The authors acknowledge the help from the staff of Laboratory Animal Medicine, University of Nevada, Reno. MM received funding from Nevada INBRE.

Il protocollo (Number-00682) descritto qui di seguito è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) presso l&#39;Università del Nevada Reno e segue le linee guida della University of Nevada, animale comitato etico della ricerca di Reno. In breve, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano e un&#39;ogiva è stato utilizzato per mantenere livelli isoflurano continui per 20 min. Un unguento veterinario è stato usato per l&#39;essiccamento della occhi sotto anestesia. Toe pinch stata utilizzata per determinare il livello di anestesia e la frequenza respiratoria è stata misurata durante tutta la procedura. I topi sono stati tenuti in gabbie individuali e monitorati finché fu recuperato. I topi sono stati utilizzati una sola volta per l&#39;alimentazione zecche e sono stati sottoposti ad eutanasia recupero post tick. L&#39;eutanasia è stata realizzata dal Laboratorio di personale di staff animale medicina. CO 2 e dislocazione cervicale sono stati utilizzati per l&#39;eutanasia degli animali. NOTA: Lavorare su zecche richiede l&#39;uso di completa eq di protezione individualeAZIONE DEI DISPOSITIVI. Per il conteggio delle zecche immature, indossare cappotti di laboratorio bianco, guanti nitrilici lunghi per coprire l&#39;apertura del manicotto del cappotto di laboratorio con bande di gomma e scarpe chiuse. Per infestare i topi con le zecche, utilizzare una rete di capelli, tuta da lavoro usa e gonna, guanti a maniche lunghe sulle maniche e coprisedili. Utilizzate tute bianche o colorate per rilevare le zecche instabili. Controllare periodicamente i guanti e le maniche per le zecche. 1. Preparazione della sala per l&#39;alloggiamento degli animali <ol><li> Designare una stanza separata per ospitare i topi infestati da zecche. Posizionare una tappetino appiccicoso o un nastro di moquette su entrambi i lati dentro e fuori la porta per evitare fughe accidentali. </li></ol> 2. Conteggio delle zecche per l&#39;infestazione del mouse <ol><li> Inserire nastro a doppia faccia intorno ai bordi superiori di un contenitore di plastica da 7 &quot;x 5&quot; x 14 &quot;e riempire con acqua a circa 2 cm. </li><li> Inserire un&#39;altra piccola scatola o un piatto di Petri al centro del contenitore e riempi con acqua a 1 cm creando un &amp;# 34; fossero &quot;intorno a questo contenitore </li><li> Conservare il fiale contenente le larve o le ninfe all&#39;interno del piatto di Petri. </li><li> Utilizzare un pennello di vernice fine per rimuovere le larve o le ninfe dalla fiala e contare sotto il microscopio. Conta 50 larve o 25 nimfe in flaconi di scintillazione separati. Coprire immediatamente i flaconcini con lo strato di maglia nylon o organdy e chiudere con fasce di gomma. </li></ol> 3. Infestare i topi con le immature zecche <ol><li> Utilizzare una panca da lavoro bianco o leggera e bastone a nastro biadesivo lungo il perimetro dell&#39;area di lavoro. </li><li> Anestetizzare il mouse con isoflurano. Controllare il livello di anestesia con il pizzico della punta. Una volta anestetizzato, trasferire il mouse su un tappetino riscaldato rivestito di tovaglioli di carta e fissarlo a un cono di naso per la fornitura continua di isoflurano. </li><li> Applicare unguento a base di gelatina petrolifera per evitare la secchezza. Si noti il ​​pattern di respirazione del mouse per regolare i livelli di isoflurano (80 - 230 respiri per min è normale., Ridurre il livello di isoflurano in brIl tasso di eathing è inferiore a 80 breath per min per evitare l&#39;uccisione dell&#39;animale). </li><li> Prendete un fiale di 50 larve o 25 nimfe e posizionate le zecche sotto la pelliccia sulla testa tra le orecchie con un pennello ( figura 1 ). Tenere il mouse sotto l&#39;anestesia per 20 minuti dopo il posizionamento per dare tempo sufficiente per le zecche da attaccare. </li><li> Spostare il mouse su una gabbia usa e getta monouso tipo scatola in plastica con coperchi e biancheria bianca. Fornire giocattoli, acqua e cibo ad libitum come per la cura del mouse normale. </li><li> Conservare la gabbia del mouse all&#39;interno di una gabbia più grande di ratto o gerbil, rivestita di nastro adesivo su due lati intorno ai bordi superiori. Riempire la gabbia esterna con 3 cm di acqua ( Figura 2 ). </li></ol> 4. Raccolta di zecche dai topi <ol><li> I ticchetti immaturi si separano tra i giorni 3 e 6 dell&#39;alimentazione. Controllare ogni giorno dopo giorno le gabbie e il fossato d&#39;acqua per le zecche ingannate. </li><li> Raccogli le zecche distaccate dalla gabbia tra i giorni 4 e 6. Utilizzate un doloreT pennello o pinze morbide per raccogliere le zecche ingrassate e conservare in flaconi di scintillazione puliti con panno in maglia nylon fissati con bande di gomma. </li><li> Anestetizzare e controllare il mouse il giorno 7 per qualsiasi rimanente zecche allegate. </li><li> Controllare la biancheria da letto, l&#39;alimento e la bottiglia d&#39;acqua per le zecche ingannate il giorno 7. Eutanizzare i topi seguendo la procedura descritta in precedenza. Autoclave le gabbie usa e getta, la biancheria, la bottiglia d&#39;acqua e il cibo per evitare qualsiasi scompigliamento delle zecche senza peli. </li></ol> 5. Immagazzinamento delle zecche di Fed <ol><li> Mantenere le zecche ingrossate all&#39;umidità del 90%, 20 ° C, e una luce 12:12: il ciclo scuro in un incubatore di umidità e temperatura controllato fino a quando si verifica un molting. Ciò può richiedere circa 12 a 18 settimane. </li><li> Mentre l&#39;elevata umidità favorisce la sopravvivenza del bersaglio, rende anche i ticks suscettibili di sovrapposizione fungina. Controllare le zecche alimentate sotto il microscopio almeno una volta alla settimana per lo stampo. Se rilevato, lavare i sopravvissuti in etanolo al 70% per 5Min., Sciacquare in acqua, trasferire su un filtro da asciugare e trasferirlo in flaconi nuovi e puliti. </li></ol>

<ol>
	<li>Gleim, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+tick+bites+and+pathogen+prevalence+in+ticks+parasitizing+humans+in+Georgia,+USA.">Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA.</a> Parasites &amp;amp; Vectors. 9 (125), 1-13 (2016).</li><li>Krober, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Kuhnert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+of+Hard+Ticks+In+Vitro:+New+Perspectives+for+Rearing+and+for+the+Identification+of+Systemic+Acaricides.">Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides.</a> ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).</li><li>Voigt, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+of+instars+of+the+ixodid+tick+Amblyomma+variegaturn+on+skin+membranes+and+its+application+to+the+transmission+of+Theileria+mutans+and+Cowdria+ruminantium.">In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium.</a> Parasitol. 107, 257-263 (1993).</li><li>Gregson, J. D., Smith, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ticks.">Ticks.</a> Insect Colonization and Mass Production. , 49-72 (1966).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. 2, (1993).</li><li>Bouchard, K. R., Wikel, S. K., Marquaedt, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Care,+maintenance,+and+experimental+infestation+of+ticks+in+the+laboratory+setting.">Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting.</a> Biology of Disease Vectors. , 705-711 (2005).</li><li>Schumaker, T. S., Barros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+Ornithodoros+(Alectorobius)+talaje.+(Acari:Argasidae)+in+laboratory.">Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory.</a> J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).</li><li>Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+life+cycle+of+Ixodes+woodi+(Acari:Ixodidae).">Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae).</a> J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).</li><li>James, A. M., Oliver, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+and+host+preference+of+immature+Ixodes+dammini,I.scapularis,and+I.pacificus.(Acari:Ixodidae).">Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae).</a> J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Passi critici all&#39;interno del protocollo È importante avere diversi livelli di misure di sicurezza durante l&#39;allevamento delle zecche per evitare fuga accidentale. L&#39;uso di nastro adesivo e fossato d&#39;acqua sono fondamentali per garantire la sicurezza. È importante mantenere il mouse anestetizzato su un tappetino per mantenere costante la temperatura corporea. Abbiamo anche scoperto che la rasatura del mouse non fornisce alcun vantaggio in più per l&#39;attaccatura del tick. Un singolo topo può essere tenuto nella stessa gabbia per una settimana in una &quot;stanza del tick&quot; designata che limita ulteriormente il contatto di zecche con il personale. Modifiche e risoluzione dei problemi La produzione di zecche coltivate in laboratorio di elevata qualità è necessaria per studi sulla biologia delle zecche e sulle interazioni tra agenti tick-pathogen. I precedenti protocolli di alimentazione hanno utilizzato un pavimento a filo sospeso 8 o gabbie cilindriche per mantenere i topi immobile 6 , 10 che incorrere costo aggiuntivo così come lo stress per l&#39;animale. Inoltre, la gabbietta sospesa permette zecche gonfio a cadere attraverso il filo in acqua contaminata da urina e feci di topo, aumentando così il rischio di crescita di muffe. LIMITI DELLA TECNICA Come mostrato nei dati, abbiamo recuperato con successo in media 65% (fino al 92%) delle zecche. Occasionalmente trovato zecche in fossato acqua al di fuori della gabbia del mouse, ma nessuno riuscì a fuggire. Il nastro adesivo sulle pareti esterne del secondo contenitore impedito zecche fuoriuscita. Importanza della tecnica in materia d &#39;esistenti / metodi alternativi Il nostro protocollo di usare scarpa box stile gabbie topi monouso permette gamma libera di movimento e dimostra che i topi non hanno bisogno di essere trattenuto per consentire l&#39;alimentazione tick. La maggior parte zecche fed erano facilmente osservati e raccolti dalle pareti della gabbia trasparenti e le rimanenti zecche sono facilmenterilevata tra assestamento al termine del ciclo di alimentazione. Questo protocollo non richiede alcuna gabbia del mouse personalizzato, quindi, è conveniente. Letteratura suggerisce che meno del 50% delle zecche allegare to topo e non tutte zecche attaccate alimentano al completamento. In media, abbiamo raccolto ~ 60% zecche larvali gonfio. Non abbiamo trovato alcun sfuggito zecche digiuni o alimentati. Di tanto in tanto abbiamo trovato uno o due tick larvali engorged in fossato d&#39;acqua, ma nessuno sul nastro adesivo. I nostri risultati suggeriscono che non tutte le zecche si attaccano per l&#39;host e possono morire senza alimentazione. Digiuni, zecche morti erano difficili da trovare nella lettiera. Di tanto in tanto, abbiamo anche trovato macchie di sangue sul letto bianco che suggerisce che sia il mouse aver ucciso il segno di spunta engorged dopo aver lasciato spento o graffiato. I nostri dati e l&#39;osservazione giornaliera di gabbie suggeriscono che gonfio zecche o salire sulle pareti della gabbia e la parte superiore della gabbia o nascondere sotto la biancheria da letto lontano dalla portata del mouse. Pertanto, la gabbia chiusa non hanno uny impatto negativo sulla sopravvivenza tick. Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica Il nostro protocollo fornisce un&#39;alternativa semplificata per l&#39;allevamento di massa di zecche, senza aggiunta di costi extra o ridurre la sicurezza degli movimentazione degli animali del personale. Sperimentazione futuro si concentrerà sul miglioramento dei metodi di alimentazione degli adulti I. scapularis.

Le zecche sono obbligati ectoparassiti ematofagi dei vertebrati e sono distribuiti in tutto il mondo. Negli Stati Uniti, almeno 11 specie di zecche sono vettori di agenti patogeni di importanza per la salute pubblica 1. Ixodes scapularis è responsabile per la trasmissione di diversi agenti patogeni come gli agenti causali della malattia di Lyme (Borrelia burgdorferi) febbre ricorrente (B. miyamotoi), anaplasmosi granulocitica umana (Anaplasma phagocytophilum), e babesiosi (Babesia spp.). Nonostante l&#39;importanza di I. scapularis come vettori di malattie, la raccolta di questi aracnidi in abbondanza in natura per gli studi in laboratorio non è sempre fattibile. Pertanto, la produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni. Il ciclo di vita di tutte le zecche dure (famiglia Ixodidae), tra cui I. scapularis, è costituito da l&#39;uovo e tre activE stadi: larva, ninfa e adulti. Ogni fase attiva viene alimentata da un host vertebrato. Le complesse interazioni che si verificano tra zecche e loro ospiti durante diversi giorni di attacco e di alimentazione sono quasi impossibili da replicare usando mangimi artificiali e sono improbabili che forniscono un numero sufficiente di zecche alimentate per l&#39;allevamento di massa 2 , 3 , 4 . Pertanto, i topi e conigli vivi vengono utilizzati più frequentemente come host per l&#39;allevamento di immaturi (larve e ninfe), e fasi mature (adulti) di zecche, rispettivamente. Il requisito di ospedali multipli per l&#39;alimentazione del sangue durante ogni fase di sviluppo complica l&#39;allattamento dei ticchetti e è tempo e costi intensivi 5 , 6 , 7 . La maggior parte dei protocolli per l&#39;allevamento del ticchettio richiede la conservazione dei topi in una gabbia a pavimento griglia metallica sospesa 7 , 8 o in un cilindro caGe di tali dimensioni che l&#39;animale non può muoversi liberamente e lo sposo stesso 6 , 9 , 10 . Queste gabbie cilindriche vengono successivamente trasferite in una gabbia di scarpiere con una griglia metallica. Quindi vengono raccolti le zecche ad anello incastrate e smontate. Tuttavia, questo metodo consente di esporre le zecche alimentate ad acqua contaminata da urine e feci che possono aumentare la crescita delle funghi e la mortalità dei segni. Inoltre, aumenta la possibilità di fuggire dal bacino dell&#39;acqua, oltre che causare stress ai topi. Per aggirare questi problemi, qui dimostriamo che la tambura di larvale è alimentata su topi all&#39;interno di gabbie monouso di tipo plastic shoebox. Questo metodo consente il normale comportamento dei topi, aumenta il recupero ingorgo del ticchettio e diminuisce la mortalità dei segni a causa della contaminazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puralube vet ointment</td>
			<td style="width:207px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:323px;">Available from any Pet store or online store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable mouse cage</td>
			<td>&#160;Innovive, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>MV 2</td>
			<td>Set of bottom and lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">White Alpha dri bedding&#160;</td>
			<td>Lab Supply, Fort Worth, TX</td>
			<td>&#160;ALPHA-Dri&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing ixodes scapularis, the black-legged tick: feeding immature stages on mice

Ixodes scapularis , il vettore della malattia di Lyme, è uno dei più importanti vettori delle malattie negli Stati Uniti orientali e mediorientali. Questa specie è un trifoglio host che richiede un pasto di sangue da un ospite vertebrato per ogni fase di sviluppo e le femmine adulte richiedono un pasto di sangue per la riproduzione. Le zecche di larve si attaccano al loro ospite per 3 - 5 giorni per l&#39;alimentazione e scendono l&#39;ospite quando sono completamente ingolfati. Questa dipendenza da diversi host differenti e il lungo periodo di attacco per l&#39;ingranaggio complicano l&#39;allestimento del ticchettio nell&#39;ambiente di laboratorio. Tuttavia, per comprendere la biologia dei tick e le interazioni tra tick-pathogen, la produzione di zecche sane e testate da laboratorio è essenziale. Qui dimostriamo un semplice e conveniente protocollo per l&#39;immatura del tick in mouse sui topi. Abbiamo modificato i protocolli esistenti per diminuire lo stress sui topi e aumentare il successo e la sopravvivenza di alimentazione dei ticchetti usando gabbie monouso senza fondi a maglie per evitare il contatto di ticks wiAcqua contaminata con urine e feci di topi.

Abbiamo modificato i protocolli 6 , 10 per l&#39;allevamento dei tick , per migliorare l&#39;efficienza di alimentazione e ridurre lo stress sull&#39;host del mouse. I risultati dimostrano che le gabbie di mouse standard in stile shoebox sono adatte per l&#39;allevamento dei ticchetti. La biancheria bianca forniva un buon contrasto per una facile raccolta di zecche alimentate. La maggior parte delle zecche si sono arrampicate sulle pareti dei contenitori dopo l&#39;alimentazione e sono state facilmente raccolte. Inoltre, il coperchio stretto delle scatole di plastica monouso (usato normalmente per i topi alloggiati a UNR) ha impedito la fuga di tastatura dalla scatola. Inoltre, non abbiamo rasato i topi per l&#39;infestazione dei ticchetti ( Figura 1 ). Questi cambiamenti nei protocolli pubblicati hanno provocato un significativo attaccamento dei tick, l&#39;ingranaggio e la sopravvivenza. Questo protocollo è conveniente in quanto non richiede alcuna gabbia di mouse speciale al di fuori di quelle legatey in uso. E &#39;anche meno laborioso perché non abbiamo avuto bisogno di raccogliere le zecche gonfio ogni giorno. Abbiamo raccolto le zecche tra i giorni 4 e 6 infestazioni postali. La maggior parte delle zecche staccati dal giorno 4 e pochi quelli rimasti staccati dal giorno 5. Di giorno 7 tutti i topi erano liberi di zecche. Siamo stati in grado di recuperare una media del 67% (range 52-92%) Engorged zecche larvali (Tabella 1). Tutti i topi erano sani e non hanno mostrato alcun segno di disagio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55286/55286fig1.jpg" /> Figura 1: alimentazione Ixodes scapularis larve su topi. I topi sono stati infestati singolarmente con 50 zecche larvali. Le zecche gonfie lasciati il ​​mouse tra i giorni 4 - 6. Le gabbie sono stati controllati per i restanti zecche il giorno 7 e scartati in seguito. A: infestano i topi con le zecche larvali digiuni. B: Un segno di spunta larvale fissaggio all&#39;orecchio di un topo. C: UnLancetta di labbro ingradita attaccata all&#39;orecchio di un topo, 3 giorni dopo infestazione. D: Unfed e larve di tick tick completamente. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55286/55286fig2.jpg" /> Figura 2: La gabbia del mouse è impostata per l&#39;infestazione Tick. Due gabbie a gettoni monouso erano tenute all&#39;interno di una gabbia gerbil. Circa 3 cm. L&#39;acqua è stata aggiunta alla gabbia gerbil per fare un fossato. Il nastro adesivo a doppia faccia è stato apposto intorno ai bordi superiori della gabbia gerbil per evitare la fuga di ticchettio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Animale (mouse) </td><td> Il numero totale di zecche di larve recuperato </td><td> Le zecche di larve in percentuale recuperate </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 34 </td><td> 68% </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 64% </td></tr><tr><td>3 </td><td> 38 </td><td> 76% </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 28 </td><td> 56% </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 39 </td><td> 78% </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 26 </td><td> 52% </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 46 </td><td> 92% </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 29 </td><td> 58% </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 29 </td><td> 58% </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 33 </td><td> 66% </td></tr><tr><td> MEDIA </td><td></td><td> 66,8% </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Numero di Ixodes scapularis Larvae recuperate dopo l&#39;infestazione da laboratorio sugli anestetizzati Mouse Hosts. Ogni mouse è stato infestato da 50 larve.

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Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

La produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni. Qui mostriamo un semplice protocollo per l&#39;alimentazione tick immaturo che è costo-efficace e meno stressante per i topi.

impennata<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Il Tick Black-legged: Alimentazione stadi immaturi sui topi

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

rearing-ixodes-scapularis-black-legged-tick-feeding-immature-stages

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

11.9K Views.  University of Nevada, Reno.  La produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni. Qui mostriamo un semplice protocollo per l'alimentazione tick immaturo che è costo-efficace e meno stressante per i topi. 

Video: Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All&#39;interno della Gut Tick

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Saliva, le ghiandole salivari, e Collection emolinfa dalle zecche Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

Allevamento e iniezione di<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Le larve per valutare virulenza batterica

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Alimentazione di zecche su animali per trasmissione e Xenodiagnosis a Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Misurare Anafilassi locali nei topi

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Sviluppo di un virus System Reporter dell&#39;epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

impennata

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Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All'interno della Gut Tick

Saliva, le ghiandole salivari, e Collection emolinfa dalle zecche Ixodes scapularis

Allevamento e iniezione di

Alimentazione di zecche su animali per trasmissione e Xenodiagnosis a Lyme Disease Research

Misurare Anafilassi locali nei topi

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Sviluppo di un virus System Reporter dell'epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing