Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

NOTA: Tutti gli usi degli animali in questo protocollo è stato approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Mississippi Medical Center. 1. Il trattamento degli animali e tessuti <ol><li> Amministrazione e sacrificio <ol><li> Anestetizzare gli animali utilizzando 3% isoflurano per 5 minuti e verificare la profondità dell&#39;anestesia osservando l&#39;assenza del riflesso toe-pinch. Applicare una pomata veterinaria agli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Pesare l&#39;animale e pipetta 50 mg / kg la dose di entrambi rodamina marcato ELP, SynB1-ELP, o Tat-ELP in una provetta da 1,5 mL. Salva 100 ml di composti marcati somministrati per la formulazione delle curve standard in fasi successive. Nota: È importante che norme siano rese dallo stesso lotto di proteina marcata somministrata agli animali per evitare differenze dovute a variazioni di efficienza marcatura fluorescente. Al fine di rimuovere correttamente FLUORES sfondoscenza da misure di fluorescenza più tardi, un animale non trattato deve essere sacrificato utilizzando gli stessi metodi / reagenti come gli animali trattati. </li><li> Somministrare una iniezione IV come descritto in precedenza 1 utilizzando la vena della coda o la vena femorale (a cui si accede tramite un 1 cm incisione inguinale). Per analgesia, se fare una incisione inguinale, somministrare per via sottocutanea carprofen alla dose di 5 mg / kg, e applicare Sensorcaine al sito di incisione prima della chiusura con una clip ferita. Per amministrare per via intranasale (IN), collocare l&#39;animale in posizione supina. </li><li> Usando una pipetta 2 ml, elaborare un calo di 1 ml di prodotto marcato. Brevemente scorrere testa dell&#39;animale dal collare anestesia per consentire l&#39;accesso alle narici. </li><li> Posizionare la punta della pipetta per l&#39;apertura di un singolo nare e premere lentamente lo stantuffo, permettendo la goccia di scorrere al nare nella cavità nasale. Ripetere ogni 1 min, alternando narici ogni goccia fino a quando l&#39;intera dose è annuncioservito. Nota: Il volume massimo somministrato attraverso IN non deve superare i 10 - 15 ml per i topi. </li><li> Lasciare gli animali in posizione supina in anestesia per 10 minuti dopo la somministrazione finale prima di ogni movimento in una gabbia individuale. Nota: non lasciare gli animali incustoditi fino a che non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. </li><li> 1 ora dopo la somministrazione, ri-anestetizzare gli animali come prima e sacrificare tramite perfusione transcardial utilizzando PBS (210.0 mg / L KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / L di NaCl, 726 mg / L di Na 2 HPO 4 7H 2 O) 10 ml / min per un totale di 20 ml. Nota: la perfusione degli animali al sacrificio per rimuovere tutto il sangue dai tessuti è necessaria per determinare le concentrazioni extravascolare dei composti marcati. reagenti perfusione possono causare modifiche a fluorescenza di fondo e devono essere mantenute coerenti. Il metodo di sacrificio deve essere coerenteall&#39;interno dei gruppi. Diversi metodi di sacrificio può provocare diversi livelli di sangue all&#39;interno del sistema vascolare, cambiando la fluorescenza dei tessuti sfondo. </li></ol></li><li> Collezione di tessuti <ol><li> Preparare PBS come descritto sopra per il risciacquo dei tessuti prelevati. Nota: Se un altro tampone è stato utilizzato come liquido di perfusione, lavare tessuti nello stesso tampone. </li><li> Rimuovere il cuore, i polmoni, stomaco, fegato, milza, reni e per semplice dissezione. In breve risciacquo in PBS prima di utilizzare salviette laboratorio di pat secco o liberano dal umidità in eccesso e mettendo i tessuti sul tappeto di imaging. </li><li> Decapitare il mouse e rimuovere la parte superiore del cranio con frese ossee o Rongeurs. Utilizzando pinze, rimuovere con attenzione il cervello, mantenendo intatte le bulbi olfattivi. Risciacquare, asciugare, e posizionarlo sul tappeto di immagini fornite. </li><li> Per rimuovere il midollo spinale attraverso una rapida espulsione 7, riempire una siringa da 10 mL con PBS e inserire un ago 18-gauge smussate. Nota: 18 si adatta a scartamentol&#39;adulto canale spinale di molte linee del mouse. Il diametro richiesto varierà con la dimensione animale. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione prona, garantendo che l&#39;apertura del canale spinale nel sito decapitazione è nettamente tagliata e priva di sangue. </li><li> Rimuovere la pelle attorno alla colonna vertebrale. Utilizzando frese ossee affilate o forbici, tagliare la colonna vertebrale nella sezione lombare direttamente rostrale ai fianchi. </li><li> Brevemente risciacquare con PBS per visualizzare il canale spinale. inserire delicatamente l&#39;ago nel canale spinale. Nota: L&#39;ago dovrebbe sentirsi comodo e può richiedere un po &#39;lento rotolamento avanti e indietro durante l&#39;inserimento. Nel caso l&#39;ago sentirsi sciolto, un taglio più rostrale può essere fatta o potrebbe essere necessario un ago di diametro maggiore. </li><li> Utilizzando il pollice e l&#39;indice, applicare pressione alla colonna vertebrale intorno all&#39;ago inserita. Premere il pistone con una pressione moderata e costante. Il midollo spinale viene espulso fuori intatta dell&#39;apertura rostrale del midollocolonna. Nota: La rimozione completa, risciacquo, asciugatura e di tutti i principali organi possono essere ragionevolmente completati in 5 - 7 min. Questo breve tempo evita la necessità di stoccaggio prolungato in PBS, che potrebbe comportare un&#39;eccessiva esposizione alla luce e la lisciviazione di proteine ​​marcate dal tessuto. </li></ol></li></ol> 2. Tutta-organo Ex Vivo imaging di fluorescenza <ol><li> parametri di imaging <ol><li> Avviare il software di acquisizione delle immagini. In basso a destra del pannello di controllo di acquisizione, fai clic su &quot;inizializzare&quot;. </li><li> In &quot;modalità di imaging&quot;, selezionare la casella di controllo &quot;fluorescenti&quot;. In &quot;tempo di esposizione&quot;, selezionare &quot;AUTO&quot;. </li><li> In &quot;binning,&quot; selezionare &quot;piccolo&quot; e impostare la F / Stop per 2. </li><li> Selezionare l&#39;eccitazione 535 nm e filtri di emissione 580 nm. Nota: Questo può variare a seconda della etichetta utilizzata. </li><li> Selezionare &quot;Campo visivo B&quot; e impostare il targealtezza t a 0,3 cm. Nota: Questo può variare a seconda dei tessuti da acquisire. </li><li> Quando l&#39;indicatore di temperatura diventa verde (cioè la macchina è completamente inizializzato), posizionare i tessuti sullo sfondo nero opaco disponibile, assicurando che i tessuti sono completamente separati gli uni dagli altri. Posizionare il tappetino nel imager, assicurando che tutti i tessuti sono all&#39;interno della griglia area selezionata. tessuti maggiore e non omogenei, come il fegato intero, devono essere disposti in modo da ridurre la sovrapposizione dei lobi. Nota: I tessuti possono essere disposti in un unico gruppo, permettendo un&#39;immagine ad accogliere un singolo animale o tutti i tessuti di tipo simile. Questo rende l&#39;analisi e l&#39;organizzazione più facile in seguito. Se grandi differenze di intensità di fluorescenza sono presenti tra vari tessuti, è meglio immagine singolarmente o come gruppi dello stesso tipo di tessuto, come un unico tempo di esposizione non può essere ideale per tutte le intensità dei tessuti. </li><li> Fai clic su &quot;Acquisire&quot;. </li><li> Dopo l&#39;imaging, rimuovere i tessuti immediatamente e memorizzare o congelarli per l&#39;istologia quantitativa, come indicato al punto 4. </li></ol></li></ol> 3. Norme e Image Processing <ol><li> Standards <ol><li> In PBS, creare diluizioni doppie seriali di ciascuna proteina utilizzata nel trattamento degli animali, a partire dalla concentrazione originale, con un totale di 15 diluizioni. Nota: L&#39;intervallo di concentrazione dovrebbero includere le concentrazioni tissutali attesi e può richiedere ulteriori diluizioni del campione originale, a seconda della concentrazione iniziale. </li><li> Dispensare 100 ml di ogni standard in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti nero. Includere un pozzetto di pura PBS per ottenere una misura di fluorescenza di fondo. </li><li> Immagine norme, con gli stessi parametri utilizzati per la imaging dei tessuti. </li><li> Nel software di acquisizione delle immagini &quot;tavolozza degli strumenti&quot; sotto &quot;Strumenti ROI&quot;, selezionare la &quot;regione di interesse (ROI) &quot;Cerchio e disegnare il ROI circa un bene. Ricevuto il ROI a tutti gli altri pozzi pieni e cliccare &quot;misurare il ROI.&quot; </li><li> Sottrarre il valore medio efficienza radiante del puro PBS dai valori delle altre norme; Ciò elimina la fluorescenza di fondo. Tracciare i valori contro la concentrazione nota su un diagramma a dispersione. Nota: L&#39;equazione risultante della linea di tendenza lineare può quindi essere utilizzato per calcolare il valore di fluorescenza relativa. </li></ol></li><li> Elaborazione immagini <ol><li> Nel software di acquisizione delle immagini, selezionare lo strumento ROI a mano libera e disegnare ROI attorno a ciascuna delle singole tessuti. Fai clic su &quot;misura&quot;. </li><li> Con le misurazioni efficienza radianti medi risultanti, sottrarre i valori misurati dal animale trattata per ogni tipo di tessuto e tracciare quei valori sulla curva standard creato in precedenza. Nota: I valori di fluorescenza relativi risultanti forniscono una fotografia istantanea rapida e precisa delbiodistribuzione del composto marcato. </li></ol></li></ol> 4. Istologia tessuto Quantitative <ol><li> Preparazione e congelamento dei tessuti per affettare <ol><li> Creare o acquistare contenitori di dimensioni sufficienti per congelare i tessuti scelti e criostato da utilizzare. Avvolgendo un foglio di alluminio intorno ad un oggetto di dimensioni adeguate e sagomato funziona bene. </li><li> Preparare una miscela di isopropanolo e ghiaccio secco riempiendo metà di un bicchiere da 500 mL con ghiaccio secco e aggiungendo ~ 350 ml di isopropanolo in modo che vi sia sufficiente liquido sopra il ghiaccio secco per immergere parzialmente il contenitore di congelamento. Nota: L&#39;azoto liquido spesso provoca la frattura del composto ottimale temperatura di taglio (OCT), e tessuti incorporati e dovrebbe essere evitato. </li><li> Riempire il contenitore di congelamento parziale con Office, assicurando che non vi siano bolle presenti. Se ci sono bolle, lavorare le bolle di soluzione con una pinza o un simile attrezzo. </li><li> Rimuovere il tessutoda PBS e asciugare accuratamente, sia tamponando delicatamente con un laboratorio wipe o toccando i bordi dei tessuti delicati a un laboratorio di pulire e permettendo il liquido per favorire la. </li><li> Posizionare il tessuto delicatamente PTOM all&#39;interno del contenitore congelamento, garantendo non introdurre bolle sotto il tessuto. Una volta che il tessuto è a posto, aggiungere ottobre finché il tessuto è completamente coperto. </li><li> Immergere il contenitore congelamento per quanto è possibile senza che il isopropanolo a venire a contatto con i PTOM esposto all&#39;interno del contenitore. Attendere 30 - 90 s (o potenzialmente più per i tessuti più grandi) per Office e tessuti di congelare completamente prima della conservazione a -80 ° C per il tempo necessario. </li></ol></li><li> Preparazione degli standard per affettare. <ol><li> Preparare e opportunamente etichetta 1 mL siringhe monouso rimuovendo la fine della canna, in modo tale che l&#39;intera lunghezza della siringa è un diametro. Ciò consentirà il cilindro congelato per essere spinto in seguito. </li><li> Noiing Office, creare un 15-fase di diluizione seriale duplice di composti somministrati, come è stato fatto con PBS in precedenza, ma con un volume risultante finale di 1 ml. Includere un campione di pura ottobre per la rimozione di sfondo valori di fluorescenza. </li><li> La viscosità dell&#39;OCT rende adeguata miscelazione difficile. Invertire i tubi e consentire di Office per risolvere completamente prima di invertire di nuovo. Ripetere questo 10 - 20 volte per garantire una miscela uniforme. Conservare le soluzioni standard a 4 ° C e al riparo dalla luce durante la miscelazione. </li><li> Dopo la miscelazione, ancora preparare una miscela di isopropanolo e ghiaccio secco, come prima. Nota: L&#39;azoto liquido può anche essere usato al posto della miscela di ghiaccio isopropanolo / lavaggio, a condizione che le siringhe sono rapidamente rimossi dopo che sono congelati solido. </li><li> Disegnare lo standard ottobre nella siringa, avendo cura di introdurre il minor numero possibile di bolle. Dopo aver disegnato la soluzione di Office, immergere immediatamente la siringa direttamente nel isopropanolo e consentire la soluzione di congelare completamenteall&#39;interno della siringa per 10 - 20 s. Conservare le siringhe a -80 ° C per il tempo necessario. </li></ol></li><li> Taglio di tessuti e Standards <ol><li> Posizionare entrambi i tessuti e gli standard a -20 ° C e lasciare il tempo sufficiente per tutti i campioni a temperatura. Nota: La temperatura di taglio ideale cade generalmente intorno al -10 ° C gamma per la maggior parte dei tessuti, ma dipende in definitiva dimensioni del tessuto e grassi e deve essere raffinato empiricamente. </li><li> Utilizzando un criostato, tagliare i tessuti nel 20 micron fette spesse e montarli su vetrini, come descritto in precedenza 8. Conservare i vetrini a -20 ° C e tenerli lontani dalla luce il più possibile durante il taglio e fino scansione. Nota: È importante che le sezioni da misurare sono distribuiti opportunamente tutto lo spessore del tessuto. </li><li> Per montare le norme sul mandrino criostato, prendere la siringa dal congelatore e riscaldare l&#39;esterno per 3 - 5 s di Holding in mano. Spingere lo stantuffo fino un breve tratto (~ 1 cm) del cilindro PTOM di fuori della siringa. <ol><li> Usando una lametta, tagliare attraverso il cilindro e posizionare la sezione cilindro risultante perpendicolarmente sulla mandrino, utilizzando Office per tenerlo in posizione. Questa configurazione dovrebbe tradursi in ambienti ben definiti da tagliare. </li></ol></li><li> Tagliare i cilindri a 20 micron, mettendo una fetta da ciascuna diluizione su una singola diapositiva, in modo che una diapositiva rappresenta l&#39;intera curva standard. Conservare i vetrini a -20 ° C fino al momento per la scansione. </li></ol></li><li> La scansione e quantificazione <ol><li> Avviare il software matrice di scansione e cliccare su &quot;543 laser&quot; per iniziare la procedura di avvio del laser. Attendere 15 minuti per il laser per essere pronti. </li><li> Una volta che il laser è pronto, rimuovere i vetrini da -20 ° C e spostarli in un grande contenitore, protetta dalla luce raggiungono la temperatura ed asciugare per 3 min. Questo impedisce l&#39;accumulo di umidità nel slide scanner. </li><li> Caricare la slitta nella presa scorrevole sullo scanner diapositiva. Fai clic su &quot;Scan&quot; e selezionare &quot;Esegui scansione facile&quot;. </li><li> Impostare la risoluzione di scansione di 50 micron. </li><li> Selezionare la prima casella di controllo &quot;Use&quot; sotto &quot;Fluoroforo&quot; e selezionare &quot;TRITC.&quot; Impostare il guadagno PMT al 80%. Nota: Le impostazioni variano a seconda del fluoroforo e la concentrazione delle molecole marcate. </li><li> Sul lato sinistro, in modo che l&#39;area di scansione comprende l&#39;intera diapositiva. Fai clic su &quot;Start&quot;. </li><li> Dopo la scansione, selezionare &quot;file&quot; e &quot;salva con nome&quot;, e quindi salvare l&#39;immagine come tif. Nota: Le diapositive di tessuti e standard dovrebbero essere analizzati sulle stesse impostazioni. </li><li> Caricare le immagini risultanti in ImageJ e selezionare ROI intorno i tessuti e gli standard. Nella scheda &quot;analizzare&quot;, selezionare &quot;impostare le misure&quot; e selezionare &quot;valore medio grigio.&quot; Click220; misura &quot;. Nota: Come con la tecnica precedente, fluorescenza di fondo deve essere sottratto da tutti i valori misurati. </li><li> Tracciare le misure medie valore di grigio alle norme contro la concentrazione nota per creare una curva standard. Nota: Le misurazioni risultanti dai tessuti devono essere mediate all&#39;interno di ogni tessuto e tracciati su quella curva standard per determinare la concentrazione nel tessuto. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. 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(4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

GLB is owner of Leflore Technologies, LLC, a private company working to develop ELP-based drug delivery technology. Leflore Technologies provided no support for the publication of this paper or for the generation of data within it.

Mentre ex vivo di imaging intero organo è generalmente semplice, l&#39;adesione ad alcuni concetti e tecniche di base può migliorare la precisione delle misure di bio-distribuzione. lunghezze d&#39;onda corte di esperienza luce un alto grado di dispersione e di assorbanza nella maggior parte dei tessuti, che in modo significativo l&#39;impatto l&#39;utilità del fluorofori a breve lunghezza d&#39;onda. Questi fluorofori hanno limitato l&#39;applicazione negli studi profondo dei tessuti, ma sono stati utilizza...

etichettatura fluorescente è un metodo semplice ed efficace utilizzato per determinare la biodistribuzione di composti, utilizzando una serie di apparecchiature che è comune a molti laboratori. Fluorofori sono ampiamente disponibili, relativamente poco costoso, e sono disponibili in una varietà di lunghezze d&#39;onda, in modo tale che più etichettato molecole possono essere utilizzati contemporaneamente senza interferenze. La maggior parte dei fluorofori hanno una gamma di chimiche per coniugazione a diversi gruppi reattivi sui composti bersaglio, e il processo di coniugazione è generalmente semplice per la maggior parte dei siti reattivi. Inoltre, le attrezzature necessarie per le misure di composti fluorescente sono comuni in molti laboratori. microscopi a fluorescenza, imager e scanner di diapositive possono essere utilizzati in diverse circostanze, rendendo l&#39;uso di marcatura fluorescente altamente accessibile. Etichette fluorescenti vengono spesso utilizzati per determinare la biodistribuzione e cinetica di composti sia in vivo ed ex vivO con dispositivi di imaging in tempo reale, come la Spectrum IVIS Imager, e di istologia del tessuto quantitativa 2,3. L&#39;utilizzo di ex vivo di imaging intero organo utilizzando dispositivi di imaging dal vivo è aumentata nel corso del tempo a causa della loro facilità d&#39;uso e la capacità di creare rapidamente un confronto accurato delle relative concentrazioni di composti etichettati senza richiedere l&#39;ulteriore trattamento dei tissues4. Tuttavia, mentre ex vivo di imaging intero organo può consentire una facile analisi e confronto, non genera una misura quantitativa della concentrazione di composti assolute all&#39;interno di un tessuto. Ciò è dovuto ad effetti di dispersione della luce all&#39;interno organi intatti. Dal momento che la dispersione della luce (e, in misura minore, assorbanza) varia in base alle dimensioni del tessuto e la densità, l&#39;imaging intero organo può sottovalutare livelli tissutali di organi di grandi dimensioni o densi. La formulazione di standard adeguati per misure della concentrazione assolute è anche difficile perché si deve imitare lo spessoree la densità di ogni singolo organo. D&#39;altra parte, imaging intero organo è un metodo rapido per ottenere i livelli tissutali relativi di un agente, ed è ideale per confrontare la relativa biodistribuzione del correlata più molecole (ad esempio in studi di droga targeting). Una strategia alternativa è quella di utilizzare istologia fluorescenza quantitativa, una tecnica derivata dal metodo di autoradiografia quantitativa, per ottenere livelli tissutali assoluti di un agente di test 5,6. Piuttosto che inserire un intero animale o di un organo in un dispositivo di immaginazione, l&#39;istologia del tessuto quantitativa richiede che ogni tessuto essere affettato, montate su slitte, digitalizzati e analizzati singolarmente. Standards dell&#39;agente di prova sono preparati e tagliati allo stesso spessore dei campioni di organi. Tagliando tutti gli organi e standard per lo stesso spessore, variabilità dovuta alla dispersione della luce o l&#39;assorbanza viene eliminato, e l&#39;intensità di fluorescenza del tessuto può essere in forma alla curva standard per determinare concent assolutarazione. Anche se questo metodo, se fatto correttamente, è quantitativa, è anche ad alta intensità di manodopera e facilmente maltrattato. Data la natura più complessa di istologia quantitativa e significativamente maggiore costo del lavoro rispetto all&#39;imaging intero organo, diventa utile esaminare dove ogni processo è più pratico da utilizzare quando esame della biodistribuzione di composti fluorescente. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come questi metodi possono essere utilizzati insieme per confrontare efficacemente la biodistribuzione di rodamina marcato elastina come polipeptide (PEL), con o senza aggiunta di peptidi cellule penetrante SynB1 o Tat, tramite intranasale (IN) e (iv) vie di somministrazione per via endovenosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Reagents</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:231px;">Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:159px;">T6027, A20342</td>
			<td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">1002243569</td>
			<td>PBS Buffer for rinsing</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:231px;">Optimal Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:99px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:159px;">4585</td>
			<td>Used for freezing and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For ex vivo whole organ imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Thermo</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fluorescence slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For slide scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Etichettatura fluorescente è un processo ben consolidato per esaminare il destino di molecole marcate sotto una varietà di condizioni sperimentali sia in vitro che in vivo. sonde fluorescenti sono particolarmente utile per determinare la bio-distribuzione di grandi molecole somministrate, in cui è improbabile che possa influenzare la cinetica o biodistribuzione del composto l&#39;aggiunta di una etichetta fluorescente piccola molecola. Una varietà di metodi esistenti per esaminare la biodistribuzione che variano in modo significativo la quantità di sforzo richiesto e se le misurazioni risultanti sono pienamente quantitativa, ma utilizzando diversi metodi in combinazione può fornire un sistema rapido ed efficace per analizzare bio-distribuzioni. Ex vivo di imaging intero organo è un metodo che può essere utilizzato per confrontare rapidamente le concentrazioni relative di molecole fluorescenti all&#39;interno dei tessuti e tra i diversi tipi di tessuti o gruppi di trattamento. L&#39;utilizzo di un plat di imagingmodulo progettato per live-animale o di imaging intero organo, fluorescenza all&#39;interno dei tessuti intatti può essere determinata come tali, risparmiando tempo e lavoro, fornendo un quadro preciso della bio-distribuzione complessiva. Questo processo è ideale in esperimenti tentano di determinare la specificità tissutale di un composto o per il confronto delle molteplici composti diversi. Quantitative istologia tessuto invece richiede una ulteriore elaborazione dei tessuti al fine di creare una misura quantitativa dei composti marcati. Per valutare in modo accurato bio-distribuzione, tutti i tessuti di interesse devono essere tagliati, la scansione, e analizzati relativi alle curve standard per fare confronti tra tessuti o gruppi. Quantitative istologico del tessuto è il gold standard per determinare le concentrazioni di composti assolute all&#39;interno dei tessuti. Qui, descriviamo come entrambi i metodi possono essere utilizzati insieme in modo efficace per valutare la capacità dei diversi metodi di gestione aND modifiche composti di indirizzare e fornire molecole fluorescente al sistema nervoso centrale 1.

I dati che seguono descrivono la consegna di tre composti: un vettore somministrazione di farmaci nota come ELP e due versioni di ELP modificato con peptidi cellula-penetranti (SynB1-ELP e Tat-ELP) 9. Tutti e tre i composti sono stati etichettati con tetramethylrhodamine-5-maleimmide e consegnati attraverso due vie di somministrazione (IN e IV). Lo scopo di questi esperimenti era determinare quali composto e via di somministrazione comporterebbe la migliore penetrazione nel sistema nervoso centrale (CNS) <sup...

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The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo di imaging intero organo è un metodo rapido per determinare le concentrazioni relative dei composti fluorescente all&#39;interno e tra tessuti o gruppi di trattamento. Al contrario, la fluorescenza istologia quantitativa, mentre più alta intensità di lavoro, consente la quantificazione dei livelli tissutali assoluti di molecole marcate.

L&#39;impiego di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K Views.  The University of Mississippi Medical Center.  Ex vivo di imaging intero organo è un metodo rapido per determinare le concentrazioni relative dei composti fluorescente all'interno e tra tessuti o gruppi di trattamento. Al contrario, la fluorescenza istologia quantitativa, mentre più alta intensità di lavoro, consente la quantificazione dei livelli tissutali assoluti di molecole marcate. 

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Ricerca

Biologia

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura embrionali di topo della pelle e live-imaging delle Migrazioni Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Mappatura spazio-temporale di motilità in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparazioni di intestini

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Imaging e analisi automatizzati per la quantificazione di macropinosomi marcati fluorescentemente

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...