Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da Duke-NUS Graduate Medical School di Singapore, Goh fondazione e Singapore NRF borsa di studio (NRF-NRFF2016-01) per Manvendra K. Singh.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Duke-NUS Graduate Medical School. 1. Recupero embrionale Ventricoli <ol><li> Sacrifica un topo in stato di gravidanza a tempo allo stadio embrionale desiderato (E11.5 o E12.5) utilizzando una camera di eutanasia alla fornitura del gas di biossido di carbonio o un altro metodo di eutanasia approvato. </li><li> Posizionare il mouse sul dorso su un tavolo anatomico. Disinfettare l&#39;addome della femmina con il 70% di etanolo. Sollevare la pelle sopra la pancia e fare una piccola incisione (1-2 cm) con una lama, quindi tenere la pelle con entrambe le mani e tirare via per esporre la parete addominale. </li><li> Ora tagliare la parete addominale per esporre il corno uterino. Utilizzare pinza sterile per sollevare il corno uterino e con attenzione tagliare i tessuti grassi e dei vasi sanguigni collegati al corno uterino. Tagliare al collo dell&#39;utero per recuperare l&#39;utero. </li><li> Posizionare il corno uterino in una capsula di Petri contenente sterile freddo 1x fosfato Buff<html> ered Saline (PBS) e risciacquare delicatamente. Porre la capsula di Petri sul ghiaccio. </li><li> Usare le forbici per tagliare la linea mediana del corno uterino (di fronte al luogo in cui si trova la placenta) per esporre gli embrioni che sono ancora dentro il sacco vitellino e attaccati alla parete uterina attraverso la placenta. </li><li> Utilizzando pinze sterili, tagliare aperto il sacco vitellino embrionali per liberare l&#39;embrione. </li><li> Posizionare l&#39;embrione in un nuovo piatto di Petri contenente sterile freddo 1x PBS. Decapitare l&#39;embrione e posizionarlo sul dorso. Tagliare aperto la parete toracica per esporre il cuore. </li><li> Utilizzare pinze sterili per sollevare il cuore e tagliare via i vasi intorno ad esso per liberare il cuore dalla parete toracica. Prestare particolare attenzione a non danneggiare l&#39;epicardio del cuore con gli strumenti chirurgici. </li><li> Tagliare il tratto di efflusso ed entrambi atri. Trasferire il ventricolo di un altro piatto con 1x PBS freddo. Porre la capsula sul ghiaccio. </li><li> Ripetere i passaggi 1,6-1,9 fino a che tutti i ventricoli vengono recuperati. </li></ol>Le &quot;&gt; 2. epicardico espianto Nota: Culture questi espianti epicardici sia su vetrini da camera di vetro o su gel di collagene per applicazioni a valle. <ol><li> Vetro Camera Slides <ol><li> Per preparare il terreno di coltura, aggiungere il 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di penicillina / streptomicina e 2 ng / ml il fattore di crescita dei fibroblasti ricombinante 2 (FGF2) per mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM). Eseguire tutti i passaggi della cappa a flusso laminare. </li><li> Aggiungere 500 microlitri terreni di coltura a ciascun pozzetto di una camera 8 pozzetti. </li><li> Mettete ogni ventricolo asportato al centro di un pozzo. Orientare il ventricolo per mantenere il lato sezionato sulla superficie inferiore del pozzetto. </li><li> Delicatamente la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore di coltura cellulare. </li><li> Mantenere la cultura con il minimo disturbo per permettere gli espianti di aderire. La formazione del monostrato epicardico può essere osservata dopo 48-72 ore. </li><li> Per la differenziazione di epicardcellule IAL in cellule muscolari lisce, la cultura le cellule monostrato epicardici in mezzi di differenziazione per altri 6 giorni. Per preparare i mezzi di differenziazione, aggiungere il 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e 50 ng / ml ricombinante fattore di crescita trasformante beta 1 (TGF-β1) per DMEM. </li><li> Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni. </li></ol></li><li> gel di collagene <ol><li> Preparare il gel di collagene in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un kit commerciale 3D collagene cultura secondo il protocollo del produttore. </li><li> Per preparare il volume desiderato di gel di collagene, mescolare la quantità appropriata di soluzione di collagene con 5x di DMEM e pipetta su e giù. La soluzione dovrebbe diventare giallo. </li><li> Aggiungere un corrispondente volume di soluzione di neutralizzazione e miscelare bene immediatamente pipettando su e giù. La soluzione diventerà rosa. </li><li> Pipettare 100 ml di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 30-60 min ad albasso il gel di polimerizzare. </li><li> Aggiungere 200 ml di terreni di coltura descritti sopra per ciascun pozzetto. </li><li> Mettete ogni ventricolo asportato al centro di un pozzo. Orient ventricolo per mantenere il lato sezionato giù sul gel di collagene (apice del ventricolo deve affrontare sperimentatore). Delicatamente la piastra posteriore in incubatrice coltura cellulare. </li><li> Dopo 3 giorni, rimuovere i ventricoli. Mettere la piastra posteriore nell&#39;incubatore coltura cellulare per altri 2 giorni. </li><li> Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni. </li></ol></li></ol> 3. Fissazione e Visualizzazione Nota: le cellule epicardici possono essere visualizzati sia su vetrini da camera di vetro o gel di collagene. <ol><li> Aspirare i terreni di coltura e aggiungere un uguale volume di sterili 1x PBS per lavare le cellule. </li><li> Aggiungere appena sufficiente 4% paraformaldeide (PFA) per coprire le cellule. Fissare le cellule per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere PFA e lavare espianti con 1x PBST (PBS 1x con0,1% triton X-100) per permeabilize cellule. </li><li> Immunostain con l&#39;anticorpo desiderato (ad esempio Alexa Fluor 488-falloidina; ZO-1, α-tubulina e α-actina del muscolo liscio) 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Mikawa, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+analysis+of+cardiac+morphogenesis:+discontinuous+formation+of+coronary+vessels.">Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).</li><li>Mikawa, T., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+mesoderm+generates+a+population+of+coronary+smooth+muscle+cells+migrating+into+the+heart+along+with+ingrowth+of+the+epicardial+organ.">Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ.</a> Dev Biol. 174, 221-232 (1996).</li><li>Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+formation+and+developmental+significance+of+the+epicardium:+a+review.">The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review.</a> Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).</li><li>von Gise, A., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+epithelial+to+mesenchymal+transitions+in+heart+development+and+disease.">Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease.</a> Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Dev Cell. 22, 639-650 (2012).</li><li>Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-processing+enzyme+Dicer+is+required+in+epicardium+for+coronary+vasculature+development.">MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development.</a> J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).</li><li>Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+under+development:+cardiovascular+embryology+applied+to+heart+disease.">New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease.</a> J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).</li><li>Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cardiac+mesenchymal+stem+cells:+expanding+the+outer+limit+of+heart+repair.">Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair.</a> Circ Res. 110, 904-906 (2012).</li><li>Manner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+formation+of+the+epicardium+in+chick+embryos.">Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos.</a> Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).</li><li>Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos.">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).</li><li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+outgrowth+inhibition+leads+to+compensatory+mesothelial+outflow+tract+collar+and+abnormal+cardiac+septation+and+coronary+formation.">Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation.</a> Circ Res. 87, 969-971 (2000).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Dev Cell. 8, 85-95 (2005).</li><li>Merki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+retinoid+X+receptor+alpha+is+required+for+myocardial+growth+and+coronary+artery+formation.">Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Huang, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+transcription+factors+mediate+epicardial+activation+during+heart+development+and+injury.">C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury.</a> Science. 338, 1599-1603 (2012).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx18+and+the+fate+of+epicardial+progenitors.">Tbx18 and the fate of epicardial progenitors.</a> Nature. 458, 8-9 (2009).</li><li>Rudat, C., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1+and+epicardial+fate+mapping.">Wt1 and epicardial fate mapping.</a> Circ Res. 111, 165-169 (2012).</li><li>Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial+cells+express+Wilms'+tumor-1:+Wt1+expression+in+the+developing,+adult+and+infarcted+heart.">Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).</li><li>Iyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+derivation+of+epicardium+and+its+differentiated+smooth+muscle+cell+progeny+from+human+pluripotent+stem+cells.">Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells.</a> Development. 142, 1528-1541 (2015).</li><li>Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+the+epicardial+lineage+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

È fondamentale per sviluppare tecniche che facilitano lo studio della epicardio per soddisfare la crescente importanza della epicardio in sviluppo cardiaco e rigenerazione. Il sistema di coltura epicardico pone notevoli vantaggi per la ricerca epicardico. Un modo alternativo per isolare le cellule epicardial è usare fluorescenza attivato cell sorting (FACS). Questo metodo si basa sull&#39;utilizzo di marcatori epicardici (o-specifica epicardio cellule transgenici espressione di una proteina fluorescente) per separare le cellule epicardial da altre linee. Tuttavia, un numero crescente di prove hanno dimostrato che i marcatori epicardici non sono espresse esclusivamente nel epicardio. Ad esempio, Tbx18 è espresso nel miocardio del setto interventricolare (IVS) mentre WT1 è espresso nell&#39;endotelio 19-21. Quindi, la purezza della popolazione di cellule epicardici isolato è discutibile. Al contrario, il metodo qui descritto cultura battedvantage della natura migratoria delle cellule epicardici. Ciò consente l&#39;isolamento di una popolazione altamente pura di cellule epicardici come dimostrato da esperimenti di etichettatura genetici. Un altro modo per ottenere cellule epicardial sarebbe la differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) in cellule epicardial modulando in primo luogo il BMP, WNT e percorsi di acido retinoico segnalazione. Queste cellule differenziate molto simili alle caratteristiche fisiche e molecolari di cellule embrionali epicardial. Essi non sono solo in grado di sottoporsi a EMT, ma sono anche in grado di differenziarsi in fibroblasti e cellule muscolari lisce 22,23. Anche se questo metodo è molto promettente, è significativamente più complicato e richiede tempo che la cultura epicardico descritto in questo documento. Inoltre, questa tecnica di coltura non richiede attrezzature specializzate e un ulteriore configurazione coltura tissutale esistente è sufficiente. Pur seguendo questo protocollo, è fondamentale prestare special attenzione a non danneggiare l&#39;epicardio con strumenti chirurgici durante il recupero del cuore. Inoltre, è fondamentale per orientare ventricolo escisso con il lato sezionato affaccio sulla superficie del gel di collagene o diapositiva camera per facilitare la migrazione cellulare epicardico. Infine, la coltura deve essere mantenuta con il minimo disturbo in modo da consentire l&#39;espianto di aderire al piatto di coltura. La popolazione di cellule ottenute può quindi essere utilizzato per eseguire una serie di esperimenti a valle che sarà ulteriormente la nostra comprensione della biologia cellulare epicardico. Coltura degli espianti su vetrini da camera fornisce monostrati epicardici per vari esperimenti, tra cui la proliferazione epicardico cellulare, la sopravvivenza, la migrazione, EMT e differenziazione in linee cardiaci. Esso fornisce inoltre l&#39;opportunità di testare l&#39;effetto dei farmaci sulle proprietà cellulari della dell&#39;epicardio così come i cambiamenti di espressione genica associata al trattamento farmacologico. Inoltre, culturing dell&#39;epicardio su gel di collagene permette l&#39;analisi delle celle in una matrice 3D invece della matrice 2D tradizionale, che fornisce una illustrazione più accurata in vivo fisiologia. Tuttavia, un inconveniente di questa tecnica è che questo metodo può essere utilizzato solo per le cellule cultura epicardial da cuori embrionali tra E11.5-E12.5. Durante successivamente la gestazione o nel periodo neonatale all&#39;epicardio perde la capacità di proliferare e migrare. Così è difficile usare questo metodo coltura per isolare cellule epicardial dagli stadi embrionali successive o topi adulti. Nonostante questa limitazione, questa tecnica utilizza abilità di coltura di base e di configurazione per facilitare la crescita di cellule epicardici ex vivo che sarebbe molto utile per lo studio della epicardio e suoi ruoli in sviluppo cardiaco e rigenerazione.

Un patrimonio di dati sperimentali hanno mostrato che l&#39;epicardio influenza passaggi critici nello sviluppo cardiaco. Durante lo sviluppo, la transversum setto dà luogo ad un gruppo di cellule mesoteliali noto come proepicardium 1-4. Le cellule del proepicardium poi migrano e la busta miocardio formare il epicardio. In seguito, un sottogruppo di cellule epicardici subiscono EMT dando luogo ad una popolazione di cellule migratoria epicardio-derivato (EPDCs) che poi invadono il miocardio. Genetica così come retrovirale lignaggio tracciando esperimenti hanno dimostrato che EPDCs differenziarsi in vari lignaggi comprese le cellule muscolari lisce, i fibroblasti, cellule endoteliali e cardiomiociti (se presenti). Pertanto EPDCs contribuiscono significativamente allo sviluppo del sistema vascolare coronarico e architettura miocardica 1,2,4-9. Inoltre, l&#39;epicardio è essenziale per lo sviluppo dello strato compatto ventricolare 10-12. per postaxample Gittenberger-de Groot et al. hanno dimostrato che inibendo la conseguenza del proepicardium porta ad una serie di difetti come un miocardio sottile, loop carente del cuore e anormale formazione setto interventricolare e, di conseguenza, embrionali letalità 13. fattori paracrini secreti dal dell&#39;epicardio embrionale modulano la proliferazione dei cardiomiociti e differenziazione. Coerentemente con questo, specifici per epicardium cancellazione dei percorsi di segnalazione come l&#39;acido retinoico (RA), i fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e Wnt / β-catenina ha provocato la crescita del miocardio difettoso e letalità embrionale 14-16. Anche se il epicardio è stato creduto di essere quiescente nei cuori adulti, recenti studi hanno dimostrato che il programma di sviluppo si riattiva nel epicardio seguente lesione cardiaca 17,18. Dopo l&#39;attivazione, le cellule subiscono una rapida proliferazione e EMT che si traducono in formazione EPDC. Queste cellule presentano la capacity di differenziarsi in fibroblasti e cellule muscolari lisce, ma non cardiomiociti e cellule endoteliali 18. Inoltre, i EPDCs secernono fattori pro-angiogenici che gli aiuti nella vascolarizzazione della zona danneggiata e quindi facilitare il miglioramento della funzione cardiaca, riducendo la dimensione dell&#39;infarto. A causa di questi risultati, l&#39;epicardio ha guadagnato interesse per lo studio dello sviluppo cardiovascolari, malattie e rigenerazione. tecnologia transgenica ha rivoluzionato la ricerca medica nel 21 ° secolo. Con l&#39;aiuto di tecnologie transgeniche, modelli di malati di topo che mimano la condizione umana metabolicamente e fisiopatologico sono stati sviluppati con successo. Tuttavia, lo studio del comportamento delle cellule epicardico in questi mutanti è stata una sfida dovuta principalmente ai primi di letalità embrionale. Considerando il ruolo significativo che la epicardio gioca nello sviluppo cardiaco e la rigenerazione, abbiamo istituito un sistema di coltura in vitro per epicardia del mouseL cellule. Questo metodo permette la coltura a lungo termine delle cellule epicardici e facilita lo studio dettagliato delle due proprietà importanti dell&#39;epicardio: la sua capacità di migrare e differenziarsi. I ventricoli escisse dal mouse potrebbero essere coltivati ​​in gel di collagene che possono essere utilizzati per condurre saggi di migrazione. Essendo coltivate in una matrice 3D che replica la matrice extracellulare ricca di collagene dello strato subepicardico meglio riassume il vivo fisiologia cellulare in. In alternativa possono essere coltivate su vetrini da camera per stabilire un monostrato epicardico che può quindi essere utilizzato per una varietà di applicazioni a valle. Questo monostrato può essere utilizzato per colorare per proteine ​​di giunzione stretti che forniranno approfondimenti sulla capacità del epicardio sottoporsi EMT che è cruciale per la migrazione. Inoltre, esperimenti differenziazione possono essere effettuati anche su queste cellule. Inoltre, profilo di espressione genica può essere analizzata per estrarre l&#39;RNA dalle cellule el&#39;esecuzione di reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Infine, i monostrati potrebbero anche essere trattati con agenti seguita da un&#39;analisi molecolare per verificare le potenziali terapie. Mettere insieme, questo sistema di coltura epicardico ci offre la possibilità di visualizzare e raccogliere dati molecolare che favorisce la nostra comprensione dello sviluppo epicardico. Un&#39;altra caratteristica desiderabile di questo metodo è che è semplice e non richiede alcuna configurazione elaborata. In breve, gli embrioni vengono raccolte al E11.5 E12.5 o in seguito alla quale il cuore è asportato. I ventricoli sono poi coltivate su entrambi i gel di collagene o diapositive da camera. Successivamente, queste cellule possono essere usate per condurre esperimenti a valle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:131px;">Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11995065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td>10500064</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-5KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:131px;">PeproTech</td>
			<td style="width:131px;">450-33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td style="width:131px;">PeproTech</td>
			<td style="width:131px;">100-21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">ZO-1 antibody</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">40-2200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;">T 6074</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">&#945;-smooth muscle actin (SMA) antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;">A 2547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Phalloidin antibody</td>
			<td>Life tech invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D Collagen Culture kit&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>ECM 675</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well chamber slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NNU 154534-PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">15596-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td>4453536</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superscript First Strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">11904-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Usando questo protocollo la cultura, le cellule epicardial primarie possono essere isolate con elevata purezza per le applicazioni a valle. Le cellule coltivate sono in grado di subire EMT, migrare e differenziarsi come cellule epicardial fare in vivo. Per determinare la purezza della nostra cultura di cellule epicardico primarie, abbiamo analizzato gli espianti epicardici generati da Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + embrioni. Sema3d è espresso in cellule epicardial durante lo sviluppo cardiaco precoce, così le cellule epicardial derivate da questi embrioni saranno RFP etichettati. Abbiamo isolato ventricoli da Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + embrioni per espianti epicardici. Dopo 48-72 ore, siamo stati in grado di vedere un monostrato di cellule epicardici. Sovrapposizione di immunofluorescenza RFP e le immagini campo chiaro ha mostrato che la maggioranzadelle cellule migrati dai ventricoli sono di origine epicardico (Figura 1A - C). Abbiamo inoltre convalidato i nostri risultati, isolando RNA delle cellule epicardici primarie e l&#39;esecuzione di qPCR che ha mostrato una forte espressione di specifici geni epicardici (Tbx18 e WT1), piuttosto che un gene marcatore cardiomiociti (Nkx2.5) (Figura 1C). Successivamente abbiamo esaminato la capacità delle cellule di sottoporsi EMT analizzando la polarità cellula e cellula-cellula contatto di cellule epicardici. EMT è un processo biologico che permette una cellula epiteliale perda la sua polarità cellulare e il contatto cellula-cellula per trasformare in una cellula mesenchimale migratori. Il primo passo del EMT è il distacco dei contatti cellula-cellula. Abbiamo immunostained cellule epicardial con ZO-1 (noto anche come Tjp1, stretto giunzione proteina 1) che ha mostrato la localizzazione delle ZO-1 alla membrana plasmatica indicando che le cellule hannoancora subire EMT (Figura 2A). Successivamente abbiamo effettuato immunocolorazione per α-tubulina (Figura 2B) in modo da osservare l&#39;organizzazione dei microtubuli espianti epicardici, che ha mostrato un allineamento polarizzata che facilita la migrazione direzionale delle cellule epicardici. Inoltre, per determinare il potenziale di differenziazione delle cellule epicardici, li coltivate per 6 giorni in un mezzo di differenziazione contenenti ricombinante TGF-β1. Immunocolorazione per la SMA ha dimostrato la differenziazione di successo di cellule epicardici in cellule muscolari lisce (Figura 2C). Infine, per analizzare la migrazione delle cellule dell&#39;epicardio-derivati ​​e EMT epicardico, abbiamo anche effettuato un test di gel di invasione di collagene. cellule epicardium di derivazione sono stati visualizzati da falloidina immunocolorazione. Successful migrazione di cellule derivate epicardio può essere visto in tutto il espianto (Figura 3A). Per determinare il dapprofondito lavoro di penetrazione delle cellule nella matrice di collagene, 3D-ricostruzione è stata generata da immagini confocale. Penetrazione di cellule derivate epicardio può essere visto in z-stack (Figura 3B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53993/53993fig1.jpg" /> . Figura 1: colture primarie di cellule epicardici da embrionali di topo Hearts campo chiaro Rappresentante (A) e RFP immunofluorescenza (B) immagini di cellule epicardial primarie generate da E12.5 Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + cuori. Immagine campo chiaro ed immunofluorescenza uniti (C). Relativi livelli di espressione di mRNA di marcatori epicardici (Tbx18 e WT1) e marcatore dei cardiomiociti (Nkx2.5) nelle cellule epicardial primarie (D). I risultati sono stati normalizzati per GAPDH espressione, e la<html> livelli di espressione relativi sono dati come una differenza volte rispetto all&#39;espressione Nkx2.5 (n = 3). I dati sono presentati come media ± SD. Barra di scala = 200 micron. *, P &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53993/53993fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53993/53993fig2.jpg" /> Figura 2: elementi primari epicardici mantengono la loro capacità di subire EMT e differenziazione Immunocolorazione su espianti epicardici per ZO-1 (A, verde) o α-tubulina (B, verde).. DAPI è stato utilizzato per visualizzare nuclei (blu). Cellule epicardici sono state differenziate in cellule muscolari lisce per 6 giorni e colorati con α-actina del muscolo liscio (SMA) (C, rosso). Barra di scala = 100 micron.3993fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53993/53993fig3.jpg" /> Figura 3:. Migrazione cellulare epicardici sulla superficie del gel del collageno ventricoli da embrioni E12.5 sono state coltivate su una matrice di gel di collagene tridimensionale e trattata con Alexa Fluor 488-phalloidin visualizzare migrazione cellulare epicardio derivato e penetrazione (A). Immagini confocali sono stati usati per costruire una immagine tridimensionale per determinare la penetrazione delle cellule lungo gli assi Z (B). Barra di scala = 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53993/53993fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

Coltura in vitro di cellule provenienti da epicardici Cuore embrionali di topo

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

7.3K Views.  Duke-NUS Graduate Medical School. The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells. 

Video: In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

Probing and Mapping Electrode Surfaces in Solid Oxide Fuel Cells

Solid oxide fuel cells (SOFCs) are potentially the most efficient and cost-effective solution to utilization of a wide variety of fuels beyond hydrogen 1-7. The performance of SOFCs and the rates of many chemical and energy transformation processes in energy storage and conversion devices in general are limited primarily by charge and mass transfer along electrode surfaces and across interfaces. Unfortunately, the mechanistic understanding of these processes is still lacking, due largely to the difficulty of characterizing these processes under in situ conditions. This knowledge gap is a chief obstacle to SOFC commercialization. The development of tools for probing and mapping surface chemistries relevant to electrode reactions is vital to unraveling the mechanisms of surface processes and to achieving rational design of new electrode materials for more efficient energy storage and conversion2. Among the relatively few in situ surface analysis methods, Raman spectroscopy can be performed even with high temperatures and harsh atmospheres, making it ideal for characterizing chemical processes relevant to SOFC anode performance and degradation8-12. It can also be used alongside electrochemical measurements, potentially allowing direct correlation of electrochemistry to surface chemistry in an operating cell. Proper in situ Raman mapping measurements would be useful for pin-pointing important anode reaction mechanisms because of its sensitivity to the relevant species, including anode performance degradation through carbon deposition8, 10, 13, 14 ("coking") and sulfur poisoning11, 15 and the manner in which surface modifications stave off this degradation16. The current work demonstrates significant progress towards this capability. In addition, the family of scanning probe microscopy (SPM) techniques provides a special approach to interrogate the electrode surface with nanoscale resolution. Besides the surface topography that is routinely collected by AFM and STM, other properties such as local electronic states, ion diffusion coefficient and surface potential can also be investigated17-22. In this work, electrochemical measurements, Raman spectroscopy, and SPM were used in conjunction with a novel test electrode platform that consists of a Ni mesh electrode embedded in an yttria-stabilized zirconia (YSZ) electrolyte. Cell performance testing and impedance spectroscopy under fuel containing H2S was characterized, and Raman mapping was used to further elucidate the nature of sulfur poisoning. In situ Raman monitoring was used to investigate coking behavior. Finally, atomic force microscopy (AFM) and electrostatic force microscopy (EFM) were used to further visualize carbon deposition on the nanoscale. From this research, we desire to produce a more complete picture of the SOFC anode.

We present a unique platform for characterizing electrode surfaces in solid oxide fuel cells (SOFCs) that allows simultaneous performance of multiple characterization techniques (e.g. in situ Raman spectroscopy and scanning probe microscopy alongside electrochemical measurements). Complementary information from these analyses may help to advance toward a more profound understanding of electrode reaction and degradation mechanisms, providing insights into rational design of better materials for SOFCs.

Probing e mapping superfici di elettrodo nelle celle di combustibile ad ossidi solidi

Solid oxide fuel cells (SOFCs) are potentially the most efficient and cost-effective solution to utilization of a wide variety of fuels beyond hydrogen ...

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Detection and Recovery of Palladium, Gold and Cobalt Metals from the Urban Mine Using Novel Sensors/Adsorbents Designated with Nanoscale Wagon-wheel-shaped Pores

Developing low-cost, efficient processes for recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals from urban mine remains a significant challenge in industrialized countries. Here, the development of optical mesosensors/adsorbents (MSAs) for efficient recognition and selective recovery of Pd(II), Au(III), and Co(II) from urban mine was achieved. A simple, general method for preparing MSAs based on using high-order mesoporous monolithic scaffolds was described. Hierarchical cubic Ia3d wagon-wheel-shaped MSAs were fabricated by anchoring chelating agents (colorants) into three-dimensional pores and micrometric particle surfaces of the mesoporous monolithic scaffolds. Findings show, for the first time, evidence of controlled optical recognition of Pd(II), Au(III), and Co(II) ions and a highly selective system for recovery of Pd(II) ions (up to ~95%) in ores and industrial wastes. Furthermore, the controlled assessment processes described herein involve evaluation of intrinsic properties (e.g., visual signal change, long-term stability, adsorption efficiency, extraordinary sensitivity, selectivity, and reusability); thus, expensive, sophisticated instruments are not required. Results show evidence that MSAs will attract worldwide attention as a promising technological means of recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals.

Because of the importance and extensive use of palladium, gold and cobalt metals in high-technology equipment, their recovery and recycling constitute an important industrial challenge. The metal recovery system described herein is a simple, low-cost means for the effective detection, removal, and recovery of these metals from the urban mine.

Rilevamento e recupero di palladio, oro e metalli di cobalto dalla miniera urbana Utilizzando novelli Sensori / Adsorbenti designate con nanoscala Wagon a forma di ruote pori

Developing low-cost, efficient processes for recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals from urban mine remains a significant challenge in ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly known as plasmonic effects, play an important role. Research in this field has, however, been impeded owing to the difficulty of fabricating devices containing the desired functional metal nanostructures. In order to provide a viable strategy to this issue, we herein show a transfer printing-based approach that allows the quick and low-cost integration of designed metal nanostructures with a variety of device architectures, including solar cells. Nanopillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS) stamps were fabricated from a commercially available nanohole plastic film as a master mold. On this nanopatterned PDMS stamps, Ag films were deposited, which were then transfer-printed onto block copolymer (binding layer)-coated hydrogenated microcrystalline Si (&#181;c-Si:H) surface to afford ordered Ag nanodisk structures. It was confirmed that the resulting Ag nanodisk-incorporated &#181;c-Si:H solar cells show higher performances compared to a cell without the transfer-printed Ag nanodisks, thanks to plasmonic light trapping effect derived from the Ag nanodisks. Because of the simplicity and versatility, further device application would also be feasible thorough this approach.

A viable transfer printing-based methodology to introduce plasmonic metal nanostructures in solar cells is described. Using nanopillar poly(dimethylsiloxane) stamps, an Ag-based ordered nanodisk array was integrated with standard hydrogenated microcrystalline Si solar cells, which led to improved device performances due to plasmonic light trapping.

Integrazione di luce Trapping Argento Nanostrutture in silicio microcristallino idrogenato celle solari tramite bonifico stampa

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

Printing Fabrication of Bulk Heterojunction Solar Cells and In Situ Morphology Characterization

Polymer-based materials hold promise as low-cost, flexible efficient photovoltaic devices. Most laboratory efforts to achieve high performance devices have used devices prepared by spin coating, a process that is not amenable to large-scale fabrication. This mismatch in device fabrication makes it difficult to translate quantitative results obtained in the laboratory to the commercial level, making optimization difficult. Using a mini-slot die coater, this mismatch can be resolved by translating the commercial process to the laboratory and characterizing the structure formation in the active layer of the device in real time and in situ as films are coated onto a substrate. The evolution of the morphology was characterized under different conditions, allowing us to propose a mechanism by which the structures form and grow. This mini-slot die coater offers a simple, convenient, material efficient route by which the morphology in the active layer can be optimized under industrially relevant conditions. The goal of this protocol is to show experimental details of how a solar cell device is fabricated using a mini-slot die coater and technical details of running in situ structure characterization using the mini-slot die coater.

Printing Fabrication of Bulk Heterojunction Solar Cells and In Situ Morphology Characterization

Here, we present a protocol to fabricate organic thin film solar cells using a mini-slot die coater and related in-line structure characterizations using synchrotron scattering techniques.

La stampa Fabbricazione di massa eterogiunzione celle solari e<em&gt; In Situ</em&gt; Morfologia Caratterizzazione

Polymer-based materials hold promise as low-cost, flexible efficient photovoltaic devices. Most laboratory efforts to achieve high performance devices ...

Fabrication of White Light-emitting Electrochemical Cells with Stable Emission from Exciplexes

The authors present an approach for fabricating stable white light emission from polymer light-emitting electrochemical cells (PLECs) having an active layer which consists of blue-fluorescent poly(9,9-di-n-dodecylfluorenyl-2,7-diyl) (PFD) and &#960;-conjugated triphenylamine molecules. This white light emission originates from exciplexes formed between PFD and amines in electronically excited states. A device containing PFD, 4,4&#39;,4&#39;&#39;-tris[2-naphthyl(phenyl)amino]triphenylamine (2-TNATA), Poly(ethylene oxide) and K2CF3SO3 showed white light emission with Commission internationale de l&#39;&#233;clairage (CIE) coordinates of (0.33, 0.43) and a Color Rendering Index (CRI) of Ra = 73 at an applied voltage of 3.5 V. Constant voltage measurements showed that the CIE coordinates of (0.27, 0.37), Ra of 67, and the emission color observed immediately after application of a voltage of 5 V were nearly unchanged and stable after 300 sec.

The authors present a method for fabricating stable white-light-emitting electrochemical cells utilizing emission from exciplexes formed between a blue-emitting fluorene polymer and aromatic amines.

Fabbricazione di White Light-emitting cellule elettrochimiche con emissione stabile da ecciplessi

The authors present an approach for fabricating stable white light emission from polymer light-emitting electrochemical cells (PLECs) having an active ...

In Situ Monitoring of the Accelerated Performance Degradation of Solar Cells and Modules: A Case Study for Cu(In,Ga)Se2 Solar Cells

The levelized cost of electricity (LCOE) of photovoltaic (PV) systems is determined by, among other factors, the PV module reliability. Better prediction of degradation mechanisms and prevention of module field failure can consequently decrease investment risks as well as increase the electricity yield. An improved knowledge level can for these reasons significantly decrease the total costs of PV electricity. 
In order to better understand and minimize the degradation of PV modules, the occurring degradation mechanisms and conditions should be identified. This should preferably happen under combined stresses, since modules in the field are also simultaneously exposed to multiple stress factors. Therefore, two 'Combined Stress test with in situ measurement' setups have been designed and constructed. These setups allow the simultaneous use of humidity, temperature, illumination, and electrical biases as independently controlled stress factors on solar cells and minimodules. The setups also allow real-time monitoring of the electrical properties of these samples. This protocol presents these setups and describes the experimental possibilities. Moreover, results obtained with these setups are also presented: various examples about the influence of both deposition and degradation conditions on the stability of thin film Cu(In,Ga)Se2 (CIGS) as well as Cu2ZnSnSe4 (CZTS) solar cells are described. Results on the temperature dependency of CIGS solar cells are also presented.

In Situ Monitoring of the Accelerated Performance Degradation of Solar Cells and Modules: A Case Study for CuIn,GaSe2 Solar Cells

Two &#39;Combined Stress test with in situ measurement&#39; setups, which allow real-time monitoring of accelerated degradation of solar cells and modules, were designed and constructed. These setups allow the simultaneous use of humidity, temperature, electrical biases, and illumination as independently controlled stress factors. The setups and various experiments executed are presented.

In Situ Monitoraggio del degrado prestazioni accelerate di celle e moduli solari: un caso di studio per le celle solari di Cu (In, Ga) Se2

The levelized cost of electricity (LCOE) of photovoltaic (PV) systems is determined by, among other factors, the PV module reliability. Better prediction ...

Fabrication of Ultra-thin Color Films with Highly Absorbing Media Using Oblique Angle Deposition

Ultra-thin film structures have been studied extensively for use as optical coatings, but performance and fabrication challenges remain.&#160; We present an advanced method for fabricating ultra-thin color films with improved characteristics. The proposed process addresses several fabrication issues, including large area processing. Specifically, the protocol describes a process for fabricating ultra-thin color films using an electron beam evaporator for oblique angle deposition of germanium (Ge) and gold (Au) on silicon (Si) substrates.&#160; Film porosity produced by the oblique angle deposition induces color changes in the ultra-thin film. The degree of color change depends on factors such as deposition angle and film thickness. Fabricated samples of the ultra-thin color films showed improved color tunability and color purity. In addition, the measured reflectance of the fabricated samples was converted into chromatic values and analyzed in terms of color. Our ultra-thin film fabricating method is expected to be used for various ultra-thin film applications such as flexible color electrodes, thin film solar cells, and optical filters. Also, the process developed here for analyzing the color of the fabricated samples is broadly useful for studying various color structures.

We present a detailed method for fabricating ultra-thin color films with improved characteristics for optical coatings. The oblique angle deposition technique using an electron beam evaporator allows improved color tunability and purity. Fabricated films of Ge and Au on Si substrates were analyzed by reflectance measurements and color information conversion.

Fabbricazione di film ultra-sottile di colore con altamente assorbente Media mediante deposizione di angolo obliquo

Ultra-thin film structures have been studied extensively for use as optical coatings, but performance and fabrication challenges remain.&#160; We present ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic glasses (MGs). Despite their amorphous nature, the identification of hyperfine interactions unveils faint structural modifications. For this purpose, we have employed two techniques that utilize nuclear resonance among nuclear levels of a stable 57Fe isotope, namely M&#246;ssbauer spectrometry and nuclear forward scattering (NFS) of synchrotron radiation. The effects of heat treatment upon (Fe2.85Co1)77Mo8Cu1B14 MG are discussed using the results of ex situ and in situ experiments, respectively. As both methods are sensitive to hyperfine interactions, information on structural arrangement as well as on magnetic microstructure is readily available. M&#246;ssbauer spectrometry performed ex situ describes how the structural arrangement and magnetic microstructure appears at room temperature after the annealing under certain conditions (temperature, time), and thus this technique inspects steady states. On the other hand, NFS data are recorded in situ during dynamically changing temperature and NFS examines transient states. The use of both techniques provides complementary information. In general, they can be applied to any suitable system in which it is important to know its steady state but also transient states.

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Here, we present a protocol to describe ex situ and in situ investigations of structural transformations in metallic glasses. We employed nuclear-based analytical methods which inspect hyperfine interactions. We demonstrate the applicability of M&#246;ssbauer spectrometry and nuclear forward scattering of synchrotron radiation during temperature-driven experiments.

Metodi di Ex Situ ed In Situ indagini sulle trasformazioni strutturali: il caso di cristallizzazione dei vetri metallici

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

Label-Free Imaging di singole proteine secernuto dalle cellule viventi tramite iSCAT microscopia

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, wound healing, root canal treatment, etc., forming a new research field named plasma medicine. Being a mixture of electrical, chemical, and biological reactive species, CAPs have shown their abilities to enhance nerve stem cells differentiation both in vitro and in vivo and are becoming a promising way for neurological disease treatment in the future. The much more exciting news is that using CAPs may realize one-step, and safely directed, differentiation of neural stem cells (NSCs) for tissue transportation. We demonstrate here the detailed experimental protocol of using a self-made CAP jet device to enhance NSC differentiation in C17.2-NSCs and primary rat neural stem cells, as well as observing the cell fate by inverted and fluorescence microscopy. With the help of immunofluorescence staining technology, we found both the NSCs showed an accelerated differential rate than the untreated group, and ~75% of the NSCs selectively differentiated into neurons, which are mainly mature, cholinergic, and motor neurons.

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

This protocol aims to provide detailed experimental steps of a cold atmospheric plasma treatment on neural stem cells and immunofluorescence detection for differentiation enhancement.

Differenziazione delle cellule staminali nervose di un One-Step Plasma atmosferico freddo trattamento In Vitro

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...