Vorremmo ringraziare Andrea Portbury per la lettura critica del manoscritto, il microscopio Servizio Laboratorio di UNC per l&#39;assistenza con il time-lapse imaging, e il NIH (borsa # R01HL061656) per il supporto finanziario.

1. Preparare Beads anticorpi coniugati <ol><li> Un giorno prima della dissezione, unire l&#39;anticorpo di scelta con le Dynabeads appropriate (ad esempio ratto IgG Dynabeads per un anticorpo cresciuto in ratto, 4 x 10 8 perline / ml) per le istruzioni del produttore. Per il BD ratto anti-CD31 anticorpo (0,5 mg / mL, per isolare le cellule endoteliali), è aggiunto 3 anticorpo microlitri per ogni 25 microlitri perline, per una concentrazione finale di 1,5 mg anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 7 perline / 25 microlitri di buffer. </li><li> Incubare perline e anticorpi notte a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparazione del pannello di collagene <ol><li> Cellule isolate formano tubuli più rapidamente quando coltivate su un gel di collagene rispetto al solo una piastra rivestita di collagene. Pertanto, gel di collagene sono fatte la notte prima della dissezione, come descritto al punto 6. Sul ghiaccio in una cappa di coltura tissutale, combinare i seguenti reagenti (sufficiente per 19 pozzetti): 206,4 ml sterile H &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 microlitri collagene di tipo I (4,08 mg / ml), 38,4 microlitri 10x M199, e 1,15 microlitri 5 M NaOH. </li><li> Pipettare 20 ml di gel di collagene presente nei pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 384 pozzetti. Porre la piastra in una ° C di coltura tissutale incubatore 37 per 30 min. </li><li> Aggiungere 80 microlitri DMEM a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a 37 ° C. Rimuovere il terreno di coltura e ripetere altre due volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo risciacquo, aggiungere 80 microlitri 10% FBS / DMEM a ciascun pozzetto e incubare una notte a 37 ° C. Rimuovere il mezzo di coltura prima di aggiungere le cellule isolate. </li></ol> 3. Accise e digerire il Cuore <ol><li> Eutanasia di un mouse timed-incinta al giorno embrionale desiderato utilizzando una tecnica di eutanasia approvato. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of North Carolina a Chapel Hill. </li><li> Con il mouse in posizione supina, liberalmente spruzzare il lato ventrale della femmina con il 70% di etanolo primadissezione. Utilizzando pinze per sollevare la pelle addominale inferiore e muscolo, allontanandosi dagli organi interni, tagliare aprire cavità inferiore addominale della femmina di visualizzare gli organi interni. </li><li> Tenendo il collo dell&#39;utero con una pinza, tagliare con cura caudale per la pinza e iniziare il sollevamento del corno uterino dalla cavità addominale. Mentre si solleva il corno uterino, tagliare qualsiasi tessuto connettivo che tiene il corno a posto. Per finire ablazione del corno uterino, tagliare il nodo del corno uterino con l&#39;ovidotto per liberare il corno uterino. </li><li> Collocare il corno uterino in una capsula di Petri contenente freddo 1x tampone fosfato salino (PBS) e sciacquare come necessario. Tagliare il corno uterino attraverso la linea mediana per esporre i sacchi embrionali allegati. </li><li> Tagliare un sacco embrionale all&#39;incrocio tra la placenta e l&#39;embrione di evitare accidentalmente tagliare l&#39;embrione e recuperare un embrione. Posizionare l&#39;embrione in una seconda capsula di Petri con PBS freddo. Riportare la capsula di Petri con il corno uterino di ghiaccio. </li><li> Decapitate l&#39;embrione per migliorare l&#39;accesso alla parete toracica. Se genotipizzazione è necessario, tagliare la coda per rimuoverla e salvare in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio. </li><li> Con l&#39;embrione sul dorso, tagliare aprire la parete toracica per visualizzare il cuore e polmoni. Per evitare di tagliare il cuore, fare un taglio verticale lungo il lato della gabbia toracica, vicino a una zampa anteriore, seguito da un taglio orizzontale attraverso la parte inferiore delle costole, poi estrarre delicatamente la parete toracica e fuori del modo. Attraverso circa embrionale giorno 13.5, la parete toracica è trasparente, aiutando nella visualizzazione. </li><li> Sollevare delicatamente il cuore con pinze e tagliare i vasi sotto. Quindi, tagliare sopra i grandi vasi di liberare il cuore. Se i vasi polmonari non sono tagliati, i polmoni possono essere rimossi con il cuore. Così, eliminano tessuti estranei, come i polmoni, se necessario. </li><li> Separare e scartare i vasi atri e grande dai ventricoli. Utilizzando le forbici, tritare i ventricoli in piccoli pezzi (circa 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) e il luogo in circa 500 ml di collagenasi (1 mg / ml in PBS sterile). Conservare i campioni in ghiaccio fino a quando tutti i ventricoli sono stati macinati e messi in collagenasi. </li><li> Ripetere i passaggi precedenti fino a quando i ventricoli sono stati rimossi da tutti gli embrioni, raccogliendo ogni cuore in un tubo Eppendorf separata. Se tutti gli embrioni hanno lo stesso genotipo, i cuori possono essere raggruppati in un unico tubo Eppendorf. Il numero di campioni trattati in una sola volta può essere limitato in base al magnete utilizzato per l&#39;isolamento, la DynaMag (123-21D), qui usato in possesso di un massimo di 16 provette Eppendorf. </li><li> Posizionare i ventricoli tritate a 37 ° C con dondolo per 45 min. Ogni 15 minuti, rimuovere delicatamente il campione e pipettare su e giù per dissociare meccanicamente le cellule. </li></ol> 4. Isolando le cellule endoteliali <ol><li> Far passare la soluzione ventricolo-collagenasi attraverso un 70 micron filtro per rimuovere macchie residue di cellule. </li><li> Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min. Scartareil surnatante, sostituire con circa 200 ml 10% FBS in DMEM, e pipettare su e giù per dissociare le cellule. </li><li> Ripetere il passaggio precedente una volta. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min dopo il secondo 10% FBS / DMEM lavaggio. Risospendere le cellule in 50 microlitri 10% FBS / DMEM. </li><li> Durante la fase di centrifugazione finale, preparare le perline. <ol><li> Porre il tubo Eppendorf contenente l&#39;anticorpo e perline su un magnete per 1 min. </li><li> Con il tubo in posizione sul magnete, rimuovere il surnatante. Togliere la provetta dal magnete e aggiungere circa 100 ml 10% FBS / DMEM. </li><li> Posizionare il tubo sul magnete per 1 min. Rimuovere il surnatante, e lavare ancora con 10% FBS / DMEM. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere le sfere di anticorpi coniugati a 10% FBS / DMEM (5 ml per campione). </li></ol></li><li> Per ciascun campione cellulare, aggiungere 5 ml di perline anticorpo-coniugate. Posizionare le sospensioni bead-cell a 4 ° C con dondolo for 30 min. </li><li> In una cappa a flusso laminare, posizionare le provette Eppendorf contenenti cellule e perline anticorpi coniugati sul magnete per 1 min. Eliminare il surnatante, togliere i tubi dal magnete, e lavare con circa 100 l 10% FBS / DMEM. Ripetere l&#39;operazione per 5 lavaggi. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, posizionare i tubi sul magnete per 1 min, rimuovere il supernatante, e rimuovere i tubi dal magnete. Aggiungere circa 100 microlitri DMEM. </li><li> Porre i tubi sul magnete per 1 min, rimuovere il supernatante, e rimuovere i tubi dal magnete. Aggiungere 100-200 ml preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA. Incubare i campioni a 37 ° C e 5% di CO 2 per 5 min. </li><li> Posizionare i tubi sul magnete per 2 min. Trasferire accuratamente il supernatante contenente cella per provette Eppendorf. Centrifugare per 5 min a 400 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 80-100 microlitri mezzo di crescita e piatto in un 96 - o 384 pozzetti piatto di coltura trattata, a seconda del rendimento atteso(Circa 450-600 cellule dai ventricoli del E14.5-E16.5 embrioni). Per le cellule endoteliali, utilizzare endoteliale coltura mezzo di crescita (definito di seguito). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Lavorare con le cellule embrionali primarie consente nuovi esperimenti per affrontare in fasi critiche dello sviluppo in vitro. Tuttavia, la procedura di isolamento non è banale. Passaggi critici per isolare qualsiasi tipo di cellule comprendono assicurare che le cellule sono ben separati su digestione collagenasi e poi che siano ben sospesi durante le fasi di lavaggio. Dissezione meccanica pipettando aiuta notevolmente separare le cellule durante la fase di collagenasi, e la fase di filtraggio rimuove grumi di cellule. Questi passaggi migliorano la purezza della popolazione e la resa. La densità di placcatura è anche un problema significativo quando isolare cellule da un piccolo organo. Perché endoteliale tubo-formazione dipende dalla densità cellulare 7, ci siamo basati su piastre di coltura di tessuti da 384 pozzetti per aumentare la nostra densità di placcatura. Anche con questa considerazione, abbiamo dovuto modificare alcune analisi per ospitare una densità cellulare inferiore (Dyer e la Patterson, in proGress). Così, se il numero delle cellule è una preoccupazione, una cultura di dimensioni più ridotte e può diminuire il problema. Un&#39;altra limitazione di isolare cellule primarie è la specificità dell&#39;anticorpo. Anche una proteina endoteliale specifico riconosciuto come CD31 volte è espresso da fibroblasti 8. Se il numero di cellule raccolte consente FAC ordinamento invece, allora le cellule endoteliali e fibroblasti potevano essere separati dalla intensità di fluorescenza. Tuttavia, una recente analisi di smistamento FAC di cellule endoteliali embrionali richiesto quattro intere E10.5 embrioni per produrre cellule endoteliali sufficiente per l&#39;estrazione di mRNA, suggerendo che questa tecnica, anche se potente, può non essere appropriato per gli organi minori 9. Così, se FAC ordinamento non è fattibile, altre tecniche possono essere impiegate per migliorare la purezza popolazione. Un processo di selezione in due fasi, in cui le cellule sono positivamente selezionate da un anticorpo e quindi negativamente selected dalla mancata legarsi ad un secondo anticorpo, è un approccio alternativo. Il marcatore fibroblasti specifico FSP-1 sarebbe un candidato particolare 10. In alternativa, il mezzo di coltura può essere ordinato senza L-valina, e D-valina può essere aggiunto preferibilmente; fibroblasti sono in grado di utilizzare D-valina e pertanto non sopravvivono 11,12. Nonostante questi limiti e preoccupazioni, studiando le popolazioni di cellule embrionali primari consente una dettagliata analisi in vitro dei processi di sviluppo. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi organo o regione dell&#39;embrione e permette un tipo cellulare da confrontare tra i diversi stadi embrionali. Con la scala appropriato, anche molto piccole popolazioni di cellule primarie possono essere ottenuti e analizzati. Queste analisi forniscono informazioni significative in quanto specifici sottoinsiemi di cellule si comportano e cambiano nel tempo.

L&#39;avvento di linee cellulari immortalizzate ha rivoluzionato la biologia cellulare di base 1. Le linee cellulari attualmente disponibili sono derivati ​​da una vasta gamma di organi e comprendono tutti i principali tipi di cellule. Tuttavia, le linee cellulari stabilizzate hanno alcune limitazioni. Il processo di immortalizzazione ovviamente cambia il comportamento delle cellule, in particolare rispetto alla durata di vita e la proliferazione, ma può anche influenzare l&#39;espressione di proteine ​​imprevisti, come le proteine ​​citoscheletriche 2. Inoltre, anche se molte linee cellulari differenti sono disponibili, vi è diversità significativa tra anche un singolo tipo di cellula all&#39;interno un intero organismo. Le cellule endoteliali in particolare mostrano comportamenti diversi in base al fatto che la linea arterie o vene e che tipo di flusso è presente nel recipiente 3. Ancor più pressante da una prospettiva evolutiva, tuttavia, è che la stragrande maggioranza delle linee cellulari disponibili sono derivati ​​da tessuti adulti (vedi, ad esempio tegli collezione disponibile tramite ATCC). Queste linee cellulari adulte probabilmente non ricapitolano la natura dinamica dei loro precursori embrionali. La rapida evoluzione spazio-temporali pattern di espressione genica osservati durante lo sviluppo suggeriscono anche che una cellula endoteliale da un organo in un determinato stadio di sviluppo non può comportarsi allo stesso modo di una cellula endoteliale, da quello stesso organo, in una fase di sviluppo diverso. Come alternativa all&#39;utilizzo di linee cellulari immortalizzate disponibili in commercio, cellule primarie possono essere isolate dal tessuto specifico di interesse. Tra i vantaggi di questa tecnica, queste cellule primarie possono essere isolati da un organo specifico o anche parte di un organo in qualsiasi stadio di sviluppo specifico. Inoltre, queste cellule primarie possono essere isolati dalla grande varietà di animali transgenici disponibili, permettendo lo studio in vitro del gene knockout e knock-in, evitando altri problemi come l&#39;efficienza di trasfezione. Non sorprende che moltitecniche sono stati pubblicati in dettaglio come isolare specifici tipi di cellule 4,5. In generale, queste tecniche implicano la raccolta della regione di interesse, dissociare le cellule, tagging il tipo cellulare specifico di interesse, e isolando quelle celle per ulteriori analisi. Per studiare una popolazione precoce embrionale delle cellule endoteliali coronariche, abbiamo ridimensionato una tecnica 4 precedentemente pubblicato per l&#39;uso con un organo più piccolo. Con questa procedura in scala ridotta, possiamo isolare le cellule endoteliali coronariche dal cuore embrionale in stadi embrionali specifici. Queste cellule possono quindi essere utilizzate in saggi tradizionali endoteliali, quali le analisi di migrazione. Fino ai primi di linee cellulari embrionali sempre più frequentemente, lavorando con le cellule primarie è una tecnica di inestimabile.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Timed-pregnant mice</td><td></td><td></td><td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, type I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium</td><td>(made in lab as described in notes)</td><td></td><td>DMEM containing 20% FBS, 5 &amp;mu;M &amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol, 50 &amp;mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Biomedical Technologies, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>384-well culture plate</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;; working surface area 10 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Used as directed in &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Table-top centrifuge</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

Coltura cellulare ha notevolmente migliorato la nostra capacità di valutare le singole popolazioni di cellule in condizioni di coltura miriade. Mentre le linee cellulari immortalizzate offrono vantaggi significativi per la loro facilità di utilizzo, queste linee cellulari non sono disponibili per tutti i potenziali tipi di cellule. Isolando cellule primarie di una regione di interesse, in particolare da un topo transgenico, studi più sfumate possono essere eseguite. La tecnica di base consiste dissezione dell&#39;organo o organo parziale di interesse (ad esempio il cuore o una regione specifica del cuore) e dissociare l&#39;organo di singole cellule. Queste cellule vengono poi incubate con perline magnetiche coniugate ad un anticorpo che riconosce il tipo cellulare di interesse. Le cellule di interesse possono quindi essere isolati con l&#39;uso di un magnete, con una breve incubazione tripsina dissociare le cellule dalle perline. Queste cellule isolate possono essere coltivate e analizzati come desiderato. Questa tecnica è stata originariamente progettata per adulto organo del mouses ma può essere facilmente ridotta per uso con organi embrionali, come dimostrato qui. Poiché il nostro interesse è nel sistema vascolare coronarico di sviluppo, abbiamo voluto studiare questa popolazione di cellule durante le fasi embrionali specifici. Così, il protocollo originale ha dovuto essere modificata per essere compatibile con le piccole dimensioni dei ventricoli embrionali e la bassa resa potenziale delle cellule endoteliali in queste fasi di sviluppo. Utilizzando questo approccio in scala ridotta, abbiamo valutato coronarica plesso rimodellamento ventricolare in cellule endoteliali embrionali transgeniche.

Utilizzando un anticorpo specifico per endoteliale che riconosce CD31, le cellule endoteliali sono state isolate dai ventricoli del embrionali (E) 13.5 (Figura 1A) e 18,5 (Figure 1B-1D) embrioni. Quando cresciuto su un piatto di coltura trattata, queste cellule rimangono arrotondate e formerebbero un pattern di ciottoli se vicino confluenti (Figura 1A). Diluire il collagene è stato utilizzato anche per rivestire i pozzetti, e mentre le cellule endoteliali aderirà ad esso (Figura 1B), formano meno rispetto a quando le catene placcato su un gel di collagene (Figure 1C e 1D). Cellule endoteliali coltivate in un pozzetto contenente un gel di collagene (Figure 1C e 1D) interazioni cellula-cellula forma e catene di forma che iniziano ad espandersi quando coltivate su collagene, e questo processo si verifica più veloce quando coltivati ​​in gel di collagene rispetto al collagene rivestite piastra. Queste catene endoteliali etichettano positivamente con il marcatore endoteliale iso-lectina ( <strong&gt; Figura 1D). Le cellule isolate sopravvivono fino a 1 settimana in coltura ma hanno dimostrato resistente alla tripsinizzazione (anche dopo 1 ora a 37 ° C), quindi, sono più adatti per esperimenti terminali. Cellule endoteliali isolate da E18.5 ventricoli etichettano positivamente con PECAM (Figura 2A) e Flk1 (Figura 2B). Inoltre, vivono le cellule endoteliali isolate possono essere etichettati con il colorante endoteliale specifico fluorescente Syto-16. Figura 2D mostra cellule endoteliali che sono state isolate dai ventricoli di un E14.5 embrione ed etichettati con Syto-16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50463/50463fig1.jpg" /> Figura 1. Le cellule endoteliali isolate da ventricoli embrionali del mouse formare catene quando coltivate su un gel di collagene. (A) Brightfield immagine 10x di isolati ventricolari cellule endoteliali dal vivo da un E13.5 cuore grown su un piatto di coltura trattata, anche dopo 48 ore, le cellule rimangono arrotondati (B) Brightfield immagine 10x di isolati ventricolari cellule endoteliali fissi da un cuore E18.5 cresciuto su un piatto rivestito di collagene;. dopo 24 ore, alcune cellule hanno cominciato allungamento (freccia), ma la maggior parte di loro rimangono arrotondato (punta di freccia). (C, D) le immagini confocale ventricolari isolate cellule endoteliali fissi da un E18.5 cuore coltivate su un gel di collagene, mostrata in campo chiaro (C), ed etichettate con iso -lectina (rosso). Frecce indicano alcune delle cellule lectina-positivi. Barre di scala in CD = 50 micron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50463/50463fig2.jpg" /> Figura 2. Le cellule endoteliali isolate da ventricoli embrionali del mouse etichettano positivo per i marcatori endoteliali. (AC) le immagini confocale (40x) di isolati ventricolari cellule endoteliali fissi da un E18.5 cuore coltivate suun piatto di collageno-rivestito. Queste cellule etichettano positivamente per PECAM (A) e FLK-1 (B), il controllo negativo (C) non mostra fluorescenza. In AC, i nuclei sono etichettati con DAPI (blu). (D) Fluorescent overlay (10x) di isolati ventricolari cellule endoteliali dal vivo da un cuore E14.5 cresciuto su un gel di collagene. Le cellule sono state incubate con il marcatore endoteliale vivo Syto-16 (verde), e la migrazione è stata osservata tramite microscopia time-lapse.

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Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Biologia dello sviluppo

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Neuroscienze

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

Isolamento delle cellule endocartali e coronarie dal muro libero ventricolare del cuore di ratto

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...