Ringraziamo il Prof. Geoffrey Wasteneys, Università della Columbia Britannica, per il RFP-TUB6 che esprime il seme e un revisore anonimo per utili correzioni. Siamo grati al professor Hugh Dickinson per avvisarci dell&#39;uso della pellicola di cellulosa come supporto meccanico e a John Baker per la fotografia. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio BBSRC BB / G013993 / 1 e BB / D004055 / 1 a IM, e un premio BBSRC Doctoral Training e Clarendon Scholarship a CK

1. Creazione della Camera <ol><li> Utilizzando una taglierina di vetro tagliare strisce di larghezza da 3 mm dalla fine di uno scivolo a microscopio spessore di 1 mm. Utilizzando una super-colla cianoacrilata o un nastro a doppio lato, incollare queste strisce di vetro circa 45 mm di larghezza per tutta la larghezza di una seconda scivolo a microscopio ( figura 1A ). È necessaria una diapositiva per camera, più slitte aggiuntive per versare lastre agar (una diapositiva produrrà 2-3 lastre agar). Le diapositive possono essere riutilizzate. </li><li> Tra le strisce di vetro, modella una guarnizione di altezza identica a quella di poli (dimetilsilossano) gas permeante. Posizionare una sfera di gomma di poli (dimetilsilossano) sullo scivolo ( figura 1B ), bagnare una seconda slitta con una piccola quantità di etanolo assoluto al 100% e appiattire la palla di gomma poli (dimetilsilossano) con la seconda slitta fino a raggiungere l&#39;altezza Delle strisce di vetro ( figura 1C ). <ol><li> Se necessario, tagliare l&#39;eccesso di poli (dimeThylsiloxane) con una lama di rasoio e ripetere appiattimento. </li></ol></li><li> Utilizzando una lama adatta o una lama di rasoio bagnata in etanolo assoluto, rimuovere la parte interna della gomma di poli (dimetilsilossano) per creare la cavità che più tardi avrà la piastra e la lastra di agar ( figura 1D ). </li><li> Tagliare con cura il gel con una lama di rasoio per creare una guarnizione con uno spessore finale di parete di circa 2 mm ( figura 1E ). La permeabilità dei gas attraverso una barriera di poli (dimetilsilassano) è indipendente da spessori superiori a 50 μm 11 . </li></ol> 2. Creazione della lastra agar-solidificata del medium di crescita <ol><li> Su uno scivolo a microscopia con due strisce di vetro, posizionare una copertura (22 mm x 50 mm) in modo che poggi su entrambe le strisce di vetro. </li><li> Pipettare mezzo mezzo di resistenza Murashige e Skoog contenente 1% w / v saccarosio e 1,5% w / v agar (½ MS) nello spazio risultanteSotto il coperchio fino a quando quest&#39;ultimo è completamente riempito (circa 1 mL di volume totale) e lasciare fino a quando l&#39;agar è impostato (circa 5 minuti). Nota: i composti farmacologici possono essere somministrati attraverso la lastra di agar aggiungendo opportune concentrazioni al mezzo liquido prima che venga versata la lastra. Questo è stato testato con successo per il dexametasone 12 , isoxaben, 2,6-diclorobenzonitrile (DCB), orisalin e latrunculin B. </li></ol> 3 . Terminare l&#39;impostazione della camera <ol><li> L&#39;aria equilibrata PFD agitando un piccolo volume di PFD in un tubo 7 . Aggiungere una piccola quantità (circa 200 μL) di PFD equilibrata in aria al pozzo della guarnizione del gel, ma non riempire completamente la camera. Questo PFD contribuirà ad evitare la cattura di bolle d&#39;aria sotto la lastra di agar quando viene inserita nella camera. </li><li> Rimuovere la copertura dalla lastra di agar (al punto 2.2 sopra) e utilizzare una lama di rasoio per tagliare una parte delLa dimensione e la forma del sired. Quindi posizionarlo nel pozzetto della guarnizione gel ( Figura 1F ). Dovrebbe esserci una distanza di 2-4 mm dalla guarnizione. </li><li> Riempire completamente la camera con il PFD equilibrato in aria. </li><li> Posizionare uno o più piantine di A. thaliana (fino a 3 piantine per immagini in 2-3 giorni) sulla lastra di agar con i cotiledoni e l&#39;ipocotile appesa al bordo, galleggiante in PFD ( Figura 1G ). </li><li> Per ottenere piantine, sterilizzare i semi con etanolo al 70%, impianto in mezzo ½ MS aggiunto con 1% di saccarosio e 0,8% di agar, stratificare per 2-4 giorni a 4 ° C e crescere su piastre orientate verticalmente a 22 ° C in 16 H luce / 8 h regime scuro. Per l&#39;imaging delle radici laterali, coltivare le piante per 7-10 giorni prima di trasferire alle camere di imaging. </li><li> Per chiudere la camera, applicare una copertura coprente all&#39;ottica dell&#39;obiettivo, premendola delicatamente con il bordo di una scivolata di microscopio di vetro fino a quando la coperturaPoggia su entrambe le strisce di vetro ( figura 1H ). </li><li> Se necessario, fissare la copertura con strisce di nastro chirurgico micropore largo 1,25 cm, a metà lunghezza ( Figura 1I ). Lasciare che il campione si stabilizzi per circa 30 minuti prima dell&#39;immagine. Ciò minimizza il movimento dei campioni durante l&#39;imaging. </li><li> Eseguire l&#39;imaging con un microscopio verticale per mantenere un substrato controllato per la crescita. Utilizza obiettivi 20X / 0.7NA o 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

<ol>
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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il metodo qui presentato è una semplice strategia per l&#39;imaging confocale ad alta risoluzione di sviluppo delle radici laterali per due e tre giorni. Per periodi fino a 48 h, non sono stati osservati effetti negativi del sistema di imaging sullo sviluppo della radice laterale. Dopo 48 ore la crescita media radicale laterale ha cominciato a rallentare, anche se un substrato sostanziale delle radici (37%) ha continuato a crescere a tassi paragonabili alla crescita media delle radici sulle piastre. Pertanto, attraverso la rappresentazione di un numero sufficiente di radici, le radici la cui crescita rallenta dopo 48 h può essere esclusa. Le prove sistematiche delle camere di imaging non sono state eseguite per periodi superiori a 72 h, ma si suggeriscono strategie alternative se si desidera un periodo di imaging esteso. Le camere di imaging possono essere lasciate continuamente sullo stadio del microscopio, se vengono fornite condizioni ambientali adatte o rimosse in un impianto di crescita e restituite periodicamente al microscopio. Ciò consente di immaginare in parallelo numerose camere. &lt;/ P&gt; Un vantaggio delle camere qui descritte è che le radici laterali sono fisse nella loro posizione e possono essere riprese utilizzando lenti ad alta risoluzione di immersione ad acqua. La stabilità spaziale dipende in modo critico dalla concentrazione di agar utilizzata nella lastra di supporto agar. Inizialmente sono state testate una gamma di concentrazioni diverse da 0,8% agar al 2% agar, rivelando che elevate concentrazioni in questo intervallo hanno radici stabilmente stabilite nello spazio, ma la crescita delle radici ha rallentato più velocemente e alcune radici hanno mostrato segni di stress meccanico, incluso l&#39;allungamento cellulare ridotto. Al contrario, le basse concentrazioni di agar non hanno fornito il supporto richiesto e le radici sono scivolate in x, y e z durante l&#39;imaging. La lastra ottimale dell&#39;agar 1,5% consente di fissare la posizione del campione senza effetti meccanici negativi. In queste condizioni, dopo che si stabiliscono nei primi 30 minuti circa, le radici sono stabili per molte ore, consentendo l&#39;acquisizione di dati durante la notte. Durante l&#39;acquisizione di dati 4D, le serie di z-stack erano tipicamente bRaccolti da un ulteriore 5-10 μm ma questo era principalmente per ospitare la crescita fuori-piano di radici laterali piuttosto che z-drift o wobble. Anche se la concentrazione standard di agar fornisce una certa resistenza alla penetrazione, le radici gravitograficamente in crescita infine penetreranno nell&#39;agar. Tuttavia, con una modifica minore della camera di imaging, la crescita delle radici potrebbe essere mantenuta parallela alla copertura, permettendo di immaginare le più vecchie radici laterali e le radici primarie. Inoltre, la camera di base di imaging potrebbe essere facilmente personalizzata per ipocotili. I hypocotyls sono più liberamente galleggianti in questo sistema quindi la staffa di asse z per l&#39;acquisizione di immagini è stata aumentata di solito a circa 20 μm. In questo studio è stato utilizzato un microscopio verticale, che ha permesso di controllare le proprietà del substrato. La camera di imaging può essere adattabile a configurazioni di microscopio invertito, ma deve essere valutata l&#39;influenza dipendente dal tempo della copertura di copertura rigida sugli organi intercettatori. </p&gt; Littlejohn e colleghi hanno fatto notare che la PFD stessa non scioglie facilmente le molecole biologiche, il che significa che non può essere usato direttamente per la consegna di composti farmacologici 7 . Questo problema è stato superato fornendo tali composti attraverso la lastra di mezzo di crescita solidificato su cui poggia la lastra di agar. Mentre i sistemi di perfusione rimarranno il metodo di scelta per gli esperimenti di lavaggio, la camera di imaging è stata usata con successo per la somministrazione di dexametasone 12 e di altri composti. Una nota, mentre questo articolo era in preparazione von Wagenheim e colleghi 18 hanno descritto una camera per l&#39;imaging dello sviluppo laterale della radice utilizzando la microscopia a foglio leggero.

Per studiare processi cellulari e subcellulari che sono alla base dello sviluppo delle piante, esiste una crescente domanda di strategie a lungo termine ad alta risoluzione a lungo termine. Una sfida fondamentale in questi esperimenti di imaging è il mantenimento delle condizioni fisiologiche, incluso lo scambio di gas sufficiente, più una fornitura di acqua e sostanze nutritive 1 , 2 , 3 . Per utilizzare obiettivi con alte aperture numeriche per una risoluzione ottica ottimale, i campioni devono essere posizionati in prossimità e orientati in parallelo alla copertina. Il movimento in x, y e z dovrebbe essere idealmente minimo durante l&#39;imaging. Mentre le piantine sono spesso montate in acqua o soluzione acquosa per imaging a breve termine, l&#39;acqua ha una bassa capacità di dissoluzione di CO 2 e O 2 (1,54 mg / ml e 0,04 mg / ml rispettivamente a 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , che rendeÈ inadatto per esperimenti di time-lapse prolungati. I sistemi di perfusione che mantengono livelli costanti di ossigeno e sostanze nutrienti sono una soluzione a questo problema e sono state sviluppate per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM) 1 , 2 , 3 e la microscopia a foglio leggero (LSM) 5 . Sistemi come il RootChip 2 e il RootArray 3 sono stati progettati appositamente per l&#39;imaging di tempi di sviluppo delle radici e coinvolgono germinazione dei semi in un dispositivo multi-specimen su misura. Questi accordi assicurano una minima perturbazione meccanica e sono progettati per l&#39;analisi parallela di piantine multiple, ma non ottimizzate per l&#39;imaging di strutture subcellulari. Calder e colleghi hanno progettato una camera di imaging più complessa a base di perfusione ottimizzata per l&#39;imaging di strutture subcellulari in cui il campione è tenuto in posizione da una magliaPer consentire l&#39;utilizzo di lenti ad alta immersione di ingrandimento 1 . Presentata qui è una soluzione alternativa e semplice a questo problema che non si basa sui sistemi di perfusione, ma utilizza perfluorodecalina (PFD), un perfluorocarbon che ha recentemente guadagnato la popolarità come mezzo di montaggio per l&#39; imaging Arabidopsis 6 , 7 , 8 . In tali applicazioni, l&#39;elevata capacità di PFD per la dissoluzione di CO 2 e O 2 (1,9 g / mL per O 2 in PFD rispetto a 0,04 mg / ml in acqua) 9 , consente lo scambio gassoso dal tessuto immerso. Inoltre, il PFD non è fluorescente e il suo indice di rifrazione (1.313) è paragonabile a quello dell&#39;acqua (1.333) ed è più vicino a quello del citosolo (~ 1.4) rispetto all&#39;aria (1.000) 6 . Perfluorocarburi sono stati riportati di avere un effetto fisiologico minimo su una varietà di piante e piante tI numeri 6 , con i semi di ravanello che germogliano prontamente quando immersi in PFD e che presentano una normale crescita e sviluppo per almeno due giorni interi quando sono forniti con acqua 10 . Sono state fatte osservazioni analoghe per germinare i semi di Arabidopsis 6 . Sulla base dello spargimento Raman stimolato per rappresentare direttamente la distribuzione di PFD nei tessuti delle foglie di Arabidopsis dopo l&#39;infiltrazione, Littlejohn e colleghi concludono che la PFD non è probabilmente occupata dalle cellule vive 8 . PFD è stato precedentemente utilizzato principalmente per i tessuti aerei di immagine, dove aumenta notevolmente la profondità dell&#39;immagine poiché infiltra facilmente gli spazi aerei a causa della bassa tensione superficiale 6 . Qui, PFD è adottato per l&#39;imaging confocale a lungo termine di sviluppare radici laterali. In questa configurazione, una o più piantine sono disposte su una lastra di terreno di crescita solidificata con agar e immersa in PFD. Il PFD consente gScambio armonioso nella camera di imaging, impedendo l&#39;anossia. PFD è altamente volatile e viene mantenuto da una guarnizione di gomma poli (dimetilsilossano) che ha anche un&#39;elevata permeabilità del gas (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 per CO 2 ) 11 . I nutrienti e l&#39;acqua vengono forniti dalla lastra di media solidificata con agar. Allo stesso tempo, questa lastra di agar preme dolcemente la radice contro la copertura, fissando così la relativa posizione nella camera di imaging e consentendo l&#39;utilizzo di lenti ad immersione ad alta risoluzione ad acqua. Inoltre, la lastra di agar può essere usata per somministrare una gamma di trattamenti farmacologici, compresi deksametasone, orizalin e isoxabene. Le camere di imaging possono essere assemblate in grandi numeri da diapositive standard di microscopia utilizzando attrezzature minime. Le camere di imaging sono state sviluppate e caratterizzate per studiare lo sviluppo laterale della radice, ma sono adattabili all&#39;imaging di altri organi di piantina come i suggerimenti primari della radice eipocotili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Perfluorodecalin</td>
			<td style="width:191px;">F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td>
			<td style="width:119px;">FLUTEC PP6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Poly(dimethylsiloxane) gum&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td>
			<td style="width:119px;">Item # 132700</td>
			<td style="width:167px;">Carolina Observation Gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cavity Microscope Slides</td>
			<td>VWR International Ltd, Lutterworth,&#160;UK</td>
			<td style="width:119px;">10118-600</td>
			<td>Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td style="width:119px;">604753</td>
			<td>Any &#39;super-glue&#39; suitable for glass will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cellulosic cellophane membrane</td>
			<td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td>
			<td colspan="2">325P cellulose film; 80mm disc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Diversi aspetti dello sviluppo delle piante, come la morfogenesi laterale della radice, si verificano in termini di tempo di diversi giorni. Per studiare i sottostanti processi cellulari e subcellulari, sono necessarie strategie di microscopia ad alta risoluzione che conservano condizioni fisiologiche. I tessuti vegetali devono avere adeguata nutrizione e approvvigionamento idrico con uno scambio gassoso sostenuto, ma, sommersi e immobilizzati sotto una copertura, sono particolarmente suscettibili all&#39;anossia. Una strategia che è stata impiegata con successo è l&#39;utilizzo di un sistema di perfusione per mantenere un&#39;offerta costante di ossigeno e sostanze nutritive. Tuttavia, tali disposizioni possono essere complicate, ingombranti e richiedono attrezzature specializzate. Presentata qui è una strategia alternativa per un semplice sistema di imaging utilizzando perfluorodecalin come mezzo di immersione. Questo sistema è facile da installare, richiede un&#39;attrezzatura minima ed è facilmente montato su uno stadio microscopico, permettendo di impostare e produrre diverse telecamere in parAllel. In questo sistema, i tassi di crescita della radice laterale sono indistinguibili dai tassi di crescita in condizioni standard sulle piastre agariche per i primi due giorni e la crescita laterale della radice continua a tassi ridotti per almeno un altro giorno. I tessuti vegetali vengono forniti con sostanze nutritive attraverso una lastra di agar che può essere utilizzata anche per somministrare una gamma di composti farmacologici. Il sistema è stato stabilito per monitorare lo sviluppo laterale della radice, ma è facilmente adattabile all&#39;immagine di altri organi vegetali come ipocotili e radici primarie.

Le radici laterali crescono a tassi fisiologici nelle camere di imaging. Le lunghezze di radice laterale delle piante nelle camere di imaging sono state misurate ad intervalli orari ( figura 2A , sinistra, film 1, n = 23) e le percentuali di crescita sono state confrontate con quelle delle radici laterali coltivate su piastre standard Petri contenenti lo stesso agar-solidified medium 2A , a destra, Movie 2, n = 23). I tassi di crescita possono variare notevolmente tra le radici laterali, con la lunghezza della radice essere un fattore determinante per le zone sempre più lunghe di crescita e di proliferazione 13 . Pertanto, sono state selezionate serie di radici laterali per rappresentare radici di diverse lunghezze iniziali (da 50 μm a 1150 μm) sia nella camera di imaging che nella piastra agar. Media lunghezza laterale media all&#39;inizio dell&#39;esperimentoEra simile in ciascun set (439 e 442 μm rispettivamente per camere e lastre di imaging). Nell&#39;intervallo temporale analizzato di 27 h, la crescita laterale della radice era circa lineare sia nelle camere di imaging che nelle piastre, con un tasso medio di crescita di 52 μm / h (R2 = 0.997) sulle piastre e 51 μm / h nelle camere di imaging R 2 = 0,993) ( Figura 2B ). Le percentuali di crescita delle singole radici laterali dove sono molto variabili sia sulle piastre che nelle camere di imaging ( Figura 2C ), che vanno da 17 μm / h a 82 μm / h nelle camere di imaging e da 13 μm / h a 87 μm / h sulle piastre. Mentre i tassi di crescita generalmente aumentavano con la lunghezza della radice, i tassi di crescita continuavano tuttavia a variare sostanzialmente tra radici di lunghezza simile, ma la varianza era simile nelle camere di imaging e sulle lastre. Le radici laterali si proliferano nelle camere di imaging e possono essere riprese utilizzando hiGh obiettivi numerici. Le radici laterali che coesprendono il marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP 14 e il microtubulo marcatore UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 sono stati immagazzinati da CLSM 10 ad intervalli di 1h per documentare il comportamento del microtubulo durante la proliferazione cellulare nelle camere di imaging ( Figura 2D , film 3). In queste camere, le radici laterali erano altamente stabili nella loro posizione sugli assi x, y e z, consentendo l&#39;acquisizione di stack confocali continui di tempo per parecchie ore. Le cellule meristemiche continuano a proliferare, come risulta dalla formazione di bande preprofase ( figura 2D , frecce verdi), mandrini mitotici ( figura 2D , frecce bianche) e phragmoplasti ( figura 2D , frecce blu). Come per le piantine sui piatti di Petri,Le cellule di radice completamente allungate nelle camere di imaging hanno avviato i peli di radice ( figura 2A , figura 2D , teste di freccia), indicando inoltre che lo sviluppo ha proceduto come previsto nelle camere di imaging. Per fornire un ampio campo di vista, le immagini in Figura 2D sono state ottenute con un obiettivo 20x / 0.7 NA. E &#39;stato inoltre possibile ottenere immagini ad alta risoluzione delle radici laterali utilizzando un obiettivo di immersione ad acqua di 63x / 1,2 NA con elevata apertura numerica ( Figura 2E ). La crescita laterale laterale è sostenuta nelle camere di imaging fino a tre giorni. Per esaminare quanto tempo le camere di imaging avrebbero potuto sostenere la crescita laterale della radice a velocità fisiologiche, la lunghezza della radice laterale nelle camere di imaging (n = 27) e sulle piastre (n = 33) è stata quantificata a 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. Le radici choSen erano inferiori a 200 μm a 0 h, con una lunghezza di radice laterale media di 117 μm nelle camere di imaging e 121 μm sulle piastre. Dal momento che le radici più corte crescono più lentamente in media ( Figura 2C ), sono cresciute più volte sul bordo della lastra di agar e sono state più facili da produrre. La crescita media di tutte le radici laterali non era significativamente diversa nelle camere di imaging rispetto alle piastre Petri nelle prime 48 ore ( Figura 3A ). Tuttavia, la crescita media è stata significativamente ridotta tra 48 h e 72 h ( figura 3A ). Mentre i tassi di crescita sembrano generalmente rallentare nelle camere di imaging dopo 48 h, i tassi di crescita tra gli individui restano molto variabili ( Figura 3B , 3C ), il che significa che esiste un consistente sottoinsieme di radici laterali che crescono a tassi paragonabili su lastre e camere Durante il completo periodo di crescita di 72 ore. 23 delle 33 radici laterali cresciuteSulle piastre (69,7%) raggiungono una lunghezza entro una deviazione standard della lunghezza media a 72 h (tra 927 e 3.163 μm, figura 3B , rosso). 10 di 27 (37,0%) le radici laterali nelle camere di imaging raggiungono una lunghezza entro questo intervallo ( figura 3B , rosso). Le camere di imaging possono essere facilmente adattate per le radici laterali più anziane, le radici primarie e le ipocotili . Una delle limitazioni del disegno originale della camera di imaging era che mentre la lastra di agar rigida forniva una certa resistenza meccanica, le radici gravitropicamente crescenti infine penetrarono nella lastra di agar, con conseguente perdita di qualità dell&#39;immagine ( Figura 4B ) e crescita oltre la distanza di lavoro di alto NA Lenti, anche l&#39;obiettivo di lunga distanza di lavoro (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2. Le giovani radici laterali mancano del contenente statoliteCellule columella necessarie per gravitropismo 17 in modo da inizialmente crescere parallelo alla copertura in camera di imaging ( Figura 2E ). Mentre crescono più a lungo e columella e statoliti, le radici laterali mostrano un gravitropismo crescente positivo, mentre le radici primarie presentano una forte risposta gravitropica dalla germinazione in avanti. Ciò limita a poche ore il periodo in cui le radici primarie possono essere riprese e limita gravemente la lunghezza iniziale delle radici laterali che possono essere riprese in continuo per 48 ore o più. Per ovviare a questa limitazione, la camera è stata modificata in modo tale che la crescita sia mantenuta parallela alla copertura da una membrana di cellophane cellulosica che funge da barriera di penetrazione sulla superficie della lastra di agar ( figura 4A ). I tentativi iniziali usando una lastra di agar 1,5% hanno causato una crescita radicale ridotta entro i primi 24 h, dovuta forse allo stress meccanico. Le concentrazioni inferiori dell&#39;agar nella lastra sono state testateSi è trovato che nelle camere con una lastra contenente 0,8% agar e pellicola di cellulosa, i giovani tassi di crescita della radice laterale non differivano significativamente dai tassi di crescita nelle camere convenzionali per le prime 48 ore. Per 0-24 h la crescita media delle radici nelle camere di cellulosa e nelle camere convenzionali era rispettivamente di 242 μm e 262 μm (p = 0.78 Student&#39;s t-Test) e di 24-48 h rispettivamente pari a 330 μm e 355 μm (p = 0.67 Student&#39;s t-test); N = 12 e n = 11, rispettivamente. Questa disposizione impediva efficacemente le radici laterali a muoversi lontano dalla copertina, nell&#39;agar, e consentiva anche l&#39;imaging delle radici primarie fino a 48 ore ( figura 4C ). Per verificare se le camere di imaging potrebbero essere adattate per organi diversi dalle radici, sono stati scelti gli ipocotili Arabidopsis. Gli ipocotili sono sostanzialmente più spessi delle radici così nella camera convenzionale di imaging, la più alta cGli ells erano schiacciati contro la copertura, portando alla deformazione. Si è quindi sviluppato un disegno alternativo usando diapositive a cavità che contengono una depressione ovale nel loro centro ( figura 4D ). In questa configurazione è stata posizionata una lastra di spessore di 1 mm di agar (preparata come al precedente punto 2.2) con un&#39;estremità sporgente di pochi millimetri nella cavità di scorrimento ( figura 4D ). Gli ipocotili sono stati posizionati sopra la cavità nella diapositiva mentre la radice era posizionata sopra la parte orizzontale. Ciò ha assicurato che la piantina fosse fissata nello spazio dalla radice, ma l&#39;ipocotile non è stato schiacciato. Mentre i tassi di crescita nelle camere rispetto alle piastre non sono stati sistematicamente quantificati, ipocotili nelle camere di imaging hanno mostrato l&#39;onda ben descritta di crescita longitudinale che migra l&#39;ipocotile ( Figura 4E , 4F ) 16 . <img alt="Figura 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Assemblaggio di una camera di imaging. Tutti i dettagli sono descritti nel testo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Figura 2 : Le radici laterali crescono in condizioni fisiologiche nelle camere di imaging. ( A ) sviluppo della radice laterale di Arabidopsis in una camera di imaging (sinistra) e su una piastra (destra) per 25 ore (luce costante, incubazione orizzontale, imaging simultaneo). Barre di scala = 200 μm. ( B ) Parete che presenta lunghezze di radice laterale superiore a 27 h (misurate in intervalli di 1 h), delle radici laterali come mostrato in ( A ). individLe radici ual grigie (n = 23 per le piastre e le camere di imaging), lunghezza media come cerchi rossi. Barre di errore = 1 SD. La linea rossa è misura lineare attraverso lunghezze medie. ( C ) Trama che mostra il tasso di crescita medio per tutte le radici laterali di cui alla ( B ) relative alla loro lunghezza iniziale. ( D ) Proiezioni di intensità massima di stack confocali 3D acquisite da radici laterali che esprimono NPSN12-YFP e RFP-TUB6 in punti di tempo consecutivi. Inset: Ingrandimento della regione boxed. Frecce verdi: bande preprofase; Frecce bianche: mandrini mitotici; Frecce blu: phragmoplasts; Punte di freccia: peli di radice. ( E ) Proiezioni di intensità massima di immagini ad alta risoluzione acquisite da una giovane radice laterale della linea transgenica mostrata in ( D ) utilizzando un obiettivo 63X / 1.2 NA e un campionamento di Nyquist (dimensioni di pixel 77 nm x 77 nm) a 0 h e 16 h; Gli asterischi individuano le cellule identiche ad ogni punto temporale; La freccia indica una cella che si divide tra 0h e 16h.Barre di scala = 50 μm (AC); 20 μm (E). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Figura 3 : Lo sviluppo laterale a lungo termine delle camere di imaging. ( A ) Un diagramma che mostra la crescita media della radice assoluta in tre intervalli di 24 ore consecutive in camera di imaging rispetto alle piastre. Ns indica p&gt; 0,05; *** indica p &lt;0,001 (t-test dello studente). N = 33 (piastre) e n = 27 (camere di imaging). ( B ) Trama che mostra lunghezze di radice laterale a punti consecutivi su tutte le radici utilizzate in (A). Rosso: tutte le radici laterali con una lunghezza finale entro 1 SD della media di tutte le radici laterali coltivate su piastre (tra 927 e 3163 μm). ( C ) Massimo inProiezioni di densità di pile confocali rappresentative 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP in radici laterali, acquisite a punti consecutivi in ​​72 ore. Barre scala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Figura 4 : Le camere di imaging possono essere adattate per altri organi vegetali. ( A - C ) Adattamento della camera di imaging per le radici primarie. ( A ) Schema della progettazione della camera di imaging. Questo è identico al disegno standard ( figura 1 ) a parte due modifiche: la lastra media di MS contiene 0,8% agar invece di 1,5% agar e un film di cellulosa (rosso) è posto tra agar e pianta per prevenire la crescitaNell&#39;agar. ( B ) XY (top) e XZ (in basso) proiezioni di intensità massima di stack confocali rappresentativi 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP nella radice primaria di un piantone di 7 giorni, imaged a 0 h e 48 h in un normale imaging Camera. Si noti che la radice cresce nell&#39;agar a causa della sua risposta gravitropica. ( C ) XY (top) e XZ (in basso) delle proiezioni di intensità massima di pili confocali rappresentativi 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP nella radice primaria di un piantone di sette giorni imaged a 0 h e 48 h nell&#39;immagine Camera con pellicola di cellulosa. Prima dell&#39;applicazione, la pellicola di cellulosa è stata sterilizzata in etanolo al 80% e imbevuta di liquido ½ mezzo MS. Si noti che la crescita gravitropica della radice nell&#39;agar è impedita. ( D - F ) Adattamento della camera di imaging per ipocotili. ( D ) Schema che mostra la progettazione della camera di imaging ipocotile. Una guarnizione di gomma (grigio) di poli (dimetilsilossano) è manufactuRosso su uno scivolo della cavità tra due strisce di vetro (giallo). Una lastra di 1,5% agar di spessore uniforme (beige) è posta sullo scivolo, parzialmente raggiunta nella cavità. La camera è riempita con PFD (blu). Le piante vengono poste sulla lastra di agar, in modo che l&#39;ipocotile occupa la regione inclinata verso il basso della lastra di agar nella cavità mentre la radice è posizionata la parte orizzontale dell&#39;agar. La camera è chiusa con una copertura. ( E ) Proiezioni di intensità massima di pile confocali rappresentative del marker NPSN12-YFP della membrana plasmatica in un ipocotile di un piantina di due giorni, immaginato per 48 ore in punti consecutivi. ( F ) Crescita longitudinale in due intervalli di tempo consecutivi di singole cellule lungo l&#39;asse da basale a quello apicale (posizioni relative a 0 h lungo l&#39;asse indicato in E) dell&#39;ipocotile mostrato in ( E ). Si noti l&#39;ondata di crescita descritta in precedenza che migra nell&#39;ipocotile 16 . Barre scala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Movie 1: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a> <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Movie 2: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Movie 3: per <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">favore c</a>Lick qui per scaricare questo film.

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A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Presentata qui è una tecnica semplice per l&#39;imaging rapido a tempo determinato di elevata risoluzione di sviluppo radicale e ipocotile per un massimo di 3 giorni utilizzando elevati obiettivi di apertura numerica e perfluorodecalin come mezzo di immersione.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  University of Oxford.  Presentata qui è una tecnica semplice per l'imaging rapido a tempo determinato di elevata risoluzione di sviluppo radicale e ipocotile per un massimo di 3 giorni utilizzando elevati obiettivi di apertura numerica e perfluorodecalin come mezzo di immersione. 

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use products. Based on their chemical structure and estradiol-like biological properties, they have been classified as endocrine disrupting compounds (EDC). Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked to various health defects including cancer, behavioral disorders and infertility, with greater vulnerability indicated during early developmental periods. Cellular and molecular studies with the genetically tractable nematode model Caenorhabditis elegans have demonstrated that exposure to BPA causes apoptosis, embryonic lethality and disruption in the DNA repair mechanisms. We have previously reported that exposure of C. elegans embryos to low doses of different bisphenols decreases fecundity. In addition, we have shown that the effects of exposure during the very early stages of development persist into adulthood as assayed by quantifying habituation behavior, a form of non-associative learning. Here, we provide detailed protocols for embryonic exposure to low-dose EDCs as well as the associated fecundity and anterior touch habituation assays, along with representative results.

Exposure to environmental toxicants can acutely impact development with long-term effects. Detailed protocols are provided to illustrate a strategy using an effective lab model to study the effect of early embryonic exposure to bisphenol A. We provide fecundity and behavioral assays to monitor the effectiveness of our toxicant exposure bio-assays.

Conseguenze a lungo termine del comportamento e riproduttive di embrionale esposizione alle sostanze tossiche della basso-dose

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...