We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).

Tutti gli animali hanno ricevuto cure adeguate secondo le procedure sperimentali descritte nella Guida 2011 per cura e l&#39;uso di animali da laboratorio Comitato di Federico Laboratorio Nazionale per la Ricerca sul Cancro. 1. Generazione di IL-22-tdTomato topi reporter di BAC recombineering NOTA: I topi dovrebbero essere inconscia e non si muovono in risposta a uno stimolo nocivo. Sterilizzare l&#39;area chirurgica con il 70% di etanolo e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro. <ol><li> Purificare BAC DNA (RP23-401E11, lunghezza clone di 228391 bps) utilizzando un metodo di estrazione alcalina 10, 11. Caratterizzare il clone BAC da SpeI digestione di 5 mg di RP23-401E11 per confermare la dimensione corretta del gene bersaglio. NOTA: Il BAC DNA è stato digerito in 14 frammenti. </li><li> Inserire il gene TdTomato giornalista nel sito Not I / Sal I del vettore shuttle PLD53SC-A-GFP-B11 e sostituire il gene GFP nello stesso sito. Quindi, utilizzando BAC RP23-401E11 come modello, amplificare le caselle di omologia (A e B) al primo esone tradotta di Il-22 (esone 1) mediante PCR (95 ° C 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 secondi, e una estensione finale a 72 ° C per 10 min). In un sistema di reazione PCR 50 microlitri, aggiungere 50 ng (1 ml) di BAC DNA, 0,5 ml di primer (10 mM), 40 ml di PCR Supermix alta fedeltà, e 8 ml di H 2 O. NOTA: I primer per le caselle A e B sono i seguenti: Una casella in avanti: 5&#39;-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e Reverse: 5&#39;-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Scatola B Forward: 5&#39;-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5&#39;-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. I siti degli enzimi di restrizione (Asc I e Pac I) sono sottolineate. </li><li> Legare 500 ng di Asc I-digerito A e 500 ng di Fragm B Pac I-digeritoEnt in 50 ng di PLD53SC-ATB (tdTomato) vettore a 16 ° C per 1 ora. </li><li> Transform purificato vettoriale PLD53SC-ATB in cellule BAC-competenti 11 e li cultura su Luria-Bertani (LB) piastre di agar con cloramfenicolo (20 mg / ml) e ampicillina (30 mcg / ml) a 37 ° C. Scegli due o tre colonie di co-integrazione dalle piastre maestro Ch / Amp. </li><li> Inoculare ogni colonia in 1 ml di LB addizionato con 20 ug / ml di cloramfenicolo e incubare per 1 ora a 37 ° C e 225 rpm. Distribuire 100 ml di ciascuna miscela su una piastra di LB-agar (10 g di Peptone 140, 5 g di estratto di lievito, 12 g di agar e 1 L di acqua; pH 7.5) addizionato con cloramfenicolo e 4-4,5% di saccarosio. Incubare la cultura durante la notte a 37 ° C. </li><li> Scegli entrambe colonie grandi e piccoli e li replate su due piatti LB-agar con cloramfenicolo. Poi, esporre le piastre con o senza luce UV per 30 sec e raccogliere le colonie sensibili agli UV per ulteriori analisi. </li><li> Identificare il DNA BAC modificato mediante PCR utilizzando tdTomato / IL-22 Primer eterozigote (Forward: 5 &#39;ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverse: 5&#39; TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). Le condizioni Thermocycler sono le seguenti: 95 ° C per 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 56 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; e una estensione finale a 72 ° C per 10 min. </li><li> Conferma la sequenza dell&#39;area modificata del BAC BAC sequenziamento diretto di grandi prep BAC DNA 12. </li><li> Anestetizzare un mouse destinatario con una dose di 0,25% tribromoethanol nella cavità peritoneale, quando impiantare gli zigoti microiniettati in topi / 6c C57BL pseudo-gravidanza. </li><li> Linearizzare l&#39;IL-22-tdTomato BAC costrutto (10 mg) mediante digestione con 5 ml di restrizione endonucleasePi-SCEI in 100 ml di sistema di reazione e microinject il DNA linearizzato BAC in uova fecondate di C57BL / 6 femmine in fase di pronuclei 13. Screit il topi transgenici con l&#39;analisi Southern blot di DNA isolati da biopsie di coda utilizzando le procedure standard. </li></ol> Preparazione 2. Single-cell da milza, timo, linfonodi, e le placche di Peyer NOTA: topi reporter IL-22-tdTomato sono stati mantenuti al National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Il metodo di eutanasia è conforme alle più recenti linee guida AVMA sull&#39;eutanasia. Tutti i topi sono stati sacrificati con CO 2 inalazione 14. <ol><li> Euthanize un IL-22-tdTomato del mouse in una camera di CO 2 e metterlo su un tampone pulito. Sterilizzare la pelle dell&#39;addome spruzzando il 70% di alcol e tagliarlo aperto. Rimuovere la milza nel fianco sinistro e il timo dietro lo sterno. </li><li> Per raccogliere i nodi mesentericlymph (situato nel tessuto mesenterico) e placche di Peyer (piccoli lymphoidnodules in tutta la regione ileo dell&#39;intestino tenue), prendere la mesenterica bianco perlato i nodi vicino alla tegli parete dell&#39;intestino tenue con sezionare pinze con punte a punta fine seghettati e poi rimuovere l&#39;intero intestino tenue e colon fuori dal corpo. Trova le patch ovali estesi (placche del Peyer) lungo l&#39;intestino e tagliarli con le forbici. Macinare questi tessuti linfoidi (linfonodi e placche di Peyer) individualmente tra due vetrini smerigliati in una cella singola sospensione in PBS / 1% di siero fetale bovino (FBS) tampone sul ghiaccio. </li><li> Tritare la milza o tessuti timo utilizzando lo stesso metodo come al punto 2.2. Centrifugare la sospensione della milza per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi ACK per milza per i pellet cellulari. </li><li> Mescolare bene e lasciare riposare per 1 min. Aggiungere 9 ml di tampone sterile tampone fosfato salino (PBS) per ogni campione. Centrifugare per centrifugazione per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C per rimuovere i globuli rossi. NOTA: Non aggiungere ACK buffer di lisi delle cellule del timo. </li><li> Risospendere le leucociti risultanti in 5 ml di PBS e pass le cellule attraverso un colino cella di 100 micron. Raccogliere il pellet di cellule per centrifugazione a 500 g per 8 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di media RPMI o tampone FACS e contare le cellule vitali utilizzando 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS. </li></ol> 3. Isolamento di intraepiteliale linfociti e lamina propria cellule dall&#39;intestino <ol><li> Aprire la pelle addominale come al punto 2.1, tagliare l&#39;intestino tenue, dal duodeno (accanto allo stomaco) per ileo (vicino alla appendice), e l&#39;intero colon, proprio sopra l&#39;ano. Rimuovere il adiposo in più e pinze dei tessuti utilizzando mesenterici. Mettere subito l&#39;intestino in PBS ghiacciato. </li><li> Se vuoi placche di Peyer (piccole, noduli grezzi) lungo la regione distale del piccolo intestino. Rimuovere le masse con pinza Andopen dell&#39;intestino lunghezza con le forbici. Lavare accuratamente l&#39;intestino con 10 ml di PBS ghiacciato. </li><li> Incubare i tessuti in 20 ml di tampone di pre-digestione (5 mM EDTAe 1 mM ditiotreitolo in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)) per 30 minuti a 37 ° C con rotazione lenta (50 rpm) in un agitatore. Dopo ciascuna delle 2 incubazione, rimuovere lo strato di cellule epiteliali, che contiene i linfociti intraepiteliali (IELS), da un&#39;intensa vortex (30 sec a 12.000 giri al minuto) e passare tutti i tessuti attraverso un colino cella di 100 micron. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione EDTA al tessuto per la seconda incubazione per 30 min a 37 ° C. Passare le frazioni IEL attraverso un colino cella di 100 micron e piscina con le frazioni precedenti. Mantenere i frammenti rimanenti intestino sul ghiaccio da trattare nella fase 3.9. </li><li> Centrifugare le frazioni IEL in pool a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare le frazioni IEL in pool con 10 ml di HBSS / 5% FBS e spin giù per 5 min a 800 xg e 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 8 ml di terreno 44% di silice colloidale e 15 rivestirle medio silice colloidale 5 ml di 67%. Centrifugare il 44% / 67.5% Di pendenza miscela di cellule per 20 minuti a temperatura ambiente e 1.500 x g. </li><li> Raccogliere le cellule IEL della band a livello di interfaccia. Innanzitutto, rimuovere lo strato superiore del surnatante (circa 5 ml) con 1 ml pipetta. Poi, IELS raccolta all&#39;interfase della colloidale medio di silice gradiente. </li><li> Lavare le IELS con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreno RPMI. Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 800 xg e 4 ° C. Risospendere le IELS in 5 ml di RPMI per passo 3.15. </li><li> Per l&#39;isolamento dei linfociti della lamina propria (LPLS), sminuzzare i frammenti di tessuto dell&#39;intestino dal punto 3.4 in piccoli pezzi con le forbici (1 mm) e digerire i pezzi con 10 ml di tampone di digestione (0,05 g di collagenasi, 0,05 g di DNasiI, e 0,3 g di dispasi II in RPMI / 5% FBS) per 15-20 minuti a 37 ° C. </li><li> Filtrare la miscela attraverso un colino cella di 70 micron. Il supernatante flow-through contiene LPL rilasciato. </li><li> Completamente digerire i frammenti intestino ripetendo i passaggi 3,9-3,10 (di solito, devono essereripetuto 3 volte). Ogni volta, piscina il surnatante contenente il LPLS. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione per 5 min a 1500 xg e temperatura ambiente e risospendere il pellet in RPMI / 5% FBS. farli passare attraverso un colino cella di 40 micron. </li><li> Risospendere le pellet cellulari in 10 ml della frazione 40% di 40:80 silice colloidale dislivello medio li sovrapporre 5 ml della frazione 80% in una provetta da 15 ml. </li><li> Eseguire la separazione gradiente di densità per centrifugazione per 20 min a 1500 xg e temperatura ambiente 15. </li><li> Raccogliere il LPLS, come descritto al punto 3.7. li Risciacquare una volta con 10 ml di PBS e risospendere il pellet in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS o mezzo RPMI. </li><li> Contare le cellule vitali (sia IELS e LPLS) con lo 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS. </li></ol> 4. L&#39;espressione di IL-22-tdTomato in Colite <ol><li> Preparare sospensioni cellulari milza singoli da topi IL-22-TdTomato ad una concentrazione di 1 x 10 &lt;sup&gt; 7 cellule / ml in PBS sterile, come descritto ai punti 2.1-2.4. </li><li> Purificare le cellule T CD4 + con il mouse CD4 cellulare Metodo di isolamento Negativo 10. Etichettarli con l&#39;anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) e anti-CD45RB FITC-(clone 16A, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) mediante incubazione a 4 ° C per 30 min. </li><li> Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Lavare le cellule con 2 ml di PBS / 1% tampone FBS e risospendere in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS colorazione. </li><li> Eseguire le cellule T etichettati su una macchina di citometria a flusso 16. Porta le cellule su una popolazione di cellule T e di ordinamento CD4 + CD45RB alte cellule doppio positive (la lunghezza d&#39;onda rilevata a 488 nm e 633 nm) laser. </li><li> Raccogliere le cellule ordinati per centrifugazione per 5 min a 500 xg e 4 ° C. Risospendere il pellet di cellule in tampone PBS sterile a 1 x 10 6 </sup&gt; cellule / ml. Iniettare le cellule (0,5 x 10 6) nel peritoneo ofeach Rag1 - Mouse destinatario - /. </li><li> Sacrificare i topi riceventi sotto di CO 2 in vari momenti. Raccogliere i linfonodi mesenterici e intestino tenue e crasso, come descritto ai punti 2.1 e 2.2. Mettere ogni linfonodo mesenterico e cut-aperto intestino (carta / intestino / carta del panino) nel 4% paraformaldeide (PFA, gestire sotto una cappa) durante la notte per riparare i tessuti. Sostituire il PFA con il 18% di saccarosio per 16-24 ore e poi congelare i tessuti per il sezionamento. </li><li> Utilizzare la macchina criostato per tagliare il tessuto 17, 18, 19. Riscaldare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente per circa 60 minuti e metterli in acetone per 10 min a temperatura ambiente. li asciugare a temperatura ambiente per circa 5 minuti. </li><li> Aggiungere FBS in eccesso, rimuoverlo dalla pipetta e aggiungere anti-RFP ad un 1: BSA 200 diluizione nel 0,1% / 1x PBS. Incubare l&#39;anticorpo a 37 ° C per 60 min. </li><li> Risciacquare le sezioni in 1x PBS per 10 min e applicare l&#39;anticorpo secondario corrispondente (goat anti-rabbit 568) al tessuto, diluito 1: 300 in 1% BSA / PBS 1x, per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBS 1x per 10 min, pulire asciugare e aggiungere lamelle. </li><li> Visualizza tutti i campioni con un microscopio a fluorescenza in presenza di luce coerente (RFP: filtro di eccitazione 540-580 nm) con l&#39;obiettivo 40X. </li></ol>

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N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease.">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).</li><li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice.">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75, 274-282 (1993).</li><li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+in+the+intestine:+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses.">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li><li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection.">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

IL-22 svolge un ruolo essenziale nella innata difesa ospite e nel rimodellamento tissutale. Cellule-22 producono IL sono stati identificati ex vivo mediante colorazione intracellulare. Tuttavia, rimane ancora difficile da monitorare l&#39;espressione di IL-22 in situ, sia allo stato normale o in condizioni infiammatorie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo per sviluppare un modello di topo IL-22 giornalista, che ci permette di localizzare le cellule giornalista esprimono in vivo. La codifica TdTomato gene reporter è stato inserito nel locus IL-22 in un sito che interrompe la sequenza segnale. Questo risultato strategia in reporter essendo intrappolati nella cellula producente, a differenza di IL-22 che è rapidamente secreta, permettendo la visualizzazione della cellula producente. L&#39;IL-22-giornalista ingegnerizzato era contenuto all&#39;interno di un grande BAC, con lo scopo di preservare gli elementi regolatori, così conferendo fedeltà di espressione del reporter corrispondente a quella di IL-22. I tessuti intestinali di m transgenicoice visualizzata espressione giornalista omeostatico nelle cellule CD4 T e linfociti innate nella lamina propria dell&#39;intestino tenue. In colite indotta, cellule T CD4 espresso il giornalista nel colon. Il ruolo di IL-22 nella malattia infiammatoria intestinale è stato poco chiaro. Partecipando nella rigenerazione della mucosa difesa e tessuto intestinale, IL-22 è in grado di suscitare la produzione sia di protezione 20, 21, 22 e mediatori proinfiammatori (ad esempio, IL-8) 23, 24. Due modelli di T colite cella-driven hanno mostrato un aumento di IL-22 nel colon, tra cui TCR α - / - mice 25, 26 e il trasferimento del modello CD45RB hi 27. Confrontando i modelli malattia infiammatoria intestinale, l&#39;espressione di IL-22 nell&#39;intestino era più alto in un Crmodelthan malattia di ohn in un modello di colite ulcerosa 21, 24 .Qui, abbiamo trasferire le cellule T CD4CD45RBhi dai topi reporter in Rag1 - / - destinatari e imitare il processo patogeno della malattia di Crohn. Abbiamo scoperto che, precedendo la colite, IL-22 giornalisti sono stati visualizzati nei linfonodi drenanti intestinali (MLN). I segnali poi diminuita nel MLN e spostati l&#39;intestino, in particolare l&#39;intestino tenue e colon distale, con lo sviluppo di colite. La maggior parte dei giornalisti tdTomato sono stati localizzati all&#39;interno della mucosa lamina propria dell&#39;intestino. Un diverso tipo di reporter per IL-22 è stata precedentemente descritta, in cui le cellule sono assegnati in modo permanente tale che essi e le loro figlie continuano ad esprimere il reporter, se trascrizione di IL-22 o meno ha continuato 28. Come nel nostro studio, intestino linfociti innate sono stati segnati in condizioni omeostatiche, e nella colite, tsi reporter è stato localizzato nelle cellule T dai linfonodi mesenterici al tessuto intestinale. Le procedure descritte in questo protocollo sarebbero applicabili per la creazione di altri topi transgene giornalista, come IL-17, IL-25, e così via. Tuttavia, è fondamentale scegliere adatti cloni BAC trasportano elementi regolatori distali per assicurare la fedeltà di espressione del gene reporter, dato che i transgeni sono integrati in modo casuale nel genoma del mouse. Il mouse giornalista consente l&#39;identificazione di cellule che esprimono in vivo, così come per la purificazione e caratterizzazione di cellule vive. Abbiamo usato tdTomato, una proteina fluorescente rossa eccezionalmente brillante, come un gene reporter fluorescente a fare il giornalista adatto per gli studi di imaging di animali vivi.

Cellule specifiche del tipo di espressione di geni reporter è utile per identificare le cellule che esprimono attivamente il target in tessuti sotto stati omeostatiche e perturbate. Permette anche per la purificazione di queste cellule, che rimangono vitali, per studiare le altre proprietà. topi reporter sono stati utilizzati nel chiarire il meccanismo di azione di specifiche citochine, fattori di trascrizione, e elementi regolatori. Strategie Precedente 1, 2, 3 sono in gran parte affidamento sul battendo il giornalista nel locus bersaglio nel topo cromosoma, una procedura che richiede tempo e costosa. Così, un metodo semplice per la generazione di topi transgenici è desiderabile. Le citochine sono una vasta classe di piccole proteine ​​secrete / peptidi che regolano le risposte immunitarie attraverso la segnalazione intercellulare. L&#39;interleuchina 22 (IL-22) è una citochina con molte riferito attività, tra cui barriera function, la riparazione dei tessuti e l&#39;infiammazione 4. Sebbene IL-22 è stato inizialmente scoperto come prodotto delle cellule T 5, rapporti successivi hanno dimostrato la sua espressione nelle cellule natural killer (NK) negli esseri umani 6 e 7 topi e in altre classi di linfociti innate 8. Nonostante vasta osservazione di cellule-22 che producono IL, visualizzazione di IL-22 in precedenza necessaria la stimolazione ex vivo e permeabilizzazione alle macchie con anticorpi. Pertanto, il romanzo IL-22 topi reporter sarebbe uno strumento molto utile per studiare la funzione di IL-22 nei processi omeostatici e patogeni. Qui, abbiamo sviluppato un modello semplificato transgenico giornalista mouse per osservare le cellule IL-22-producono in vivo e in vitro. Utilizzando un metodo BAC recombineering 9, abbiamo inserito la sequenza tdTomato cDNA con Poly A frammenti di segnale in IL-22 locnoi e sostituito esone 1. Le altre regioni, esoni, e gli elementi normativi non tradotte non sono stati perturbati, dal momento che vorremmo imitare la regolazione naturale della IL-22, per quanto possibile. Il sito di inserimento giornalista interrompe la sequenza di segnale, con conseguente accumulo del reporter all&#39;interno delle cellule che producono, a differenza di IL-22 stessa, che sta rapidamente secreto. Questo nuovo metodo può essere applicato anche alla generazione di topi transgenici per altre proteine ​​secrete.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">RP23-401E11 BAC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">RPCI23.C</td>
			<td style="width:345px;">Need gene ID: 50929</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">NucleoBond BAC 100</td>
			<td style="width:151px;">Takara Clontech</td>
			<td style="width:116px;">740579</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">10790020</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">PI-SceI</td>
			<td style="width:151px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:116px;">R0696S</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">SpeI</td>
			<td style="width:151px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:116px;">R0133S</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">10855-001</td>
			<td style="width:345px;">1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Anti-mouse CD3</td>
			<td style="width:151px;">eBioscience</td>
			<td style="width:116px;">11-0031</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:151px;">eBioscience</td>
			<td style="width:116px;">17-0041</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Anti-mouse CD45</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">MCD4530</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Anti-mouse CD45RB</td>
			<td style="width:151px;">eBioscience</td>
			<td style="width:116px;">11-0455</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Anti-mouse RFP</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:116px;">Ab62341</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:164px;">HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">14175145</td>
			<td style="width:345px;">KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Dnase I</td>
			<td style="width:151px;">Roche</td>
			<td style="width:116px;">10104159001</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">A1049201</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">Percoll</td>
			<td style="width:151px;">GE healthcare life sciences</td>
			<td style="width:116px;">17-0891-01</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:151px;">Roche</td>
			<td style="width:116px;">11088858001</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td style="width:151px;">Roche</td>
			<td style="width:116px;">4942078001</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:164px;">IX70 inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:345px;">Ask for quote</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">Nikon Eclipse 80i microscope</td>
			<td style="width:151px;">Nikon</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:345px;">Ask for quote</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:164px;">Dynal shaker</td>
			<td style="width:151px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:116px;">61050-10</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">FACSAria</td>
			<td style="width:151px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:345px;">Ask for quote</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:164px;">LSRII SORP/flow cytometry</td>
			<td style="width:151px;">Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:345px;">Ask for quote</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of il-22-expressing lymphocytes using reporter mice

topi reporter sono stati ampiamente utilizzati per osservare la localizzazione di espressione dei geni target. Questo protocollo si concentra su una strategia per stabilire un nuovo modello di topo transgenico giornalista. Abbiamo scelto di visualizzare interleuchina (IL) 22 genica perché questa citochina ha importanti attività nell&#39;intestino, dove contribuisce a riparare tessuti danneggiati da infiammazione. Sistemi Reporter offrono notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dei prodotti in vivo. Nel caso di IL-22, altri studi avevano prima isolato cellule dai tessuti e poi ri-stimolate le cellule in vitro. IL-22, che è normalmente secreta, è stato intrappolato all&#39;interno delle cellule usando un farmaco e la colorazione intracellulare è stato usato per visualizzarla. Questo metodo identifica le cellule capaci di produrre IL-22, ma non ne determina che facevano così in vivo. Il design giornalista comprende l&#39;inserimento di un gene per una proteina fluorescente (tdTomato) nel IL-22 gene in tale way che la proteina fluorescente non può essere secreto e quindi rimane intrappolata all&#39;interno delle cellule che producono in vivo. Produttori fluorescenti possono quindi essere visualizzati in sezioni di tessuto o ex vivo analisi tramite citometria a flusso. Il processo di costruzione vera e propria per il giornalista incluso recombineering un cromosoma artificiale batterico che conteneva il gene IL-22. Questo cromosoma multistrato è stato poi introdotto nel genoma del mouse. Omeostatico IL-22 espressione reporter è stato osservato in diversi tessuti di topo, tra cui la milza, timo, linfonodi, le placche di Peyer, e intestino, mediante citometria a flusso di analisi. La colite è stata indotta da cellule T (CD4 + CD45RBhigh) di trasferimento, ed espressione reporter è stato visualizzato. Le cellule T positive erano prima presenti nei linfonodi mesenterici, e quindi hanno accumulato all&#39;interno della lamina propria delle piccole tessuti dell&#39;intestino e del colon distale. La strategia con BAC ha dato espressione giornalista buona fedeltà rispetto a IL-22 Expressione, ed è più semplice di procedure knock-in.

Un murino IL-22 giornalista transgene è stata creata usando recombineering per modificare un cromosoma artificiale batterico portando la IL-22 locus. La figura 1 mostra uno schema di pBACe3.6 vettore contenente il gene sacBII, un indicatore positivo-selezione, e cloramfenicolo antibiotico gene di resistenza 11. Dopo aver introdotto tdTomato in esone 1, la sequenza di peptide segnale è stato interrotto, come mostrato nella Figura 2. Così, il giornalista tdTomato è stato intrappolato all&#39;interno delle cellule IL-22 che esprimono, consentendo loro individuazione e l&#39;isolamento mediante citometria a flusso. I topi omozigoti sono stati allevati da linee fondatori e screening mediante PCR, e non richiedevano reincrocio per conseguire prole con un&#39;identità genetica, come richiesto nel solito strategia knock-in. Per testare la fedeltà dei IL-22 giornalisti, in vitro splenociti generate da sono state coltivate in Th22 o condizioni neutre. <strong&gt; Figura 3 dimostra che l&#39;IL-22-tdtomato è stato ben espresso nelle cellule Th22 in vitro, sia rilevata mediante citometria di flusso o microscopia a fluorescenza. In vivo, come mostrato in figura 4, il reporter IL-22 è stata rilevata in diversi tessuti di topo sotto condizione omeostatica. La maggior parte del segnale tdTomato è stato trovato nelle cellule lamina propria (LP) dall&#39;intestino, ma non nel linfonodi ascellari (ALN), la milza o il timo. Per visualizzare il reporter tdTomato nel tessuto infiammato, abbiamo utilizzato un modello murino di colite indotta dal trasferimento di cellule T CD4 + giornalista CD45RB hi in RAG1 - / - mice. Figura 5 dimostra che i reporter erano di prima presenti nei linfonodi mesenterici e quindi accumulata all&#39;interno della lamina propria delle piccole tessuti dell&#39;intestino e del colon distale. Presi insieme, questo nuovo metodo per la generazione di IL-22 topi giornalista è efficace e risparmio di tempo. Figura 1: Mappa del sito del vettore pBACe3.6. pBACe3.6 è caratterizzata dal fatto di contenere cloramfenicolo resistenza agli antibiotici e un gene sacBII come marcatore positivo selezione. Durante la ricombinazione, i cloni desiderati sono saccarosio-resistenti attraverso la loro esprime il gene sacBII e sono autorizzati a crescere su supporti saccarosio-contenente, mentre le colonie negativi BAC sono saccarosio-sensibili. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54710/54710fig2.jpg" /> Figura 2: Rappresentazione schematica del modificato clone RP23-401E11 BAC. Un gene reporter tdTomato stato introdotto nel Il-22 locus, che comprende IL-22 e regolamentari elementi in un murine bacterial artificial chromosome (RP23-401E11 BAC), utilizzando la tecnologia recombineering. Con la ricombinazione omologa, la sequenza del peptide segnale di IL-22 nella<html> BAC è stato interrotto e esone 1 di Il-22 è stato sostituito dal gene reporter tdTomato. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54710/54710fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54710/54710fig3.jpg" /> Figura 3: Identificazione di IL-22 reporter in splenociti coltivate in vitro. cellule T CD4 sono stati purificati da milza e poi stimolate con anti-CD28; anti-CD3 (condizione neutra); o anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, e 6-Formylindolo (3,2-b) carbazolo (FICZ) per 5 giorni. IL-22-tdTomato è stata analizzata mediante citometria di flusso (in alto due) e la microscopia a fluorescenza (due inferiori, barra della scala: 100 micron). I numeri nei quadranti indicano la percentuale di cellule CD45 +.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54710/54710fig4.jpg" /> Figura 4: Visualizzazione di IL-22-cellule che producono in diversi tessuti di topo. cella singola sospensioni sono stati preparati dalla milza, timo, linfonodi, intestino (IEL e LP), e le placche di Peyer. Sono stati poi superficie colorati con FITC anti-CD3 ed esaminate per l&#39;espressione tdTomato. MLN: mesenterica linfonodi, ALN: linfonodi ascellari, PP: le placche di Peyer, IEL: cellule intraepiteliali isolate dal piccolo intestino, LP: le cellule lamina propria purificato dal piccolo intestino. I numeri nei quadranti indicano la percentuale di cellule CD45 +. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54710/54710fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 5: localizzazione di IL-22 giornalisti durante lo sviluppo di trasferimento T-cell colite. cellule T CD4CD45RBHigh da IL-22 topi reporter sono stati trasferiti in Rag1 - / - topi, ei segnali tdTomato sono stati valutati mediante immunoistochimica nei diversi tessuti in diversi momenti durante lo sviluppo di colite. Le frecce indicano i segnali di IL-22-tdTomato. Barre di scala = 25 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54710/54710fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K Views.  National Cancer Institute, National Institutes of Health. We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse. 

Video: Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult mouse models to neonatal diseases is limited. To better understand disease progression, host responses and long-term impact of interventions in neonates, a neonatal mouse model likely is a better fit. The sparse use of neonatal mouse models can in part be attributed to the technical difficulties of working with these small animals. A neonatal mouse model was developed to determine the effects of probiotic administration in early life and to specifically assess the ability to establish colonization in the newborn mouse intestinal tract. Specifically, to assess probiotic colonization in the neonatal mouse, Lactobacillus plantarum (LP) was delivered directly into the neonatal mouse gastrointestinal tract. To this end, LP was administered to mice by feeding through intra-esophageal (IE) gavage. A highly reproducible method was developed to standardize the process of IE gavage that allows an accurate administration of probiotic dosages while minimizing trauma, an aspect particularly important given the fragility of newborn mice. Limitations of this process include possibilities of esophageal irritation or damage and aspiration if gavaged incorrectly. This approach represents an improvement on current practices because IE gavage into the distal esophagus reduces the chances of aspiration. Following gavage, the colonization profile of the probiotic was traced using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of the extracted intestinal DNA with LP specific primers. Different litter settings and cage management techniques were used to assess the potential for colonization-spread. The protocol details the intricacies of IE neonatal mouse gavage and subsequent colonization quantification with LP.

This study details the process of gavaging precise amounts of probiotics to neonatal mice. The experimental set-up was optimized to include but is not limited to probiotic dosing, methods of administration, and quantification of bacteria in the intestines.

Studi di probiotici in topi neonatali tramite sonda gastrica

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;