filtration process. While the microfilter exhibits a high capture efficiency, the release of these cells is non-trivial. Typically, only a small percentage of cells are released when techniques such as reverse flow or cell scraping are used. The strong adhesion of these epithelial cancer cells to the Parylene C membrane is attributable to non-specific electrostatic interaction. To counteract this effect, we employed the use of PIPAAm coating and exploited its thermal responsive interfacial properties to release the cells from the filter. Blood is first filtered at room temperature. Below 32 &#176;C, PIPAAm is hydrophilic. Thereafter, the filter is placed in either culture media or a buffer maintained at 37 &#176;C, which results in the PIPAAm turning hydrophobic, and subsequently releasing the electrostatically bound cells.

A protocol to utilize a poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) coated microfilter for effective capture and thermoresponsive release of viable circulating tumor cells (CTC) is presented. This method allows capture of CTC from patients&#39; blood and subsequent release of viable CTC for downstream off-chip culture, analyses and characterization.

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified to secrete human Prostate Specific Antigen (PSA), and the procedure for the confirmation of tumor implantation. In brief, mice are anesthetized using injectable drugs and are made to lay in the dorsal position. Urine is vacated from the bladder and 50 &#181;L of poly-L-lysine (PLL) is slowly instilled at a rate of 10 &#181;L/20 s using a 24 G IV catheter. It is left in the bladder for 20 min by stoppering the catheter. The catheter is removed and PLL is vacated by gentle pressure on the bladder. This is followed by instillation of the murine bladder cancer cell line (1 x 105 cells/50 &#181;L) at a rate of 10 &#181;L/20 s. The catheter is stoppered to prevent premature evacuation. After 1 h, the mice are revived with a reversal drug, and the bladder is vacated. The slow instillation rate is important, as it reduces vesico-ureteral reflux, which can cause tumors to occur in the upper urinary tract and in the kidneys. The cell line should be well re-suspended to reduce clumping of cells, as this can lead to uneven tumor sizes after implantation.
This technique induces tumors with high efficiency. Tumor growth is monitored by urinary PSA secretion. PSA marker monitoring is more reliable than ultrasound or fluorescence imaging for the detection of the presence of tumors in the bladder. Tumors in mice generally reach a maximum size that negatively impacts health by about 3 - 4 weeks if left untreated. By monitoring tumor growth, it is possible to differentiate mice that were cured from those that were not successfully implanted with tumors. With only end-point analysis, the latter may be mistakenly assumed to have been cured by therapy.

This protocol describes the generation of murine orthotopic bladder tumors in female C57BL/6J mice and the monitoring of tumor growth.

Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

Un modello di mouse geneticamente modificato del cancro colorettale sporadico

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional (3D) tumor architecture and low relevance to human cancer. Researchers have recently developed a 3D in vitro cancer model referred to as tumor organoids that can mimic the characteristics of a native tumor in a culture dish. Here, experimental procedures are described in detail for the establishment of bladder tumor organoids from a carcinogen-induced murine bladder tumor, including culture, passage, and maintenance of the resulting 3D tumor organoids in vitro. In addition, protocols to manipulate the established bladder tumor organoid lines for genetic engineering using lentivirus-mediated transduction are described, including optimized conditions for the efficient introduction of new genetic elements into tumor organoids. Finally, the procedure for orthotopic transplantation of bladder tumor organoids into the wall of the murine bladder for further analysis is laid out. The methods described in this article can facilitate the establishment of an in vitro model for bladder cancer for the development of better therapeutic options.

This protocol provides detailed experimental steps to establish a three-dimensional in vitro culture of bladder tumor organoids derived from carcinogen-induced murine bladder cancer. Culture methods including passaging, genetic engineering, and orthotopic transplantation of tumor organoids are described.

Cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...