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Questo documento descrive un metodo per generare da monociti moDCs immaturi, moDCs tolerogeniche e moDCs maturi. I passi importanti in questo protocollo sono discussi in dettaglio nei paragrafi successivi. È importante notare che il sangue periferico umano è utilizzato come materiale di partenza in questo protocollo e le precauzioni universali per la manipolazione del sangue umano dovrebbe essere praticata. Anche se è tecnicamente possibile ricavare DC dal midollo osseo nell&#39;uomo 24, in vitro DC differenziazione da cellule presenti nel sangue periferico è preferito a causa della disponibilità di sangue periferico rispetto al midollo osseo. Tra le cellule che si trovano nel sangue periferico, cellule e monociti CD34 + staminali ematopoietiche sono comunemente utilizzati per la generazione in vitro delle cellule dendritiche. CD34 + ematopoietiche cellule staminali sono coltivate con GM-CSF e TNF-α per derivare sottoinsiemi CD1a + e CD14 +, che vengono poi ulteriormente differenziate in Langerhanscome le cellule e cellule dendritiche. Viceversa, monociti sono coltivate in GM-CSF e IL-4 per generare moDCs immaturi. Diversi protocolli sono utilizzati per l&#39;arricchimento dei monociti da sangue periferico; per esempio, con l&#39;adesione a piatti di plastica, elutriation e kit di isolamento 25, 26 I vantaggi del protocollo aderenza sono minimo danno alle cellule e relativamente redditizio tuttavia cella purezza potrebbe essere compromessa.; e un passaggio aggiuntivo è necessaria per staccare le cellule per ulteriori esperimenti. Elutriation è una tecnica che separa le cellule in base alla loro dimensione e la densità. I vantaggi di elutriation sono vitalità cellulare e monociti possono essere usati facilmente per ulteriori esperimenti; Tuttavia questa tecnica è limitata dalla disponibilità di un elutriatore e l&#39;impossibilità di separare differenti popolazioni di cellule (cellule T e monociti) con parametri sedimentazione simili. In commercio kit di isolamento disponibili utilizzano microsfere magnetiche per selezionare sia positivo oselezionare negativamente la popolazione monocitica. Alcuni protocolli sono prevenuto verso l&#39;isolamento dei monociti utilizzando la selezione negativa come i monociti isolati restano &quot;intatti&quot; (non è vincolata da marcatori o microsfere). In questo protocollo, perline CD14 positivi sono stati usati per selezionare i monociti umani da PBMC. CD14 manca di un dominio citoplasmatico e vincolante di anticorpi CD14 non attiva la trasduzione del segnale. Inoltre, le microsfere si staccano dai monociti dopo coltura e quindi non ostacolare il processo di differenziazione. Inoltre, CD14 è fortemente espresso sulla maggior monociti e debolmente sui neutrofili e alcune cellule dendritiche mieloidi, quindi questo metodo di isolamento risultati in maggiore purezza cella rispetto agli altri metodi 17. monociti del sangue possono essere differenziati in DC o macrofagi e il destino dei monociti dipende in gran parte l&#39;ambiente di citochine. In questo lavoro, moDCs sono generati con l&#39;aggiunta di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) E interleuchina 4 (IL-4) per monociti del sangue periferico umano. GM-CSF è necessaria per la sopravvivenza monociti e IL-4 esercita un&#39;attività inibitoria sulla differenziazione dei macrofagi; e la combinatoria aggiunta di GM-SCSF e IL-4 per monociti cedere una maggiore percentuale di moDCs immaturi rispetto al citochina individuale 27. Ci sono altri protocolli che generano moDCs aggiungendo fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), interferone alfa (IFN-α) e Interleuchina 13 (IL-13) di monociti del sangue periferico 28, 29, 30. La combinazione di GM-CSF e IL-4 è stato ottimizzato nel 1990 e ora un protocollo riconosciuto che genera DC immature plastica differenziate in moDCs immunogenico o tolerogeniche e polarizzate in Th1, Th2 o Th17 moDCs promuovono. moDCs immaturi vengono differenziate in moDCs tolerogeniche con l&#39;aggiunta di vitamina D3 e desametasone. Ci sono diversi protocolli per generare cellule dendritiche tolerogeniche per esempio, tramitefattore-kappa B nucleare (NF-kB) inibizione, l&#39;attivazione β-catenina, vitamina D3, desametasone e Rapamicina 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Sebbene sia la vitamina D3 e desametasone da solo sono stati segnalati per indurre un effetto tollerogenico sulle DC, la combinazione di vitamina D3 e desametasone risultato in una maggiore soppressione di alloproliferation rispetto a quando si utilizzano singoli farmaci. Pertanto, il protocollo esistente per la generazione di tollerogenica DC è stato modificato per una combinazione di vitamina D3 e desametasone. Questo metodo è attualmente in fase accettata come modello per DC tolerogeniche umani con un programma di utilità terapeutica. E &#39;anche importante notare che la vitamina D3 ricostituito e desametasone hanno una breve durata. In questo protocollo, Lipopolisaccaridi (LPS) è stata aggiunta come un induttore di maturazione DC. moDCs immaturi possono anche essere indotti a maturazione con cocktail pro-infiammatoria:(TNF-α), interleuchina 1 beta (IL-1β), interleuchina 6 (IL-6) e prostaglandina E2) o citochine pro-infiammatorie (TNF-alfa e interferone gamma (IFN-Γ)). Cocktail pro-infiammatorio genera moDCs maturi con funzioni di alta co-stimolazione e migratori ma producono livelli relativamente bassi di IL-12 38. TNF-α o IFN-Γ da solo non è in grado di indurre un fenotipo stabile dendritica 39. LPS stimola Toll-like receptor 4 (TLR4), media l&#39;attivazione di NF-kB e mitogeno activated protein chinasi (MAPK) per indurre la maturazione DC. DC maturazione indotta da LPS mostra un up-regulation di marcatori di maturazione DC (CD83, CD86, HLA-DR) e ha portato alla produzione di IL-12p70. Inoltre, questo passo può essere ulteriormente modificato per accoppiare LPS con agonisti TLR3 per produrre cellule dendritiche mature per cancro vaccini clinici. In questo lavoro, DC tolerogeniche sono dimostrato di essere resistente a maturazione in seguito al trattamento con LPS. Questi semi maturi come DC non sono immunogenica e non lo fanno ReleaSE citochine pro-infiammatorie 40. Le limitazioni di questo protocollo trovano nel processo di differenziazione. Il processo richiede 8 giorni dal giorno 0 al 7 ° giorno che pone una difficoltà per essere adattato in analisi di un elevato throughput. Una modifica nel protocollo è necessario per abbreviare il processo di differenziazione ancora produrre un elevato numero di cellule dendritiche vitali nei diversi stati. In secondo luogo, le cellule dendritiche sono generati mediante aggiunta di citochine in questo protocollo e queste citochine non sostengono popolazione DC per un lungo periodo di tempo. Inoltre, citochine sono usati in concentrazioni molto superiore in vivo e potrebbero causare lo sviluppo di parte di percorsi che non sono fisiologicamente identica a DC in vivo. Per esempio in colture in vitro di precursori DC hanno dimostrato di rispondere al GM-CSF, che non è una citochina essenziale per la normale differenziazione DC in vivo 41. Tuttavia, la stimolazione citochina può essere un metodo utile per geneAlto tasso di numero di DC in vitro per la sperimentazione. La possibilità di sottoporre queste cellule generate da questo protocollo per altre analisi, come immunofluorescenza, citometria a flusso, ALLO studi di reazione e studi metabolici aumenta l&#39;utilità di questo metodo. Queste cellule dendritiche in vitro servire come un buon modello per migliorare la conoscenza dello sviluppo DC, la maturazione e la presentazione dell&#39;antigene, che è in precedenza difficile da fare con rari numeri di DC in vivo. Capacità DC &#39;di regolare l&#39;immunità immunologica contro la tolleranza li rende i candidati attraenti in terapie contro il cancro e le malattie autoimmuni 42, 43, 44, 45. DC immunogeniche generati in questo protocollo può essere utilizzato per migliorare l&#39;efficacia della vaccinazione contro le malattie infettive e tumori; mentre DC tolerogeniche possono essere utilizzati per controllare le risposte delle cellule T indesiderati e prevenire il rigetto in seguito a trapianto. l&#39;intricataequilibrio tra immunità e tolleranza dipende dallo stato immensamente differenziazione DC. differenziazione DC è un programma coordinato cellulare che è governato da molteplici vie di segnalazione e destino metabolico. Diversi stati di differenziazione di DC si differenziano per le esigenze bioenergetica e biosintesi; per esempio, DC attivate richiedono adattamenti metabolici più energici importanti per la sopravvivenza e la migrazione rispetto ai PVS in stato di riposo. E &#39;importante notare che la vitamina D3, desametasone e rapamicina sono noti per la loro capacità di indurre DC tolerogeniche, sono stati descritti per influenzare il metabolismo DC. In questo lavoro, il metabolismo energetico del moDCs provenienti da diversi stati di differenziazione sono stati caratterizzati utilizzando gli analizzatori di flusso extracellulari e moDCs tolerogeniche esposto il più alto di maturazione metabolica plasticità e LPS-indotta è diminuita questa plasticità. Metabolismo anabolizzanti supporta DC maturazione mentre catabolici influenze metabolismo tollerogenico DC funziona 46. DCSgenerato da questo protocollo può essere utilizzato per valutare se modificare lo stato metabolico delle cellule dendritiche tenere premuto il tasto per modificare l&#39;immunità e la tolleranza nelle terapie. In conclusione, abbiamo presentato un protocollo per la generazione di immaturi, tollerogenico e moDCs maturi fondamentale per lo studio delle funzioni immunomodulanti PVS.

DC è stato descritto da Paul Langerhans (cellule di Langerhans) alla fine del XIX secolo come riferimento da Jolles 1 e caratterizzato da Ralph Steinman e Zanvil Cohn nel 1973 che li ha riconosciuti come cellule presentanti l&#39;antigene professionali 2. DC si trovano nel sangue periferico e nel maggior parte dei tessuti del corpo, particolarmente abbondante nei tessuti che sono esposti all&#39;ambiente esterno come la pelle (presente come cellule di Langerhans) e nei rivestimenti del naso, polmoni, stomaco e dell&#39;intestino che consentono loro di incontrare gli antigeni estrinseci. Immaturo DC dispone di funzionalità endocitico ma relativamente bassa capacità di stimolare le cellule T 3. Immaturo DC esprimono vari recettori pattern recognition (PRR) che cattura i modelli associati ai patogeni molecolari (PAMPs) o modelli molecolari di danno-associato (smorza) 4. Attivazione segnali di pericolo di auto maturazione verso DC immunogenico mentre auto-molecole determinano unresponsivene cellule Tss e apoptosi 5. DC immunogenici si caratterizzano per l&#39;up-regolazione delle molecole MHC e molecole di superficie co-stimolazione e la loro capacità di cellule T naive primi 6,7. Immaturo DC può anche essere maturato verso uno stato Treg che inducono o tollerogenico in risposta alla vitamina D3 metabolita 1a, 25 (O) 2 D 3 e di alcuni agenti immunosoppressori come l&#39;interleuchina-10 (IL-10), desametasone e rapamicina 8-9. DC tollerogenico si caratterizzano per la loro espressione di motivi basati su inibitori della tirosin-immunoreceptor (ITIMs) contenenti recettori di superficie e leganti. Trasduzione del segnale di ITIMs contenenti familiari ILT, ILT3 e ILT4 nei PVS tolerogeniche inibire alloproliferation e guidare l&#39;espansione Foxp3 + Treg 10,11. Queste proprietà uniche di DC tolerogeniche portano alla loro profonda potenza in vivo, cioè la capacità di indurre la tolleranza durevole per innesti allogenici trapiantati e supprEss lo sviluppo di malattie autoimmuni. Tollerogenico DC può essere visto quindi come un sottotipo di cellule dendritiche mature polarizzato che funzionano nella inibizione di attivazione immunitaria. Attualmente, ci sono due sottoinsiemi generali di cellule dendritiche in sangue periferico umano: le DC plasmacitoidi e mieloidi DC 12. DC circolanti sono rari costituendo a meno del 2% dei leucociti nel sangue umano e questo pone una difficoltà per l&#39;isolamento di un numero adeguato di DC per studiare le loro funzioni immunomodulanti. Per superare questo problema, monociti differenziati DC sono utilizzati come un modello in vitro per lo studio della funzione delle cellule dendritiche. Queste cellule dendritiche in vitro hanno recettori e funzioni simili rispetto a DC in vivo. Confronto dettagliato dei PVS in vivo e in vitro monociti derivati ​​da cellule dendritiche generate (moDCs) sono indagato da altri laboratori 13, 14, 15. Si segnala inoltre che moDCs e CD1c + DC erano equivalenti a presentanti l&#39;antigene e inducendo la funzione delle cellule T 15. In questo articolo, si descrive un metodo per generare moDCs immaturi da monociti del sangue periferico e poi differenziarsi in cellule dendritiche immunogenico e tolerogeniche. Queste cellule dendritiche derivate da monociti (moDCs) sono caratterizzate da marcatori di superficie, il profilo di citochine, le funzioni immunomodulanti e stati metabolici. cellule dendritiche immunogenico e tolerogeniche producono diverse citochine che provocano l&#39;espansione di entrambi cellule T allogeniche o cellule T regolatorie. In questo lavoro, citochina profilatura viene eseguita con sistemi che utilizzano la tecnologia multiplex. terreno di coltura di cellule vengono incubate con codice colore perline anticorpo immobilizzato e leggere in un analizzatore compatto. stati metabolici di DC vengono analizzati utilizzando gli analizzatori di flusso extracellulari che misurano tasso di consumo di ossigeno, un indicatore della respirazione cellulare, e il tasso di acidificazione extracellulare che riflette glycolyticflusso in cellule dendritiche. La misurazione di questi tassi di bioenergetica fornisce un mezzo per monitorare i cambiamenti nel metabolismo cellulare, che sono di vitale importanza per lo sviluppo delle cellule dendritiche e la funzione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius stedim biotech</td>
			<td>17597</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs kit</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070103</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate 
			Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11140-040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15575</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2915</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l2755</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated HLADR&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD83&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556855</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD14&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-242</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated BDCA3&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-090-514</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated ILT3&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5139-73</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PerCP- conjugated Mab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400250</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PE- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			APC- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>BD LSR II&#160;</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytofix/cytoperm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/CY7-conjugated CD25</td>
			<td>BD pharmingen</td>
			<td>557753</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/CY7-conjugated CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300512</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300428</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliplex MAP Human 
			Cytokine/Chemokine 
			magnetic bead panel</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HCYTOMAG-60K</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Sheath Fluid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SHEATHFLUID</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXMAP 3D system with xPONENT software</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>FLEXMAP 3D</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9082</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay Medium (OCR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102352-000</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Base Medium (ECAR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000&#160;</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Cell Mito Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Glycolysis Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103020-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes

i risultati di risposta immune da una complessa interazione tra il sistema immunitario innato antigene non specifici e l&#39;antigene specifico sistema immunitario adattativo. Il sistema immunitario è un equilibrio costante nel mantenere la tolleranza di auto-molecole e reagire rapidamente agli agenti patogeni. Le cellule dendritiche (DC) sono potenti cellule professionali presentanti l&#39;antigene che collegano il sistema immunitario innato per il sistema immunitario adattativo e bilanciano la risposta adattativa tra sé e non sé. A seconda dei segnali di maturazione, le cellule dendritiche immature possono essere selettivamente stimolati a differenziarsi in cellule dendritiche immunogenico o tolerogeniche. cellule dendritiche immunogenico forniscono segnali di proliferazione di cellule T antigene-specifiche per l&#39;espansione clonale; mentre le cellule dendritiche tolerogeniche regolano tolleranza antigene-specifica delezione di cellule T o l&#39;espansione clonale delle cellule T regolatorie. A causa di questa proprietà unica, le cellule dendritiche sono molto richiesti come agenti terapeutici per il cancro e dise autoimmuniAS. Le cellule dendritiche possono essere caricati con antigeni specifici in vitro e iniettate nel corpo umano per montare una risposta immunitaria specifica sia immunogenica e tollerogenica. Questo lavoro presenta un mezzo per generare in vitro da monociti, cellule dendritiche monociti immaturo derivati ​​(moDCs), tollerogenico e moDCs maturi che si differenziano per l&#39;espressione marcatore di superficie, la funzione e fenotipi metabolici.

Monociti Purificazione e dendritiche cellule differenziazione I monociti sono stati purificati da PBMC dalla densità centrifugazione del sangue periferico (Figura 1A), seguita da CD14 + selezione positiva separazione magnetica (Figura 1B) e coltivate in terreno completo in presenza di GM-CSF e IL-4 per ottenere cellule dendritiche immature ( Figura 2A). L&#39;aggiunta di vitamina D3 e desametasone alberino GM-CSF e IL-4 portato alla differenziazione delle moDCs immaturi in moDCs tolerogeniche (Figura 2B). LPS è stato aggiunto per indurre la maturazione di moDCs immaturi per maturare moDCs (Figura 2C) e moDCs tolerogeniche sono state stimolate con LPS per verificare la resistenza alla maturazione (Figura 2D). I campioni di sangue utilizzati in questo lavoro sono stati ottenuti da donatori sani con precedente informaticonsenso. MODC Caratterizzazione Surface Marker Caratterizzazione mediante citometria a flusso L&#39;analisi dei marcatori di superficie DC ha mostrato che moDCs mature esprimono i più alti livelli di markers di maturazione HLA-DR, CD83 e CD86 rispetto al moDCs tolerogeniche LPS-trattati, moDCs tolerogeniche e moDCs immaturi (Figura 3). Questi risultati hanno dimostrato che moDCs tolerogeniche erano resistenti alla maturazione rispetto ai moDCs immaturi seguenti stimolazione LPS. Inoltre, LPS-trattato moDCs tolerogeniche e moDCs tolerogeniche visualizzata aumentata espressione di CD14, BDCA3 (CD141) e immunoglobulina simile trascrizione (ILT) 3 rispetto al moDCs immaturi e maturi. Le moDCs tolerogeniche che abbiamo generato qui è coerente con precedenti relazioni 23. Caratterizzazione funzionale di moDCs moDCs indotte per la maturazione diventano immunogenico e rilasciano citochine che favoriscono la proliferazione di cellule CD4 + T-cellule. Abbiamo valutato l&#39;immunogenicità dei diversi sottotipi MODC misurando la proliferazione delle cellule T co-coltura. MoDCs tollerogenico erano scarsamente immunogenico rispetto al moDCs maturi, come mostrato da un basso alloproliferation di CD4 + T-cellule (Figura 4A). MoDCs tollerogenico si caratterizzano per il loro basso IFN-Γ, basso IL-12p40, e di alta IL-10 la produzione di citochine in alloreaction co-colture con CD4 + T-cellule (Figura 4B). Inoltre, allospecific aumento del numero di moDCs tolerogeniche in co-culture di moDCs maturi indotta CD4 + T-cellule aumentato la frequenza di alta Foxp3 + cellule T regolatorie CD25 (Figura 4C). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Analisi delle attività mitocondriale Red CMXRos viene utilizzato per riflettere l&#39;attività mitocondriale di analizzare i mitocondriale potenziali livelli di membrana in moDCs. Sono stati osservati moDCs tollerogenico di avere una maggiore attività mitocondriale rispetto agli altri sottotipi MODC differenziati (Figura 5A). Successivamente, il tasso di consumo di ossigeno mitocondriale (OCR) è valutata per i diversi sottotipi MODC utilizzando un Bioanalyzer. misurazioni OCR permettono intuizioni ad alta risoluzione al profilo metabolico, che fornisce informazioni incluso ma non limitato alla respirazione basale, la capacità respiratoria di riserva, perdita di protone e la respirazione non mitocondriale. La misurazione di OCR fornisce un mezzo per valutare la capacità delle cellule di rispondere allo stress. Le cellule sono metabolicamente perturbati mediante l&#39;aggiunta di tre diversi composti in successione. La prima iniezione è Oligomycin (ATP accoppiatore), che inibisce complesso V della catena di trasporto degli elettroni (ETC), inibendo la sintesi di ATP. Questo passaggio distingue la percentuale di ossigeno consumato per la sintesi di ATP e la percentuale di ossigeno consumato per superare protoni perdita attraverso la membrana mitocondriale interna. La seconda iniezione è FCCP (ETC acceleratore) che interrompe la sintesi di ATP trasportando ioni idrogeno attraverso la membrana mitocondriale anziché attraverso il canale protone V. Complesso Il crollo del potenziale di membrana mitocondriale porta ad un rapido consumo di energia e ossigeno, senza generazione di ATP. trattamento FCCP può essere usato per calcolare la capacità respiratoria di riserva di cellule. Mantenimento della capacità respiratoria di riserva in condizioni di stress è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. Questa capacità è determinata da diversi fattori, compresa la disponibilità di substrato e capacità funzionale degli enzimi coinvolti nella ECC La terza iniezione è una combinazione di Rotenone, un Complex I Inhibitor, e Antimicina A, un complesso III inibitore. Questa combinazione spegne respirazione mitocondriale e OCR è osservato a diminuire a causa della ridotta funzione mitocondriale (Figura 5C). MoDCs tollerogenico visualizzati più alti livelli basali di OCR moDCs maturi (Figura 5D). Inoltre, tollerogenico, LPS-tollerogenico e moDCs immaturi ha mostrato un aumento della capacità respiratoria di riserva rispetto a moDCs maturi (Figura 5e). Caratterizzazione metabolica di moDCs Poiché l&#39;acido lattico e protoni vengono rilasciati dalle cellule durante glicolisi, abbiamo analizzato l&#39;attività glicolitica di moDCs mediante un&#39;analisi in tempo reale della velocità di acidificazione extracellulare (ECAR) (Figura 6B). In presenza di glucosio, la glicolisi di tutti moDCs aumentata rispetto alla fase basale, conmoDCs maturi che presentano il più alto tasso di glicolisi moDCs immature (Figura 6D). Tollerogenico e moDCs immaturi esposte superiore glicolisi massima (indotta da oligomicina in presenza di glucosio) rispetto a moDCs LPS-trattati (Figura 6b). La capacità glicolitica di moDCs tolerogeniche e immaturi era superiore moDCs maturi (Figura 6 sexies). In contrasto con il loro alto tasso di glicolisi, riserva glicolitico è stato il più basso in moDCs maturi (Figura 6F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> Figura 1:. Purificazione monociti del sangue periferico (A) 25 ml di sangue è attentamente stratificato su 15 ml di Ficoll per tubo da 50 ml prima della centrifugazione. PBMC sono concentrate in un livello sottostante plasma dopo centrifugazione densità. (B) PBMC sono incubate con microsfere che sono conj<html> ugated agli anticorpi monoclonali CD14 umani (isotipo: IgG2a del mouse). e poi caricato su una colonna che si trova nel campo magnetico di un separatore per isolare CD14 + monociti <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> Figura 2: caratterizzazione morfologica di moDCs. (A) 200 ng / ml di GM-CSF e IL-4 è aggiunto monociti CD14 + purificate al giorno 0, 4 e 6 per generare moDCs immaturi; e (B) un ulteriore passaggio di stimolazione con 100 nM vitamina D3 e 10 nM desametasone il giorno 5 genera moDCs tolerogeniche. MoDCs immaturi e moDCs tolerogeniche vengono stimolati con 1 mg / ml LPS il giorno 6 di generare (C) moDCs maturare e moDCs (D) LPS-tolerogeniche.TTP: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> Figura 3:. Surface Marker Caratterizzazione mediante citometria di flusso livelli di espressione di marcatori di superficie HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 e LT3 a tollerogenico (verde), LPS-tolerogeniche (nero), immaturo (rosso), maturo (blu) moDCs. controlli isotipo sono mostrati in grigio. istogramma individuale per ogni tipo di cellula è tracciata con conta delle cellule asse Y contro log asse X di intensità fluoroforo e sovrapposti. Tutti gli istogrammi sono rappresentativi di quattro esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso di copyright. Copyright 2015. L&#39;American Association ofImmunologi, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> Figura 4: caratterizzazione funzionale di moDCs. (A) Quantificazione di frequenza alloproliferation di CD4 + T-cellule indotte da co-coltura con un numero crescente di tollerogenico (TOL, verde), LPS-tollerogenico (L-TOL, nero), immaturo (IMM, rosso) e maturo (MAT ; blu) moDCs. I dati sono stati pool da quattro esperimenti indipendenti; significare differenze statistiche + SEM tra tutti moDCs rispetto moDCs maturi sono stati analizzati da ANOVA a due vie con Dunnett confronto multiplo post-test. (B) analisi di citochine di IFN-Γ (pannello di sinistra), IL-12p40 (pannello centrale) e Il- 10 (riquadro a destral) nei supernatanti da alloreactions tra CD4 + T-cellule co-coltura con un numero crescente di una tollerogenico (verde), immaturo (rosso) o blu) moDCs (maturi. I dati sono stati raggruppati da sei esperimenti indipendenti; media ± SEM alloproliferation + (C) cellule T CD4 e regolamentare l&#39;espansione di cellule T indotta dalla co-coltura con moDCs maturi in presenza di un numero crescente di moDCs tolerogeniche. Sinistra asse Y, la frequenza di CD4 + proliferazione T-cellule. Destra asse Y, la frequenza di CD25 alta Foxp3 + cellule gated sul proliferativa CD4 + T-cellule. I dati sono stati riuniti da tre esperimenti indipendenti; media ± SEM differenze statistiche tra presenza contro l&#39;assenza di moDCs tolerogeniche sono stati analizzati da una via ANOVA con Dunnett confronto multiplo post-test. (D) alloproliferation + CD4 T-cell (a sinistra) e la frequenza di cellule CD25highFoxP3 + (Destra) indotta da co- cultura con moDCs tolerogenichein presenza di un numero crescente di moDCs maturi. I dati sono stati riuniti da due a tre esperimenti indipendenti; media ± SEM differenze statistiche tra la presenza contro l&#39;assenza di moDCs maturi sono stati analizzati da ANOVA a due vie con Dunnett confronto multiplo post-test. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso d&#39;autore. Copyright 2015. L&#39;American Association of immunologi, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> Figura 5: Analisi di mitocondriale attività di moDCs. (A) I livelli di potenziale di membrana mitocondriale (Red CMXRos) in moDCs sono stati ottenuti da fanalisi di citometria basso. I dati di quattro esperimenti indipendenti sono stati riuniti. Media ± SEM (B) Rappresentazione schematica di una respirazione mitocondriale tempo reale. analisi OCR partendo dalla respirazione basale e dopo l&#39;aggiunta di oligomicina (inibizione complesso V), FCCP (massima induzione respirazione), e rotenone / antimicina Una miscela (catena di trasporto degli elettroni inibizione [ETC]). Il mitocondriale SRC (basale massima sottratto respirazione massima) è derivato dalla curva OCR. (C) Rappresentante studio cinetico di mitocondri OCR (pmol / min) a tollerogenico (TOL, verde), LPS-tollerogenico (L-TOL, nero) , immaturo (IMM, rosso) e maturo (MAT, blu) moDCs utilizzando sequenziale aggiunta di oligomicina (Olig), FCCP, e rotenone / antimicina A (Rot-AA). (D) OCR quantificazione della respirazione basale di moDCs e ( E) risparmia capacità respiratoria di moDCs. I dati sono stati riuniti da cinque esperimenti indipendenti. Media ± SEM. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso d&#39;autore. Copyright 2015. L&#39;American Association of immunologi, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> Figura 6: Caratterizzazione metabolica di moDCs. (A) Rappresentazione schematica di tempo reale glicolisi. analisi ECAR parte da ECAR basale, in cui le cellule sono state incubate in terreno senza-glucosio seguire l&#39;aggiunta di glucosio (induzione glicolisi), oligomicina (che induce glicolisi cellule massima inibizione complesso V), e infine 2-deossi-D- glucosio(Inibizione glicolisi). Glicolisi (induzione glicolisi sottratto per ECAR basale), la capacità glicolitico (glicolisi massima sottratto per basale ECAR), e riserva glicolitico (glicolisi massima sottratto per l&#39;induzione glicolisi) sono derivati ​​dalla curva ECAR. (B) Rappresentante studio cinetico della glicolisi-dipendente ECAR (mph / min) a tollerogenico (TOL, verde), LPS-tollerogenico (L-TOL, nero), immaturo (IMM, rosso), e maturo (MAT, blu) moDCs utilizzando sequenziale aggiunta di glucosio (Gluc), oligomicina (Olig), e 2-DG. Bars (C) mostrano livelli basali ECAR (D) glicolisi (e) capacità glicolisi, e (F) riserva glicolitico di moDCs. I dati sono stati riuniti da tre esperimenti indipendenti; significare 6 SEM. Le differenze statistiche sono stati analizzati mediante ANOVA con Tukey confronto multiplo post-test. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso d&#39;autore. Copyright 2015. L&#39;American Association of immunologi, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

generation-immature-mature-tolerogenic-dendritic-cells-with-differing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.9K Views.  Agency for Science, Technology and Research. Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

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Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l&#39;immunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Generazione di un nuovo vaccino a cellule dendritiche con melanoma e cellule staminali tumorali squamose

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...