Vorremmo ringraziare Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan per le discussioni utili. Ringraziamo anche Priya Begani per l&#39;assistenza durante le riprese. Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 AI071727 (Ao) e R01 GM110052 (a SLV).

Giorno 1: Espressione di proteine ​​Gag Uso del germe di grano lisato-based in vitro trascrizione-traduzione sistema 1. Preparazione del virus HIV-1 gag <ol><li> Rimuovere tutti i reagenti del kit commerciale CECF germe di grano da congelatori (lisati germe di grano sono conservati a -80 ° C; altri reagenti a -20 ° C). Li Scongelare su ghiaccio e miscelare i componenti come mostrato nella Tabella 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (alimentazione della miscela) </td><td></td></tr><tr><td> soluzione di alimentazione </td><td> 900 ml </td></tr><tr><td> Aminoacidi </td><td> 80 ml </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix-2 (lisato miscela) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> lisati germe di grano </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> acqua libera RNase </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> Aminoacidi </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Plasmidi DNA in tampone TE (1 mg / mL) ** </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> tampone di reazione </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 50 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Composizioni di impasti necessari per le reazioni di germe di grano. Nota: Se l&#39;esperimento è stato progettato per esaminare l&#39;effetto di rimozione di RNA da RNasi sulla membrana Gag vincolante, sostituire gli inibitori della ribonucleasi con acqua RNase-free. Plasmid DNA deve essere esente da impurità secondo le istruzioni del produttore. Tuttavia, plasmids preparati utilizzando convenzionale, ma non endotossine-libero, kit di isolamento plasmide sono stati utilizzati con successo. le istruzioni del produttore consiglia anche usando il DNA sciolto in acqua priva di nucleasi. Se si utilizza il DNA sospeso in TE [10 mM Tris-HCl (pH 7.4) contenente 1 mM EDTA], evitare l&#39;uso di concentrazioni più basse di DNA, in quanto EDTA in TE può influenzare la resa. Plasmidi disciolti in tampone TE ad una gamma di concentrazione di 0,8-1 mg / mL sono stati usati con successo. <ol start="2"><li> In primo luogo aggiungere la miscela di alimentazione (Mix-1) nel cassetto di reazione (camera trasparente). Quindi aggiungere la miscela lisato (Mix-2) per l&#39;altra camera (rosso). Non introdurre eventuali bolle mentre l&#39;aggiunta di miscele nelle loro rispettive camere, dal momento che possono portare a scambio inefficiente dei componenti della soluzione e quindi ridurre l&#39;efficienza della reazione. </li><li> Coprire le camere con la pellicola adesiva fornito con il kit. </li><li> Inserire la cassetta reazione nello scomparto della cassetta e incubate l&#39;assemblea per 24 ore a 24 ° C ad una velocità costante di agitazione 900 giri in un Eppendorf Thermomixer R. </li></ol> Giorno 2: Preparare GUVs di Electroformation e Harvest Germe di Grano Lisati 2. Preparazione di GUVs <ol><li> lipidi aliquote disciolti in solventi inorganici come il cloroformio o miscele di cloroformio e metanolo in fiale di vetro con tappi a vite rivestiti con fodere in teflon e avvolto con Parafilm. Maneggiare lipidi con Hamilton tipo siringhe di vetro, o, se disponibile, consigli plastica cloroformio-resistente. Estrarre flaconcini di vetro contenenti lipidi da utilizzare per la preparazione GUV dal -20 ° C freezer. <ol><li> Una volta che le fiale sono equilibrati a temperatura ambiente, assicurarsi mediante ispezione visiva che le sospensioni dei lipidi sono chiare. La qualità dei lipidi, in particolare lipidi acidi, come fosfatidilserina palmitoil-oleoyl (POP) e PI (4,5) P 2, è importante per gli esperimenti di successo. Non utilizzare i lipidi che sonoin aliquote per più di 2 mesi. </li></ol></li><li> Pre-riscaldare un blocco di calore alla temperatura desiderata. Questa temperatura deve essere di almeno 5 ° C superiore alla temperatura di fusione (Tm) del lipide (s) con la più alta T m. </li><li> Calcolare i volumi di lipidi necessari in base ai rapporti di lipidi molari desiderati. Per studiare l&#39;HIV-1 gag vincolante qui, utilizzare i seguenti rapporti molari, come illustrato nella tabella 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> mix Lipid </td><td> rapporto molare </td><td> Volume (in ml) </td><td> la concentrazione della </td></tr><tr><td> POPC + POPS + Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16.11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Brain-PI (4,5) P 2: 1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Volumi di diversi lipidi utilizzato per ottenere GUVs. <ol start="4"><li> Aggiungere i volumi desiderati di lipidi in un flaconcino di vetro con tappo a vite pulito. </li><li> Scivoli di dimensioni 25 x 50 x 1,1 mm 3 e resistenza 70-100 Ohm (come descritto nel catalogo) Utilizzare ITO-rivestito. Inserire due scivoli ITO rivestite su un banco pulito. Ogni camera electroformation richiede due indio-stagno-ossido (ITO) vetrini Rivestiti. Verificare che il lato conduttore del vetrino è rivolto verso l&#39;alto controllando la resistenza con un multimetro. Si dovrebbe mostrare un valore di circa 200 Ω. Assicurarsi che la superficie delle diapositive sono pulite strofinando delicatamente con etanolo al 70% utilizzando salviette privo di lanugine. </li><li> Pulire la superficie esterna di un ago di una siringa rinsing con cloroformio e posizionare la siringa sul blocco di calore. </li><li> Posizionare una nuova diapositiva di vetro ITO rivestita sul blocco di calore con il lato conduttore rivolto verso l&#39;alto e lasciarlo equilibrare alla temperatura desiderata di solito circa 2-3 minuti. Non riutilizzare i vetrini ITO rivestite per un rischio potenziale che l&#39;ITO-rivestimento sulle lastre di vetro potrebbe essere danneggiata durante le procedure di pulizia. </li><li> Utilizzare un volume di 40-50 ml della miscela lipidica per ogni diapositiva per uniforme e tuttavia rapida diffusione dei lipidi sul vetrino. Regolare il volume totale con un solvente organico appropriato come cloroformio. <ol><li> Mettere una metà del volume totale della miscela lipidica sul vetrino e diffondere immediatamente il lipide mediante la siringa pulita (passo 2.6) per lasciare un film lipidico uniforme (spostando l&#39;ago 2-3 volte lungo il vetrino). Stendere il film lipidico delicatamente (ma presto) per evitare danni al rivestimento ITO sottile. Non uniforme diffusione o ruvida diffusione può portare a sub-ottimalerendimenti o l&#39;eterogeneità computazionale di GUVs. </li><li> Pertanto, garantire la diffusione uniforme controllando il film lipidico dopo la diffusione prima di procedere alla fase successiva. Se l&#39;opacità del film appare eccessivamente non uniforme, ripetere la procedura utilizzando una nuova diapositiva. </li></ol></li><li> Posizionare il vetrino rivestito all&#39;interno di una capsula di Petri con il lato rivestito rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Ripetere i passaggi 2,6-2,9 per il resto della miscela utilizzando un&#39;altra diapositiva ITO rivestite. </li><li> Porre la capsula di Petri contenente entrambi i vetrini in una camera a vuoto essiccazione convenzionale per 60-90 minuti per rimuovere ogni traccia di solventi organici. </li><li> Durante questo processo, impostare l&#39;incubatrice alla stessa temperatura come quella del blocco di calore (65 ° C nella maggior parte dei casi) e pre-caldi 300 mM di soluzione di saccarosio in incubatrice. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione, portare la capsula di Petri al banco e posizionare il vetrino su una superficie pulita. </li><li> Pulire delicatamente una guarnizione PDMS (Figura 1) utilizzando 70% di etanolo e asciutto completamente. </li><li> Collocare sul vetrino lipidi rivestite come mostrato in Figura 1 e delicatamente e fermamente premere in modo che le forme guarnizione a tenuta stagna. Confermare l&#39;assenza di spazi tra guarnizione PDMS e il vetrino. Ciò provoca la formazione di una camera poco profonda che contiene la soluzione di saccarosio. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Figura 1:. Il layout del vetrino ITO rivestito utilizzato per electroformation <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="16"><li> Riempire la camera con soluzione di saccarosio pre-riscaldato senza bolle. </li><li> Posizionare l&#39;altra vetrino rivestito sopra per effettuare una tenuta ermetica. Assicurarsi che non vi siano bolle. L&#39;assemblaggio finale dovrebbe apparire come mostrato nella Figura 2. Fissare la camera di usinclip g legante. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Figura 2:. Rappresentazione schematica della camera di electroformation (vista laterale) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="18"><li> Rimuovere l&#39;eccesso di saccarosio tramite aspirazione e pulire le diapositive utilizzando salviettine privo di lanugine. Fissare i vetrini alla barra di rame in modo che i lati conduttivi sono in contatto uniforme con la barra. Assicurarsi che solo un lato conduttivo del vetrino è in contatto con una barra di rame. </li><li> Collegare la barra di rame per l&#39;uscita del generatore di funzioni utilizzando i morsetti a coccodrillo. Posizionare il gruppo all&#39;interno dell&#39;incubatrice per permettere il montaggio raggiunga la temperatura desiderata. </li><li> Applicare una frequenza dell&#39;onda sinusoidale di 10 Hz e una differenza di potenziale di 1 V per 90 min. assicue che la tensione sia 1 V da un multimetro come illustrato nella figura 3. Continuare il processo per 90 min. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Figura 3:. Le posizioni in cui gli elettrodi del multimetro sono collocati per la frequenza e la corrente di misurazione <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="21"><li> Dopo 90 min, ridurre lentamente la frequenza di 2 Hz e continuare electroformation per altri 10 min. Durante questo tempo, il raccolto nella reazione di traduzione in vitro (passi 3.1-3.2). </li><li> Spegnere il generatore di funzioni e permette il montaggio raffreddare lentamente a temperatura ambiente (spegnendo l&#39;incubatore e lasciando la porta dell&#39;incubatore leggermente aperta). </li><li> Dopo raffreddamento, scollegare i cavi al generatoredai gruppi di scorrimento. GUVs può essere molto fragile e quindi hanno bisogno di essere gestiti molto delicatamente. portare con cautela il gruppo al banco. </li><li> Smontare la camera rimuovendo delicatamente la slitta superiore con pinze. Raccogliere le GUVs sospensione contenente saccarosio con un taglio di 1.000 punta microlitri e trasferimento in una provetta pulita. Maneggiare il tubo con delicatezza per evitare di disturbare GUVs. </li><li> Utilizzare immediatamente le GUVs. GUVs sono stabili per almeno 90 minuti dopo la raccolta se conservata a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Le reazioni Harvest in vitro di traduzione <ol><li> Raccogliere le reazioni in vitro traduzione contenenti proteine ​​desiderate dalla camera rossa con una micropipetta in un tubo. </li><li> Per rimuovere le proteine ​​aggregate, girare i lisati a 16.200 xg per 15 min a una centrifuga da tavolo e trasferire con attenzione il surnatante in un altro tubo. </li></ol> 4. GUV binding assay <ol><li> Utilizzando una punta taglio, mescolare 51; l di reazioni in vitro traduzione contenenti proteine ​​tradotte e 5 ml di GUVs in un tubo ed incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti. </li><li> Allegare un foglio PDMS con un piccolo foro (3-4 mm di diametro) su un vetrino pulito e garantire la tenuta stagna premendo delicatamente e fermamente contro il vetrino. </li><li> Mettere il composto 10 microlitri dal punto 4.1 nel piccolo foro. </li><li> Immagine la miscela sotto un microscopio a fluorescenza confocale epi o invertita a temperatura ambiente. Nota: per evitare l&#39;evaporazione, la camera di imaging può essere coperto da un vetrino. </li></ol>

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	<li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells.">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li><li>Chukkapalli, V., Oh, S. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions.">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li><li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding.">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li><li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes.">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li><li>Carlson, L. A., Hurley, J. 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We declare that we have no conflicting interests.

Il saggio di legame GUV come descritto sopra fornisce una buona alternativa in scenari in cui altri test interazione proteina-lipide hanno i loro limiti. Questo test ci permette di esaminare le interazioni tra myristoylated Gag a figura intera e lipidi acidi con catene acilici lunghezza nativa nel contesto doppio strato lipidico e farlo senza lunghe centrifugazione di galleggiamento grazie ad alta densità gradienti di saccarosio o di altre lavorazioni di post-binding di Gag-lipidico complessi. Un altro vantaggio è che il comportamento di Gag può essere esaminato in una miscela complessa (per esempio, in presenza di componenti citosolici), che non è facilmente ottenuto in altre tecniche in tempo reale, come saggi di risonanza plasmonica di superficie a base. Pertanto, si può affermare che il saggio qui descritto permette di valutare in tempo reale delle interazioni lipidi Gag-acidi in un contesto più nativa di altri test utilizzati nel campo. Tuttavia, vi sono limitazioni associate con il metodo comebene. Per garantire che GUVs in un dato preparato hanno composizione simile tra loro e alla miscela originale, electroformation devono essere eseguite ben al di sopra della temperatura di transizione dei lipidi che hanno la più alta temperatura di transizione presente nella miscela di 25,26. Tuttavia, è possibile che l&#39;esposizione di lipidi a temperature più elevate per più tempo può portare alla rottura dei lipidi 25,27. Pertanto, per controllare la qualità del GUVs, oltre al controllo visivo attivato per inclusione di coloranti fluorescenti di lipidi (ad esempio, DID), è desiderabile per verificare la funzionalità del lipide di interesse [ad esempio, PI (4,5) P 2 ] utilizzando una sonda specifica-lipidico. Inoltre, con composizioni GUV che danno luogo a separazione di fase ad una certa temperatura, occorre prestare attenzione a mantenere con precisione una temperatura desiderata osservando l&#39;interazione proteina-GUV. Un&#39;altra limitazione è che le soluzioni di elevata forza ionica sono incompatibili con l&#39;elettroprotocollo di formazione qui descritto, e quindi GUVs vengono coltivati ​​e mantenuti in 300 mm soluzione di saccarosio 26. In particolare, però, alcuni studi hanno utilizzato con successo i buffer a forza ionica fisiologici nei loro protocolli electroformation modificati 28. Un aspetto critico è la quantità di Gag. Un sistema basato su lisato di reticolociti di coniglio viene spesso utilizzato per la preparazione di full-length HIV-1 gag in saggi di liposomi di galleggiamento. Tuttavia, la quantità di YFP-tagged Gag full-length ottenuto in questo sistema era insufficiente per la visualizzazione di Gag legame GUVs. Per risolvere questo problema, il sistema di trascrizione-traduzione di germe di grano lisato a base privo di cellule, che produce circa 8-10 volte quantità maggiore di Gag, è stato usato nel test corrente. Tuttavia, se GUV esperimenti di legame devono essere eseguite in assenza di componenti lisato cellulare eucariotica, si può usare proteine ​​purificate marcati con un fluoroforo come è stato fatto recentemente (descritte di seguito). E &#39;stato dimostrato che specifica ed efficace legame di Gag alle membrane è un processo cooperativo regolato da vari fattori quali miristato, RNA, headgroups lipidici e catene di acidi e interazioni Gag-Gag (valutata in riferimento 29). Il sistema in vitro di descrivere qui può essere esteso per affrontare i ruoli di fattori singolarmente o in combinazione per comprendere l&#39;ordine degli eventi nel processo cooperativo di Gag membrana vincolante. Finora, il sistema di analisi descritto chiarito un ruolo inaspettato della insaturi PI (4,5) P 2 catene acil nel legame di Gag, ma non quella di un canonica PI mammiferi cellule origine (4,5) P 2 -binding dominio ( il dominio di omologia pleckstrin della fosfolipasi C delta 1) 24, un risultato che non era stato rivelato da saggi di liposomi di galleggiamento. sistemi di dosaggio GUV-based sono stati utilizzati anche per capire altri aspetti della biologia Gag. Utilizzando un derivato Gag contenente un ricez inducibile artificialeMotivo erization e GUVs con zattera-like e non zattera come domini, Keller et al. hanno esaminato la relazione tra Gag partizionamento di domini &#39;zattera-like&#39; e multimerizzazione 30. Uno studio di Carlson et al. Ha utilizzato il sistema GUV e purificata e fluorescente Gag di capire l&#39;ordine sequenziale di reclutamento dei vari endosomiali ordinamento complessi necessari per il trasporto (ESCRT) proteine ​​di membrana da Gag 31. Di recente, un altro studio ha riportato la ricostituzione del processo di gemmazione delle vescicole Gag-indotta sul GUV utilizzando Gag coniugata con un fluoroforo 32. HIV-1 gag multimerizzazione porta alla formazione di submembrane reticolo Gag che è pensato per la curva delle membrane durante l&#39;assemblaggio. Quindi, con un ulteriore miglioramento dei sistemi di dosaggio Gag-GUV, il rapporto tra i cambiamenti di curvatura della membrana e membrana Gag vincolante, che è probabilmente l&#39;aspetto meno ben compreso di montaggio dell&#39;HIV, può essere analizzato come si sta facendo FOr altre proteine ​​curvatura sensibile cellulari 33. In sintesi, con questo protocollo, si possono ottenere quantità sufficienti di myristoylated Gag full-length e visualizzare Gag legame alle membrane GUV. Questo protocollo può essere ulteriormente sviluppato per esaminare varie fasi di HIV-1 montaggio e processi in erba.

dell&#39;immunodeficienza umana di tipo 1 del virus (HIV-1) è un virus con involucro che assembla a gemme e dalla membrana plasmatica (PM) nella maggior parte dei tipi di cellule. L&#39;assemblaggio del virus HIV-1 particelle virali è guidato dal 55 kDa proteina virale chiamata nucleo Pr55 Gag (Gag). Gag è sintetizzato come un precursore poliproteico composta da quattro principali domini strutturali, ovvero matrice, capside, nucleocapside e p6, nonché peptidi due distanziatori SP1 e SP2. Durante il montaggio, la matrice (MA) dominio è responsabile per il targeting di Gag al sito di assemblaggio, il capside (CA) dominio media interazioni-Gag Gag, il nucleocapside (NC) dominio recluta virale di RNA genomici, e fattori dell&#39;ospite p6 reclute che aiuti scissione particella del virus dalla membrana plasmatica. Gag subisce anche una modifica co-traslazionale mediante aggiunta di un acido grasso 14-carbonio o miristato porzione al suo N-terminale. legame di Gag membrana è un requisito essenziale per l&#39;assemblaggio virale, poiché mutants che sono difettosi in membrana vincolante non riescono a produrre particelle virali. Noi e altri hanno dimostrato che il legame di Gag è mediata da segnali bipartite all&#39;interno del dominio MA membrana: la frazione miristato N-terminale che media interazioni idrofobiche con il doppio strato lipidico e un gruppo di residui di base all&#39;interno del dominio MA definito come regione altamente di base ( HBR) che interagisce con i lipidi acidi sul PM 1-4. Studi di Gag-membrana interazioni con l&#39;espressione ectopica di polifosfoinositidi 5-fosfatasi IV (5ptaseIV), un enzima che catalizza l&#39;idrolisi di PM-specifica acida phosphatidylinositol- fosfolipidi (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] per fosfatidilinositolo-4-fosfato, in cellule suggerito che Gag-PM localizzazione è mediata da PI (4,5) P 2 3,5. Tuttavia, gli studi in vitro che mira a comprendere i dettagli più meccanicistici di Gag-PI (4,5) P 2 interazioni hanno dimostrato di essere difficile per una serie di motivi. Peresempio, purificazione di full-length myristoylated HIV-1 Gag per esperimenti biochimici è stato tecnicamente difficile almeno in parte a causa della tendenza di Gag ad aggregarsi durante la purificazione. Quindi, le forme tronche di HIV-1 gag, come Myr-MA o Myr-MA-CA, o la forma non myristoylated sono stati spesso utilizzati in studi che necessitano di purificazione Gag (ad esempio, la risonanza magnetica nucleare, footprinting proteine, e la superficie risonanza plasmonica 6-9). In alternativa, accoppiato in reazioni di trascrizione-traduzione in vitro sono stati utilizzati per produrre full-length myristoylated HIV-1 Gag in altri studi biochimici 1,2. Tipicamente in questo sistema, un plasmide Gag-codifica è trascritta e tradotta con lisati cellulari eucariotiche (per esempio, lisati di reticolociti di coniglio) che sono privi di qualsiasi membrane cellulari e RNA messaggeri ma contengono i meccanismi di trascrizione e traduzione. Dopo la reazione, lisati cellulari contenenti Gag sono mescolati con membranes per l&#39;analisi delle interazioni Gag con i lipidi. Oltre alla facilità di preparazione integrale myristoylated Gag, metodi che utilizzano il sistema di traduzione in vitro trascrizione hanno un vantaggio che la sintesi Gag e successiva membrana reazioni di legame si verificano in un ambiente &#39;eucariotica citosol-like&#39; che possono rappresentare le condizioni fisiologiche. Questa struttura ha contribuito agli studi che hanno dimostrato che le molecole di RNA legate al dominio MA regolano Gag legame con lipidi acidi in modo competitivo 1,2,10-12. Tuttavia, poiché la quantità totale di proteine ​​Gag ottenuti in questi lisati cellulari non sono elevati, marcatura metabolica delle proteine ​​con amminoacidi radiomarcati necessarie per il loro rilevamento. A seconda del metodo per misurare le interazioni Gag-lipidi, sono stati utilizzati una varietà di preparazioni di membrane. Ciascuno di questi metodi ha i suoi punti di forza e limiti. La maggior parte dei test NMR basati richiedono l&#39;uso di lipidi con brevi acilecatene che sono solubili in acqua (per esempio, C4- e C8-PI (4,5) P 2) 6,8. Mentre i metodi NMR per testare legame di Gag ai lipidi che hanno catene acile da tempo trovato nelle cellule sono in fase di sviluppo, sono stati utilizzati soltanto con myristoylated o nonmyristoylated MA finora 8,13. In alternativa, liposomi preparati da lipidi che hanno catene lunghezza acilici nativi sono stati utilizzati in metodi biochimici come flottazione liposomi o fluorescenti tallone liposoma analisi di legame 2,3,10,14-16. Tuttavia, liposomi usati in questi test hanno piccolo diametro, e quindi le loro membrane hanno curvature ripidi e positivi. Al contrario, durante la prima fase di assemblaggio delle particelle nelle cellule HIV-1-infetti, Gag lega al PM, che è quasi planare sulla scala di Gag, e, successivamente, induce curvatura negativa durante erba. Pertanto, le membrane liposomi con curvatura ripida e positivo potrebbe non essere doppi strati lipidici ideali per studiare le interazioni Gag-lipidico. Per quanto riguarda i liposomi flotsaggi ation, un altro potenziale avvertimento è che l&#39;esposizione di complessi Gag-lipidi a gradiente di saccarosio ipertonico durante la centrifugazione possono influenzare l&#39;esito sperimentale. Per alleviare queste limitazioni e fornire un sistema sperimentale complementare, saggi per Gag legame giganti vescicole unilamellari (GUVs) sono stati sviluppati negli ultimi anni. GUVs sono vescicole doppio strato lipidico singoli i cui diametri estendersi a diverse decine di micrometri. Così, la curvatura di queste membrane analogo al PM sulla scala di Gag. Inoltre, grazie alle sue grandi dimensioni, che consente il controllo visivo in microscopi ottici, membrana vincolante proteine ​​Gag di fluorescenza etichettati o etichettati a queste vescicole sulla miscelazione può essere facilmente determinato senza successiva elaborazione di complessi Gag-lipidici. Abbiamo qui descritto un protocollo per studiare l&#39;HIV-1 gag membrana vincolante utilizzando GUVs ottenuti da un metodo electroformation. Vari metodi come dolce idratazione, idratazione gel-assistita, microfonogetto rofluidic e electroformation 17-22 sono stati utilizzati per ottenere GUVs. Per il protocollo qui descritto, il metodo electroformation è utilizzato principalmente per la sua efficacia nel formare GUVs con lipidi acide e la sua relativa facilità di utilizzo, senza la necessità di configurazioni costosi. Dal momento che la visualizzazione di Gag necessita di un reporter fluorescente, giallo proteina fluorescente (YFP) è geneticamente aggiunto al C-terminale di Gag (Gag-YFP). Proteine ​​Gag-YFP sono ottenute in vitro trascrizione e traduzione reazioni in a grano lisati germinali basato sulla tecnologia continuo scambio-flusso continuo (CECF). In questa tecnologia, sia la rimozione di sottoprodotti inibitori delle reazioni e fornitura di substrati di reazione e componenti energetiche vengono raggiunti in un meccanismo di dialisi a base. Per queste reazioni, è utilizzato un plasmide codificante Gag-YFP sotto il controllo di un promotore T7. Da segnalare, come illustrato in precedenza, lisati di germe di grano supportano myristoylation senza componenti aggiuntivi 23,24. Utilizzando questo metodo, è stato possibile ottenere una quantità sufficiente di full-length myristoylated Gag-YFP per la visualizzazione di Gag sulle membrane GUV 24. Qui si descrive il protocollo con cui legame HIV-1 gag a PI (4,5) P2 -contenenti membrane GUV può essere esaminato senza lunghe successiva elaborazione seguenti reazioni vincolanti e proporre che questo metodo complementare preesistente Gag-membrana test impegnativi e possono essere esteso a comprendere ulteriormente l&#39;HIV-1 gag-membrana vincolante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Meterman</td>
			<td>30XR</td>
			<td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Instek</td>
			<td>GFG-8216A</td>
			<td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO</td>
			<td>CG-90IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>21516-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80400</td>
			<td>Gauge 22S, Syringe number 702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td>
			<td>Sylgard, 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td>
			<td>BiotechRabbit, 
			Berlin, Germany</td>
			<td>BR1401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA&#160;</td>
			<td>D7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&#160;</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700041P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-PI(4,5)P2&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

La proteina strutturale del virus HIV-1, Pr55 Gag (o Gag), si lega alla membrana plasmatica in cellule durante il processo di assemblaggio virus. legame di Gag membrana è un passo essenziale per la formazione di particelle di virus, dal momento che un difetto nella membrana Gag risultati vincolanti in grave compromissione della produzione di particelle virali. Per ottenere i dettagli meccanicistici di interazioni di membrana Gag-lipidi, metodi in vitro basati sulla risonanza magnetica nucleare, footprinting proteine, risonanza plasmonica di superficie, liposomi flottazione centrifugazione, o tallone di fluorescenza dei lipidi vincolanti sono stati sviluppati finora. Tuttavia, ciascuno di questi metodi in vitro ha i suoi limiti. Per superare alcune di queste limitazioni e fornire un approccio complementare ai metodi precedentemente stabiliti, abbiamo sviluppato un test in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e membrane lipidiche si svolgono in un ambiente &quot;cell-like&quot;. In questo saggio, Gag legame con membrane lipidiche viene analizzato visivamente utilizzando YFP-Tagged Gag sintetizzato in un germe di grano, con sede a sistema di traduzione vitro e GUVs preparati da una tecnica electroformation. Qui si descrive lo sfondo e dei protocolli di ottenere proteine ​​Gag full-length myristoylated e membrane GUV necessarie per il test e di individuare Gag-GUV vincolante al microscopio.

<html> Utilizzando il protocollo di cui sopra, abbiamo preparato GUVs composto da POPC + POPS + Chol (rapporto molare: 4.66: 2.33: 3). Questa composizione è stata scelta in modo da riflettere circa le concentrazioni di PS e di colesterolo del PM. Robusto ed efficiente vincolante di Gag è stato osservato solo quando il cervello-PI (4,5) P2 è stato incluso nella miscela POPC + POPS + Chol (PI-cervello (4,5) P 2 [rapporto molare POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1] in questo esempio) (Figura 4, confrontare pannelli B e D con a e C). Legame GUVs composti POPC + Gag-YFP SCHIOCCA + Chol + brain-PI (4,5) P 2 è evidente l&#39;aumento dell&#39;intensità della fluorescenza sulla superficie della membrana. Questo aumento può essere visto anche nei profili di intensità di fluorescenza (Figura 4, in basso) lungo la linea che attraversa il confine GUV (XX &#39;nella Figura 4C e D). carico / 54293 / 54293fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Gag lega al cervello-PI (4,5) P2 -contianing GUVs Una sezione trasversale confocale di POPC + POPS + Chol (A e C) e POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P2. GUVs (B e D). Distribuzione di Gag-YFP è mostrato in verde. immagini ingrandite dei GUVs selezionati (scatole gialle) sono mostrati in pannelli C e D. intensità della fluorescenza profili lungo le linee scelte a caso disegnate per attraversare i lati opposti del GUVs (X di X &#39;) sono visualizzabili sotto le immagini. Bar = 5 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes at JoVE.com

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K Views.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

Video: Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

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Immunologia e infezioni

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Pronostico di HIV-1 Uso corecettore (tropismo) mediante analisi della sequenza utilizzando un approccio genotipica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l&#39;<em&gt; In vitro</em&gt; Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.