Gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dall'istituzionale Animal Care e uso Comitato della Texas A & M University. Revisione e approvazione da un ufficiale di sicurezza biohazard o comitato presso il vostro Istituto può essere richiesti.
Attenzione: Tutte le procedure richiedono BSL3 contenimento. Il personale sono tenuto a indossare dispositivi di protezione individuale in ogni momento. Tutte le manipolazioni vengono eseguite all'interno il gabinetto di biosicurezza (BSC) e tutti i diesis sono smaltiti in contenitori. Superfici di lavoro e BSC sono puliti con tamponata etanolo fenolo e 70% prima di iniziare il lavoro e dopo il lavoro. Le procedure normalmente sarebbero stato fatto a livello di biosicurezza 3 con il Mycobacterium tuberculosis, ma per l'illustrazione e scopi delle riprese, gli autori dimostrano queste procedure a livello di biosicurezza 2 con batteri meno virulenti.
1. ceppi e condizioni della coltura
Nota: Ceppo di M. tuberculosis CDC1551 è utilizzato in questo studio, ma qualsiasi ceppo di M. tuberculosis può essere utilizzato nello stesso modo.
<ol><li>Crescere i batteri in M-OADC-TW (7h 9 brodo completato con glicerolo 0,5%, destrosio 10% acido oleico complessa senza catalasi e 0.05% Tween-80) media in piedi a 37 ° C per un OD600 di 0,5 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>Diluire la cultura in M-OADC-TW (serie di 01:10 diluizioni dei batteri). Piastra le diluizioni dei batteri (105, 106, 107, 108) in triplice copia sul selettivo 11 piastre 7 H per consentire la determinazione di CFU.</li>
	<li>Incubare le piastre per quattro settimane a 37 ° C o fino a quando non possono essere accuratamente contate le colonie.</li>
	<li>Centrifugare l'inoculo batterico a 8.534 x g per 5 min ottenere una pallina. Lavare la pallina una volta con 10 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) e risospendere il pellet in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. l'infezione aerosol dei topi utilizzando una camera di Madison
<ol><li>Consentire topi raggiunga il nuovo ambiente per una settimana.</li>
	<li>Pesare i topi prima di caricarli nella camera.</li>
	<li>Inserire tre cavi nella ciabatta: il potere della camera principale, la pompa del vuoto e il compressore d'aria, in quell'ordine.</li>
	<li>Svitare con cura il barattolo di vetro. Portare il vaso di vetro per la biosicurezza e aggiungere l'inoculo di sfida sospesa in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) per raggiungere ~ 104 - 106 CFU di batteri nei polmoni.</li>
	<li>Chiudere il coperchio del vaso di vetro nella cappa di biosicurezza. Collegare il vaso a unità nebulizzatore e regolare il tubo verticale in acciaio, in modo che l'estremità inferiore (assunzione) è circa un quarto di pollice sotto il livello del fluido nel vaso.</li>
	<li>Tutti gli animali necessari per l'esperimento (la camera può contenere fino a 90 topi) nel vano di carico e chiudere tutti i fermi sulla porta.</li>
	<li>Verifica principale (camera) Misuratore di flusso aria. Assicurarsi che il centro del galleggiante (palla) eseguito circa 50 L/min come misurato sulla scala di sinistra.</li>
	<li>Premere il tasto Start sul pannello di controllo della camera. Impostare la velocità di flusso d'aria attraverso il misuratore di portata aria compressore (il metro più piccolo a sinistra) come 4 L/min sulla scala. Controllare visivamente per assicurarsi che l'inoculo di sfida è essere nebulizzato.</li>
	<li>Dopo 15 min, quando appare la luce rossa sulla parte anteriore del pannello di controllo e un segnale acustico indica la fine della corsa, premere il pulsante Reset in basso a destra del pannello di controllo di azzerare il timer.</li>
	<li>Tenere premuto il pulsantino rosso sulla porta della camera per rilasciare il vuoto.</li>
	<li>Aprire la porta della camera e rimuovere gli animali. Posizionare i topi indietro nelle loro gabbie.</li>
	<li>Togliete il vaso del nebulizzatore di vetro e mettere in un contenitore di trasporto sigillata, a tenuta stagna. Posizionare il contenitore all'interno del cabinet di bio-sicurezza e scartare la sospensione di sfida in un contenitore per rifiuti designato.</li>
	<li>Posizionare il vaso di nebulizzatore usato all'interno di un sacchetto di biohazard e sigillare il sacchetto per il trasporto all'autoclave.</li>
	<li>Al termine della procedura l'infezione, spruzzare all'interno della camera di etanolo fenolo e 70% tamponata e fare la camera a riposare per 10 min.</li>
	<li>Quindi, pulire molto accuratamente tutte le superfici interne accessibili. Smaltire tutti gli asciugamani di carta contaminati, ecc. nel cestino biohazard. Autoclave nel Cestino, contenitore per rifiuti e utilizzato nebulizzatore vasetti.</li>
	<li>Sistemare gli animali torna nella camera di contenimento fino al punto di tempo imaging.</li>
	<li>Il giorno dell'imaging, è possibile trasferire gli animali in un contenitore secondario alla camera imaging.</li>
</ol>3. animale anestesia
<ol><li>Anestetizzare i topi con isoflurano utilizza un sistema di anestesia di gas su misura.</li>
	<li>Pesare ognuna della due cartuccia filtro carbone situato sopra l'apparecchio di anestesia.</li>
	<li>Sostituire con una nuova cartuccia se il peso è di 50 g sopra il peso iniziale.</li>
	<li>Controllare l'apparecchio vaporizzatore per garantire sufficiente isoflurano per la procedura.</li>
	<li>Collocare il supporto del cono di naso all'interno della camera di formazione immagine. Inserire il numero di coni di naso necessaria per la procedura e sigillare le aperture rimanenti con i bloccanti del cono di naso.</li>
	<li>Accendere l'alimentazione di ossigeno dal cilindro ad alta pressione e impostarlo a 55 psi.</li>
	<li>Accendere la pompa di evacuazione situata di fronte l'unità di anestesia e impostarlo a 8 L/min.</li>
	<li>Accendere il commutatore di ossigeno che si trova di fronte l'unità di anestesia.</li>
	<li>Attivare il flusso di gas alla camera di induzione di anestesia per impostare il flusso del gas a 1,5 L/min Disabilita il flusso del gas.</li>
	<li>Attivare il flusso di gas alla camera di formazione immagine per impostare il flusso del gas a 0,25 L/min Disabilita il flusso del gas.</li>
	<li>Accendere il vaporizzatore di isoflurano e impostarla a 2-2,5%. Regolare il livello di isoflurane secondo il numero e il peso degli animali essendo utilizzati per l'esperimento ruotando la manopola sul vaporizzatore di isoflurane (2-2,5% per un mouse pesa ~ 20 g; 4% per una cavia di un peso di 300 g).</li>
	<li>Posizionare i topi in camera di anestesia e chiudere il coperchio. Attivare il flusso del gas nella camera di induzione di anestesia.</li>
	<li>Lasciare i topi nella camera di induzione di anestesia per 5-10 minuti fino a quando completamente anestetizzato.</li>
	<li>Una volta che i topi sono anestetizzati, applicare una pomata ottica agli occhi per proteggerli durante la formazione immagine.</li>
	<li>Disporre i topi in decubito sternale o ventrale in modo tale che i nasi sono collocati nel cono di naso per facilitare l'anestesia dei topi durante la procedura di imaging.</li>
</ol>4. imaging di fluorescenza (REF) enzima reporter
<ol><li>Iniettare il substrato (20 µM, 2,5 µ l/g di peso) di iniezione intraperitoneale in infetti, come pure i topi di controllo. I topi sono sotto anestesia all'interno della camera imaging per meno di 1 min.</li>
	<li>Avviare il sistema di imaging.</li>
	<li>Inizializzare il sistema facendo clic su Inizializza. Attendere che la barra di temperatura diventa verde. Nota: La camera imaging è costituito da una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante la formazione immagine.</li>
	<li>Per l'imaging di impostazione di acquisizione, selezionare fluorescenti | Trans-illuminazione per animale intero o Epi-illuminazione per tessuti polmonari, struttura e sovrapposizione nel pannello di controllo di acquisizione.</li>
	<li>Campo di vista impostata B per singolo mouse e livello di lampada ad alto.</li>
	<li>Impostare il tempo di esposizione di auto, binning medie, 2-3 per il f/stop e filtro di eccitazione a 745 nm ed emissione filtri da 780 nm a 840 nm.</li>
	<li>Per l'installazione di sequenza, fare clic sulla sequenza di installazione, selezionare punti di Trans-illuminazione di 9-12 nell'area del polmone.</li>
	<li>Fare clic su Acquisisci per acquisizione di immagini.</li>
	<li>Inserire il mouse post-l'imaging gabbia.</li>
	<li>Monitorare i topi fino a completamente recuperato o sacrificare per quantificare CFU se imaging presso un punto di tempo dell'esperimento. Eseguire un punteggio di Karnofsky modificato per monitorare il benessere dei topi post-imaging.</li>
</ol>5. analisi di REF imaging
<ol><li>Aprire il software di imaging.</li>
	<li>Caricare i file immagine facendo clic sull'icona Sfoglia.</li>
	<li>Per unmixing spettrale, fare clic su Spectral Unmixing nella tavolozza degli strumenti e fare clic sugli spettri per unmix necessaria. Fare clic su start unmixing.</li>
	<li>Per la ricostruzione della superficie ottica, clicca sulla topografia di superficie.</li>
	<li>Selezionare l'orientamento alla dorsale, soggette a mouse pelliccia e, fare clic su genera superficie.</li>
	<li>Ritagliare l'immagine e imposta immagine di soglia per una regione di interesse. Fare clic su Chiudi.</li>
	<li>Per la registrazione dell'organo, vai alla scheda di registrazione in 3D dal menu a discesa di strumenti ottici.</li>
	<li>Registro di organi di interesse in un Atlante di organo.</li>
	<li>Regolare la dimensione dell'organo o posizione alla topografia superficiale generata utilizzando strumento di trasformazione inserita/disinserita situato sugli strumenti pannello-registrazione.</li>
	<li>Vai alla tomografia fluorescente (FLIT) ricostruzione 3D e selezionare analizzare sulla scheda e selezionare le immagini per essere inclusi per analisi, tipo all'efficienza di trasmissione fluorescenza normalizzata (NTF) immagine, fare clic su Start.</li>
	<li>Verifica su Seleziona tutto e ricostruire nella scheda Anteprima dati.</li>
	<li>Per la quantificazione di fluorescenza, vai strumenti regione di interesse (ROI), di aggiungere cubo ROI all'organo di interesse e regolare le dimensioni del cubo per coprire l'organo di interesse. Fare clic su misura 3D ROIs.</li>
	<li>Nella finestra di misurazione del ROI, vai a misure ROI 3D, selezionare il tipo di dati all'unità di voxel e misurazioni di fonte a pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Salvare e/o esportare il risultato di analisi FLIT ricostruzione 3D in un file di dati o di figura.</li>
</ol>6. quantificazione dei batteri di CFU
<ol><li>Eutanasia i topi tramite l'iniezione intraperitoneale di 0,1 mL sodio pentobarbital (390 mg/mL).</li>
	<li>Controllo per pedale riflesso comprimendo le pastiglie dei piedi dei topi per accertarsi che non vi è nessuna reazione riflessa.</li>
	<li>Explant il tessuto polmonare da topi con delle forbici, pinze sterili. Omogeneizzare il tessuto polmonare in 1 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x.</li>
	<li>Effettuare diluizioni seriali 10 volte dell'omogeneato del polmone in PBS 1X sterile.</li>
	<li>Per la placcatura, spot tre aliquote di 20 µ l della diluizione rispettiva sulla piastra di agar.</li>
	<li>Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C e monitor per la crescita batterica.</li>
	<li>Conteggio delle colonie in ogni spot dopo il tempo di incubazione e rapidi come CFU / mL correggendo per volume e diluizione utilizzando la seguente equazione: CFU / mL = (C/V) x M Dove C = conteggi di Colonia per spot, V = volume di campione inoculato su ogni piatto (mL) e M = fattore di moltiplicazione (reciproco della diluizione utilizzata). Nota: Se vengono contate le 11 colonie in uno spot per un volume di campione di 0,002 mL ad una diluizione del campione di 10-4, utilizzando l'equazione, il conteggio delle colonie sarà calcolato come (11/0,02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Official+American+thoracic+society/infectious+diseases+society+of+America/+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines:+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children.">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs.">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li><li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli.">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li><li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis.">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li><li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus.">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li><li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence.">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li><li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis,+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate.">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+&#946;-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence.">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with &#946;-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice.">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis.">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase.">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria.">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).</li><li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging.">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).</li><li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+fluorescence+imaging+of+bacterial+infections+in+animal+models.">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).</li><li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+infection+with+a+fiber+optic+microendoscope.">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging.">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li><li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry.">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li><li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9.">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li><li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+bacterial+infections.">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li><li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis.">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).</li><li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tuberculosis+with+endogenous+&#946;-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice.">Imaging tuberculosis with endogenous &#946;- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li><li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals.">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li><li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+tuberculosis.">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li><li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest:+characteristic+findings+and+role+in+management.">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li><li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography,+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging.">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li><li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET/CT.">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li><li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform.">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li><li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice,+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity.">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo.">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).</li><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe.">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+imaging+of+bacterial+infection+using+endoscopic+excitation+of+&#946;-lactamase+(BlaC)-+specific+fluorogenic+probe.">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of &#946;-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).</li><li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tuberculosis+diagnostics.">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li><li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+in+vivo:+recent+advances.">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li><li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats.">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717 (2017).</li><li>Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,7-disubstituted+cephalosporin+derivatives+as+beta-lactamase+substrates+and+methods+for+their+use+for+the+diagnosis+of+tuberculosis.">2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis.</a> US patent. , (2015).</li><li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Covalent+Reporter+of+&#946;-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria.">A Covalent Reporter of &#946;-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li><li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+&#946;-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus.">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of &#946;-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion:+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT.">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li><li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer:+a+case-control+study.">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li></ol>

Quando si utilizza tecniche di imaging, quali REF, non ci sono strategie chiave che consentono la generazione di dati affidabili e coerenti. Imaging ottico produce luce diffusa nei tessuti che possono influenzare la profondità di penetrazione, dato che è difficile da catturare la luce emessa in tutte le direzioni. Uso di un fluoroforo infrarosso vicino (NIR) substrato per REF imaging avendo una lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione in Querange di 700-900 nm facilita l'assorbimento minimo del segnale fluorescente da tessuti di mammiferi. Il substrato personalizzato progettato fu costruito collegando un fluoroforo NIR, IRDye 800Cw a un quencher, QC IRDye-1, da un anello di lattame permettendo tempra basati sul trasferimento di fluorescenza risonanza energia. IRDye ha tessuto eccellente penetrazione e le caratteristiche di dispersione della luce e non ha alcun effetto nocivo evidente su mammiferi36, viene eliminato dal sangue e organi da 24 h. fluorescenza segnale significativamente aumenta cominciano 4 h dopo amministrazione di substrato, raggiungendo maximal livelli 6 h dopo la somministrazione.
La dose infettiva batterica, modalità di somministrazione della dose infettante e il substrato così come tempo-punti di imaging post infezione eseguendo studi pilota dovrebbe essere standardizzata prima di intraprendere grandi e complessi, esperimenti. Studi pilota possono ridurre notevolmente i tempi e i costi quando un gran numero di animali di imaging poiché una procedura standard può essere ottimizzata prima di fare l'esperimento chiave. Batteriche carichi dovrebbero essere determinati in organi/tessuti di interesse seguendo imaging di tutto il corpo utilizzando trans-illuminazione ed ex vivo formazione immagine del polmone usando epi-illuminazione per convalidare l'origine del segnale e determinare la qualità di correlazione con numeri batterici presenti8. Studi pilota fornirà approfondimenti la soglia di rilevazione, gamma dinamica della tecnica nonché la determinazione delle condizioni sperimentali ottimali per l'imaging.
I vantaggi principali dell'utilizzo di REF imaging come rispetto ad altre strategie di fluorescente e bioluminescenti sono sua alta sensibilità e abilità all'immagine naturale M. tuberculosis ceppi. REF imaging utilizza l'enzima cataliticamente robusto BlaC che è conservata in tutti gli isolati clinici di M. tuberculosis e ceppi di tubercolosi-complesso. La grande sensibilità di REF imaging è a causa del rapido tasso catalitico di BlaC in combinazione con conservazione del prodotto fluorescente fenduto dalla cellula ospite. Continuamente il segnale aumenta fino a quando il substrato è disponibile con conseguente accumulo quasi illimitata del segnale all'interno delle cellule infettate e tessuti. Questa maggiore sensibilità di REF imaging come rispetto ad approcci alternativi di imaging permette di rilevazione specifica di M. tuberculosis entrambi in vitro e in vivo8,23,24, 29.
REF di imaging può essere utilizzato per il rilevamento di batterico senza modificazioni genetiche che permette la sua applicazione diretta a qualsiasi modello di infezione, di animali o laboratorio8,37 o materiali clinici umani29,38 . REF può essere utilizzato per rilevare e immagine una vasta gamma di agenti patogeni39,40, poiché substrati fluorogenici possono essere sviluppati per numerosi obiettivi enzimatici oltre a BlaC come proteasi, chinasi, ureases e β-galattosidasi. Tuttavia, attenzione dovrebbe pensare alla destinazione al fine di garantire Visualizza caratteristiche ottimali per l'imaging. BlaC rappresenta un enzima buon modello per caratteristiche che garantiranno la riuscita applicazione di questa strategia. REF imaging fornisce una lettura immediata sulla carica batterica presente nei polmoni durante le infezioni, che accelera notevolmente i progressi nello studio della patogenesi di tubercolosi, poiché la determinazione dei numeri batterici normalmente richiede tre-sei settimane, ma anche in più rapida crescita organismi questo approccio vi farà risparmiare moltissimo tempo. REF potrebbe anche essere utilizzato per discriminare carcinomi da tubercolosi, un problema chiave nella diagnosi delle lesioni nodulari in pazienti41,42. REF serve come un nuovo strumento per accelerare la formazione immagine traslazionale tubercolosi e può essere applicato anche agli esseri umani, consentendo potenzialmente rapido pronostico dei risultati terapeutici.

Il tasso di crescita lenta di M. tuberculosis è un ostacolo importante nella diagnosi rapida di tubercolosi1,2,3. Mentre la cultura basata diagnosi vogliono settimane per produrre risultati, vetrino ha limiti diagnostici4 bambini5 e pazienti co-infetti con virus dell'immunodeficienza umana6,7. Tecnologie di imaging ottiche sono stati recentemente riconosciute come un'alternativa ai tradizionali metodi diagnostici per la tubercolosi8,9. Fluorescenza e bioluminescenza può essere utilizzati per immagine otticamente M. tuberculosis in animali vivi in tempo reale10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imaging ottico ha il vantaggio di una valutazione rapida e specifica di un'infezione con la tubercolosi di M.20,21,22.
Delineiamo dettagli per imaging ottico di M. tuberculosis in topi dal vivo utilizzando REF. Questo metodo è molto sensibile e specifico23,24 e, simile ad altri metodi ottici, è meno costoso rispetto ad altri metodi di imaging25, compreso tomografia computata (CT)26, magnetica la tubercolosi (TB) resonance imaging (MRI)27e F-fluorodesossiglucosio tomografia a emissione di positroni/CT (F-FDG PET/CT)28. REF utilizza personalizzati substrati fluorescenti o bioluminescenti che al momento della scissione di un enzima batterico, producono un prodotto fluorescente8,29. Quindi, ha il vantaggio di non richiedere un reporter micobatterica ricombinante ceppo30,31. Il substrato FRET descritto è composto di un fluorocromo e un quencher collegati da un anello β-lattamico che viene idrolizzato dalla BlaC (β-lattamasi), naturalmente costitutivamente espresso da tubercolosi-complesso Mycobacterium8, 32. i batteri direttamente generano segnale a causa di attività catalitica REF che permette l'amplificazione di molti ordini di grandezza e rivelazione sensibile di M. tuberculosis.
Il substrato REF utilizzato in questo studio ha tessuto eccellente penetrazione negli animali vivi e ridotto sfondo a causa della sua lunghezza d'onda. Con questo substrato di lunghezza d'onda è possibile raggiungere una soglia di rilevazione per M. tuberculosis di quasi 100 Colonia formando unità (CFU) in vitro e < 1000 CFU nei polmoni dei topi in vivo (animale intero)8, 33. REF può essere utilizzato come strumento diagnostico per espettorato, materiali clinici ed anche direttamente in pazienti con micro sistemi endoscopici16,32,33,34 dovuto la sua alta sensibilità e specificità. REF può essere applicato a qualsiasi ceppo clinico di tubercolosi, perché utilizza un enzima batterico prodotto naturalmente, BlaC, per rilevazione presente in tutti i ceppi. Queste caratteristiche rendono REF imaging in generale uno strumento prezioso nella ricerca pre-clinica tubercolosi per facilitare terapeutico e valutazione del vaccino, nonché analisi della patogenesi, ma anche, in definitiva, possono essere applicate alla diagnosi di tubercolosi pazienti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:163px;">VETONE</td>
			<td align="right" style="width:119px;">501027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:216px;">CNIR800</td>
			<td style="width:163px;">Custom synthesized</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fatal Plus solution</td>
			<td style="width:163px;">Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H9 Middlebrook broth</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OADC Middlebrook enrichment</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sporcidin</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;">RE-1284F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H11 Middlebrook Agar</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Madison Chamber</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td align="right">124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XGI-8-gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Living Imaging software</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transparent nose cones</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M. tuberculosis strain CDC1551</td>
			<td style="width:163px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td>
			<td style="width:163px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

Fluorescenza di enzima reporter (REF) utilizza substrati specifici per enzimi presenti negli organismi bersaglio di interesse per formazione immagine o rilevazione di fluorescenza o bioluminescenza. Utilizziamo BlaC, un enzima espresso costitutivamente da tutti i ceppi di M. tuberculosis . REF permette rapida quantificazione dei batteri nei polmoni dei topi infettati. Lo stesso gruppo di topi possa essere imaged in molti punti di tempo, notevolmente riducendo i costi, l'enumerazione dei batteri più rapidamente, permettendo osservazioni romanzo nelle interazioni ospite-patogeno e aumentando il potere statistico, poiché più animali per gruppo sono facilmente mantenuti . REF è estremamente sensibile a causa della natura catalitica del reporter enzimatica BlaC e specifico a causa del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza personalizzato (FRET) o substrati fluorogenici utilizzati. REF non richiedono ceppi ricombinanti, garantendo interazioni ospite-patogeno normale. Descriviamo l'imaging dell'infezione di tubercolosi del M. usando un substrato FRET con emissione massima a 800 nm. La lunghezza d'onda del substrato permette imaging sensibile dei tessuti profondi nei mammiferi. Ci illustrerà l'infezione aerosol dei topi con M. tuberculosis, anestesia dei topi, l'amministrazione del substrato REF e imaging ottico. Questo metodo è stato applicato con successo alla valutazione di efficacia di antibiotici targeting per M. tuberculosise interazioni ospite-patogeno.

REF imaging dei topi infettati con la tubercolosi di M. insieme a controllo non infetti del mouse sono mostrati in Figura 1A. I topi infetti ha prodotto una significativamente (P = 0,0057) segnale di fluorescenza maggiore dai polmoni alle post-infezione 6 settimane, rispetto al controllo sulla gestione di substrato. Un corso tipico di tempo per studiare l'efficacia terapeutica contro M. tuberculosis mediante REF potrebbe essere imaging in settimana 1, 2, 4, 6, 15, 24 post-infezione. L'intensità di fluorescenza è quantificato utilizzando epi-illuminazione per tessuti polmonari (Figura 1B). Il segnale costantemente crescente dalla settimana 2 alla settimana 6 nei polmoni dei topi infettati suggerisce che REF è stato in grado di rilevare M. tuberculosis in vivo. Un calo del segnale di fondo dei topi di controllo in un secondo tempo (Figura 1B) potrebbe essere attribuito all'aumento nel corpo massa e volume dei topi in un periodo di 6 settimane, riducendo in tal modo la penetrazione di lunghezza d'onda di eccitazione. Ricostruzione 3D di FLIT delle fonti di fluorescenza in topi infettati con M. tuberculosis è rappresentato in Figura 2A. Le sequenze di immagini vengono acquisite in più punti trans-illuminazione del mouse utilizzando la stessa eccitazione e la serie di filtri di emissione. Queste sequenze di immagini vengono quindi utilizzate per la ricostruzione 3D di fuga alla CHETICHELLA per distribuzione sorgente fluorescente all'interno del soggetto animale. Figura 2 A-D di seguito viene illustrato le diverse direzioni (coronali, sagittali e transaxial) di tomografia del mouse con la registrazione dell'organo polmone. Efficienza NTF mappe per controllare la qualità di ricostruzione sono rappresentati in Figura 2,E. NTF permette di sottrarre le perdite di luce di sfondo dalle immagini di trans-illuminazione attraverso un'immagine supplementare catturata con filtro a densità neutra. L'immagine presa con il filtro di eccitazione specifico (Figura 2E-misurato) è normalizzato all'immagine di trasmissione misurata con lo stesso filtro di emissione e un filtro di eccitazione aperta (Figura 2E simulato) per dare il segnale prodotto dal substrato da solo. Il simile misurato e simulato il profilo di efficienza NTF in sia orizzontale (Figura 2,F) e verticale (Figura 2G) profili con quasi 0% percentuale di errore (Figura 2E-% errore) fornisce la prova di una ricostruzione 3D di buona qualità con riduzione artefatti e localizzazione del segnale migliorata e sensibilità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figura 1 . Imaging di M. tuberculosis con rif. (A) in vivo imaging dei topi non infetti e infettati con la tubercolosi di M. a 2, 4 e 6 settimane post-infezione. La barra dei colori rappresenta l'intensità del segnale fluorescente in fotoni al secondo per cm2 da basso (giallo) a alta (rosso). (B) quantificazione dell'intensità di fluorescenza da topi infettati con M. tuberculosis. Valori di fluorescenza per entrambi controllo (nero) e infetto (rosso) è rappresentato insieme all'errore standard per ogni punto di tempo. Il significato dei risultati è stato determinato da studenti t-test, i valori di p del < 0,05 sono stati considerati significativi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figura 2 . 3D FLIT ricostruzione delle sorgenti di fluorescenza in topi infettati con M. tuberculosis. Tomografia del mouse rappresentata in direzioni diverse; A) coronale, B) sagittale e C) transaxial con registrazione dell'organo D) del polmone. La regione di interesse (ROI) 3D è rappresentata come un cubo rosso nel polmone per misurazioni di origine. (E) efficienza NTF mappe di misurato e simulato per verificare la qualità di ricostruzione. Il profilo di efficienza misurato e simulato NTF è stato confrontato, providing di buona qualità di ricostruzione 3D (efficienza simile misurato e simulato NTF). Segnale verticale orizzontale F) e G) profili che rappresentano misurato (blu) e simulata la curva di efficienza NTF (rossa). Le barre orizzontali e verticali rosse indicano la posizione di origine. La barra dei colori rappresenta l'intensità del segnale fluorescente in fotoni al secondo per cm2 da basso (blu) a alta (rosso). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Descriviamo l'imaging ottico dei topi infettati con la tubercolosi del micobatterio (M. tuberculosis) usando la fluorescenza di enzima reporter (REF). Questo protocollo facilita la rilevazione sensibile e specifica di M. tuberculosis in modelli animali preclinici per la ricerca di patogenesi, terapeutica e vaccino.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.3K Views.  Texas A&M Health Science Center. Descriviamo l'imaging ottico dei topi infettati con la tubercolosi del micobatterio (M. tuberculosis) usando la fluorescenza di enzima reporter (REF). Questo protocollo facilita la rilevazione sensibile e specifica di M. tuberculosis in modelli animali preclinici per la ricerca di patogenesi, terapeutica e vaccino.

Video: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Immunologia e infezioni

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analisi di 18FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...