Gli autori ringraziano Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge per la lettura critica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge aiuto per scattare foto e Pauline Formaglio per l&#39;insegnamento imaging in vivo di sporozoite motilità nella pelle del mouse. Vorremmo anche ringraziare Marek Szatanik e il Centro di Produzione e infezione di Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) per l&#39;allevamento di zanzare. Questo studio è stato sostenuto dal Fondo AXA Ricerca e fondi dal Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Biologia Integrativa di Emerging Infectious Diseases&quot; (Grant no. ANR-10-LabX-62-IBEID).

<html> Tutte le procedure sono state approvate dal comitato dell&#39;Istituto Pasteur e dal Comitato Etico locale sulla sperimentazione animale (comitato etico IDF-Paris 1, Paris, France; numero di contratto: 2.012-0.015) ed eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti applicabili. 1. Materiali e reagenti <ol><li> Utilizzare femmina Anopheles zanzare stephensi (ceppo Sda500) che si nutrono di topi infetti 3-5 giorni dopo la nascita e posteriore come descritto in precedenza 21. </li><li> Utilizzare i parassiti Plasmodium berghei ANKA clone che esprime il gene Green Fluorescent Protein (GFP) sotto il controllo del costitutiva Heat Shock Protein 70 (HSP70) promotore. Questo produce fluorescenza durante tutto il ciclo di vita del parassita 22. </li><li> topi C57BL / 6JRj uso femminile (7 settimane di età). Nota: Tutti i reagenti utilizzati nel protocollo descritto sono elencati nella T in grado di Materiali / attrezzature. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radiation-attenuato sporozoite isolamento dalla zanzara ghiandole salivari <ol><li> Tra 18-25 giorni dopo il pasto di sangue infetto, raccogliere e freddo anestetizzare le zanzare in una provetta da 15 ml su ghiaccio come descritto in precedenza 21. trasferirli attenzione su un piatto Petri invertendo la provetta. Mantenere gli insetti su ghiaccio ed esporre le zanzare ad una dose 12 krad di γ- o x-irradiazione. </li><li> Isolare sporozoiti attenuati da irradiati ghiandole salivari delle zanzare come descritto in precedenza 21. Raccogliere ghiandole salivari infetti in un piccolo volume (circa 15 ml) di tampone fosfato salina di 1x Dulbecco (DPBS) su ghiaccio e delicatamente schiacciare loro di rilasciare sporozoiti. NOTA: L&#39;iniezione di una sospensione parassita altamente concentrata in un piccolo volume essere critico, è quindi essenziale per raccogliere un numero sufficiente di ghiandole salivari da un elevato numero di preselezionati zanzare ben infette, come dimostra il loro robusta espressioneverde-fluorescenza. </li><li> Filtrare la sospensione sporozoite attraverso un tappo colino cella 35 micron atto ad un&#39;adesione 1,5 tubo partire ml microcentrifuga per eliminare grumi e detriti zanzara. </li><li> Contare il numero totale di sporozoiti isolate come precedentemente descritto 21 e regolare la concentrazione della sospensione parassita freddo 1x DPBS avere 83.000 sporozoiti / microlitro. Conservare i parassiti sul ghiaccio, pur continuando i prossimi passi. </li><li> Raccogliere il numero equivalente di ghiandole salivari di zanzare infette che verranno utilizzati come controllo negativo e processano il campione come descritto nei punti 2.2 e 2.3. Diluire il campione come indicato sopra per ottenere analoga concentrazione di estratti ghiandole salivari nella sospensione. NOTA: sporozoiti possono essere memorizzati su ghiaccio per un massimo di 2 ore. Tuttavia, idealmente vengono iniettati nel giro di un&#39;ora dopo la pigiatura delle ghiandole salivari. </li></ol> 3. L&#39;iniezione di sporozoiti nella Dermal Layer del Ear <ol><li> Anestetizzare animali mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) della miscela. Attendere 5-8 minuti per il mouse di essere in uno stato di incoscienza e applicare pomata oftalmica per gli occhi per evitare l&#39;essiccazione della cornea. Valutare la profondità di anestesia eseguendo un pizzico punta dolce su entrambi i piedi posteriori. NOTA: La dose di anestesia dura meno di 20 minuti, in modo che i prossimi passi deve essere fatto in fretta. </li><li> Stabilizzare il padiglione auricolare del mouse fissando il lato ventrale con nastro adesivo trasparente precedentemente posto sotto uno stereomicroscopio (Figura 1A). Premere delicatamente l&#39;orecchio per evitare danni del sistema vascolare. </li><li> Caricare un / 35 gauge smussato 10 microlitri siringa con 0,6 ml di parassiti risospese 10. </li><li> Consegnare la sospensione sporozoite in 4 siti di iniezione (0,15 ml per sito) inserendo con cautela l&#39;ago sul lato dorsale dell&#39;orecchio (Figura 1A), sotto l&#39;epidermide, conlo smusso up, avendo cura di evitare i vasi sanguigni. Lasciare l&#39;ago di rimanere nel derma per pochi secondi per impedire il riflusso del injectant prima di rimuoverla. Osservare una papula caratteristico ciascun sito di iniezione al termine della procedura (Figura 1B e 1C). </li><li> Dopo l&#39;iniezione, rimuovere con attenzione l&#39;orecchio dal nastro. </li><li> Iniettare dell&#39;orecchio controlaterale con la stessa dose di parassiti seguendo la procedura 3,2-3,4. </li><li> Iniettare 2 topi supplementare sia con 0,6 ml di 1x DPBS o 0,6 ml di 1x DPBS + estratto di ghiandola salivare dalle zanzare infettate per valutare la risposta infiammatoria mediata dalla sola iniezione e la deposizione di materiale zanzare nel derma. </li><li> Monitorare il recupero del mouse dall&#39;anestesia prima di metterlo nuovamente dentro la gabbia. NOTA: La deposizione sporozoite corretta nella pelle può essere monitorato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2A e 2B), Il mouse che viene preparato come descritto previsously 23. </li></ol> 4. Pelle e drenante dissezione linfonodale <ol><li> Preparare mezzo standard (SM) come segue: Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) supplementato con 400 U / ml di collagenasi e 50 ug / ml deossiribonucleasi (DNasi) . </li><li> Preparare due 6 piastre di coltura dei tessuti ben a fondo piatto sul ghiaccio con 4,5 ml di SM + 70 micron cella filtro per bene per i campioni DLN (tavola A) e 4,5 ml di SM per bene per i campioni di pelle (piastra B). </li><li> Al punto di tempo desiderato dopo l&#39;inoculazione sporozoite, profondamente anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) miscela prima dislocazione cervicale. Assicurarsi che il mouse dimostra segni di morte clinica e iniziare subito la dissezione. NOTA: La cinetica di reclutamento delle cellule mieloidi possono essere esaminate in tempi diversi dopo injessione (cioè 2 ore, 4 ore e 24 ore come descritto in precedenza 14). </li><li> Disinfettare l&#39;orecchio inoculato e la regione del collo corrispondente con il 70% di etanolo per ridurre la possibilità di contaminazione. </li><li> Utilizzando forbici e pinze sterili, in modo asettico sezionare il prossimale auricolare DLN senza raccogliere il grasso circostante. Eseguire una prima incisione nel solco giugulo-carotidian e rimuovere i peli dal campo operatorio. Stretch l&#39;incisione con 2 pinze per esporre il DLN che appare grigio rispetto al tessuto circostante. </li><li> Pizzicare i tessuti connettivi attenzione sulla parte superiore del DLN con una pinza per facilitarne la rimozione. Estrarre il DLN mettendo una pinza sotto il tessuto linfoide (Figura 3A e 3B). Posizionare il DLN in un pozzo contenente colino cella 4,5 ml SM + 70 micron (tavola A). </li><li> Raccolto l&#39;intero orecchio inoculato usando forbici affilate sterili e pinze (Figura 4A). Separmangiato gli aspetti dorsale e ventrale dell&#39;orecchio da pizzicare e distanziare il taglio termina con due pinze (Figura 4B - 4E). Mettetele in un pozzo contenente 4,5 ml di SM (tavola B) assicurandosi che entrambi i tessuti sono completamente immersi nel mezzo. NOTA: Al fine di migliorare l&#39;affidabilità dell&#39;esperimento e aumentare il numero di cellule di interesse, pool 2 iniettato orecchie o 2 dLNs dallo stesso animale per campione. </li><li> Raccolta e processo in parallelo le orecchie e dLNs di topi inoculati sia con 1x DPBS o estratti delle ghiandole salivari. Include 2 ulteriori campioni per le orecchie e linfonodali raccolte da un mouse ingenuo per i controlli di compensazione colorazione negativa e singole. </li></ol> 5. isolamento delle cellule da linfonodi <ol><li> Incubare i linfonodi (tavola A) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 15 minuti sotto agitazione. Aggiungere etilendiamminotetraacetico 10 mM finale (EDTA) per pozzetto per neutralizzare collagenasi e DNase actività. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio. </li><li> Dissociare linfonodi utilizzando l&#39;estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi. </li><li> Risciacquare il filtro delle cellule due volte con 500 ml DPBS 1x + 2% di siero fetale bovino (FBS) + 2mM EDTA. Trasferire intero volume del pozzetto in una provetta da 15 ml. </li><li> Lavare il ben due volte con 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 15 ml. Mantenere i tubi in ghiaccio. </li></ol> 6. isolamento delle cellule dalla pelle del Ear <ol><li> Incubare i volantini per le orecchie (tavola B) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 1 ora sotto agitazione. NOTA: Dopo 20 min di incubazione, tagliare i volantini per le orecchie con le forbici in piccoli pezzi per facilitare la digestione dei tessuti e mettere il campione di nuovo in incubatrice per il restante 40 min. Singole cellule possono essere osservati in mezzo al termine del tempo di incubazione. </li><li> Aggiungere 10 mM finale<html> EDTA per pozzetto per neutralizzare le attività collagenasi e DNasi. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio. </li><li> Trasferire i frammenti di tessuto dell&#39;orecchio e l&#39;intero volume del mezzo in un nuovo pozzo contenente un filtro cella 70 micron con una pipetta 1 ml. Tagliare 2 a 3 mm dall&#39;estremità della punta per raccogliere i frammenti di tessuto dell&#39;orecchio più facilmente. </li><li> Dissociare frammenti di tessuto dell&#39;orecchio con l&#39;estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi. </li><li> Lavare le cellule due volte con filtri 500 DPBS microlitri 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Trasferire l&#39;intero volume del pozzo in 50 ml-tubo attraverso un colino cella 70 micron. </li><li> Risciacquare pozzo con 500 microlitri 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 50 ml. Mantenere la provetta in ghiaccio. NOTA: Le diverse fasi di isolare cellule totali dalla pelle e tessuti DLN sono riassunti nella Figura 5. </li></ol>title &quot;&gt; 7. Conte e la vitalità delle cellule raccolte <ol><li> Centrifugare la pelle e campioni DLN per 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Raccogliere un piccolo volume di ogni campione per contare il numero totale di cellule isolate dalla pelle e DLN con un emocitometro. Aggiungere 0,04% trypan blu per determinare la vitalità cellulare. </li></ol> 8. Blocco di non antigene-specifica Binding <ol><li> Aggiungere 10 ug / ml di CD16 non marcato / CD32 Fc-block anticorpi. Incubare 20 minuti a 4 ° C (può andare più). </li><li> Aggiungere 2 ml di freddo 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugare il campione per 5 minuti a 450 xga 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e mantenere i campioni in ghiaccio. </li></ol> 9. macchie sulla pelle e le cellule mieloidi Linfonodo <ol><li> Incubare sci precedentemente bloccaton e DLN isolato cellule con Live / inseguitore Morto (cioè 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole o DAPI), anti-CD45 e anti-CD11b anticorpi specifici. NOTE: Al fine di arricchire le sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse, in particolare quelli rari, le cellule e linfociti CD45 + possono essere, rispettivamente, purificati dalla pelle o impoverito dal DLN dal tallone magnetica ordinamento delle cellule di facilitazione. Poiché la maggior parte delle cellule isolate dal DLN sono CD45 +, l&#39;uso di anti-CD45 non è obbligatoria. Altri marcatori possono essere inclusi per identificare sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse dalla strategia positiva o negativa-gating. In questo protocollo, le cellule mieloidi reclutate nel DLN sono stati arricchiti escludendo cellule CD8α + (tutto il compartimento di cellule T può essere bersaglio di utilizzare anti-CD3 anticorpo specifico). </li><li> Incubare 30 minuti a 4 ° C al buio. Aggiungere 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifugare il campione 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il supernatant. Ripetere la fase di lavaggio due volte. </li><li> Risospendere i campioni con 300 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Trasferire l&#39;intero volume in un tubo FACS attraverso un colino cella 35 micron. Lavare il filtro con 100 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Eseguire le cellule colorate in un citometro di flusso. Porta di vivere celle singole (DAPI -, FSC-W) di ​​escludere le cellule morte e doppiette. Trama CD45 + CD11b + eventi per la pelle (figura 6A) e (CD45 +) CD8α - CD11b + eventi per il DLN (Figura 6B). </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nella prospettiva della vaccinazione su larga scala degli esseri umani utilizzando un intero vaccino contro la malaria sporozoite, una delle principali sfide da superare è quello di sviluppare percorsi e metodi di somministrazione parassita ottimizzati per garantire l&#39;immunizzazione e la protezione 24,25 successo. Negli esseri umani, la valutazione della efficacia protettiva mediata da parassiti vivi attenuati (LAP) sono seguite zanzara naturale morde 2, nonché intradermica, sottocutanea 25,26 e IV vaccinazioni 27. Come riportato nei roditori 28 e primati non umani 25, la somministrazione endovenosa di LAP induce risposte immunitarie protettive più forti rispetto ai percorsi di cui sopra. Tuttavia, le rotte non-IV di amministrazione usando ago e la siringa continuano ad essere più adatto per la vaccinazione di massa umana e gli sforzi sono attualmente in corso per ottimizzare la loro efficacia protettiva. Recenti studi condotti su topi dimostranod, specialmente nel caso della rotta ID, che la deposizione di un piccolo volume di sospensione sporozoite (gamma di 1 ml) in diversi siti di iniezione (4 punti) significativamente maggiore infettività parassita rispetto ad una singola inoculazione di parassiti diluito in grandi volumi (50 ml) 24. Nel nostro sistema sperimentale (C57BL / 6 del mouse - P. berghei), la protezione completa è stata raggiunta dopo iniezioni multiple nel derma per le orecchie di sospensione altamente concentrata di parassiti (50.000 RAS in 0,6 ml, 4 siti di iniezione) 19. In questo contesto, abbiamo stabilito il protocollo descritto in precedenza per analizzare con maggiore precisione la risposta immunitaria locale per immunizzazione dosi di RAS che ci ha permesso di individuare 2 principali sottopopolazioni di cellule mieloidi reclutati nella pelle e DLN in risposta al parassita 19. flusso multi-parametrico permette citometria accurata identificazione e quantificazione dei cambiamenti di cellule immunitarie nel contesto della risposta dell&#39;ospitealle infezioni 19,20. L&#39;isolamento di un gran numero di cellule vitali è quindi fondamentale per eseguire analisi fenotipica riproducibile. A questo scopo, la concentrazione dell&#39;enzima e la durata della digestione tessuti devono essere ottimizzate. Infatti, bassa concentrazione di enzimi o tempo di incubazione insufficiente può portare a digestione incompleta con bassa resa delle cellule mentre prolungata digestione dei tessuti può provocare la vitalità delle cellule diminuzione e l&#39;alterazione della superficie cellulare antigene di espressione 29. Tuttavia, è stato dimostrato protocolli ben consolidati con trattamento collagenasi di avere un impatto marginale sulla rilevabilità di molecole di superficie rilevanti frequentemente utilizzate per fenotipica analisi 30. Tra i vari parametri in grado di ottimizzare la qualità di isolamento delle cellule, la separazione della dorsale e sezioni ventrali della pelle dell&#39;orecchio è essenziale, in quanto permette di collagenasi / DNAsi per accedere derma. Inoltre, macinazione la pelle nel piccolopezzi aumenta l&#39;area di superficie accessibile agli enzimi, permettendo quindi minore durata della digestione. Infine, l&#39;uso di dissociazione meccanica contribuisce ad aumentare la resa del numero di cellule sia per la pelle e DLN. Tuttavia, l&#39;eccessiva dissociazione può determinare un&#39;ulteriore sollecitazione che potrebbe avere un impatto negativo vitalità cellulare. Abbiamo favorito l&#39;acquisizione di cellule vive da fissazione porta alla colorazione ottimale, complicando distinzione di rari casi risultati positivi (dati non riportati). Inoltre, la discriminazione delle cellule morte era più problematico. Nei casi in cui è richiesta la fissazione delle cellule, si suggerisce l&#39;utilizzo di / DEAD risolvibili macchie di cellule morti vivono. Utilizzando il protocollo definito, noi con successo isolate cellule mieloidi infiltranti nella pelle e DLN in risposta a Parasite iniezione (figura 6A e B). Di solito ottenere livelli elevati di singole cellule vitali dal DLN (70-90%) rispetto alpelle (40-70%). Questa differenza può essere spiegata con il tempo di incubazione è più necessaria per la digestione enzimatica efficiente insieme a ulteriori fasi di dissociazione meccanica per isolare le cellule della pelle (pelle separazione dello strato, tritare e forte schiacciare). Infine, un parametro importante prendere in considerazione quando si analizza la risposta dell&#39;ospite ID iniezione di sporozoiti è il livello di infiammazione indotta da entrambi inserimento dell&#39;ago e salivari zanzara deposizione estratto ghiandola nella pelle 19,20. Si consiglia quindi di iniettare topi supplementare con solo sia 1x PBS o salivari estratti ghiandole dallo stesso numero di zanzare non infette per valutare la risposta immunitaria specifica indotta dal parassita. Complessivamente, si consiglia di sezionare zanzare infette con elevati livelli di parassita nelle ghiandole salivari e per filtrare la sospensione del parassita per limitare la quantità di materiale di zanzara che potrebbe essere depositato nella pelle. ion sintesi, l&#39;isolamento di cellule mieloidi dalla pelle e DLN attraverso il protocollo descritto fornisce un test affidabile per valutare cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium e può essere estesa ad altri patogeni trasmessi nella pelle dell&#39;ospite.

La malaria è una delle più letali malattie infettive in tutto il mondo, uccidendo più di mezzo milione di persone all&#39;anno. Infezione da Plasmodium, l&#39;agente causale della malattia, inizia una fase di pre-eritrocitaria (PE). Durante questa fase, sporozoiti iniettati nella pelle ospitante da una femmina anopheline zanzara raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno e si differenziano epatociti all&#39;interno nelle forme parassiti che infettano i globuli rossi e causano i sintomi della malattia. Le fasi PE di Plasmodium rappresentano un bersaglio privilegiato per la vaccinazione anti-malaria. In effetti, i vaccini vivi attenuati contro queste fasi, come la radiazione di attenuazione sporozoiti (RAS), parassiti geneticamente arrestati (GAP) o chemioprofilassi e sporozoiti (CPS) hanno dimostrato la loro capacità di proteggere sia roditori e ospiti umani 1-9. Nel modello di roditore, la maggior parte degli studi di vaccinazione sono condotti utilizzando l&#39;immunizzazione per via endovenosa, Che è lo standard in termini di efficacia protettiva. Tuttavia, la descrizione di una fase pelle e l&#39;importanza del linfonodo pelle associata drenante (DLN) nell&#39;elicitazione protezione ha cambiato la nostra percezione della fase PE e sottolineato l&#39;importanza della somministrazione intradermica di iniezione. L&#39;imaging intravitale di P. sporozoiti berghei iniettati nella pelle dei roditori ha dimostrato che solo ~ 25% dell&#39;inoculo raggiunge il fegato attraverso il flusso sanguigno. Il restante 75% ~ distribuisce tra prossimale DLN (~ 15%) e la pelle (~ 50%) 10,11, dove una piccola percentuale può trasformare e rimanere in vita per settimane all&#39;interno delle cellule della pelle 12,13. Inoltre, studi successivi descrivono che l&#39;istituzione di un&#39;efficace immunità protettiva dopo la vaccinazione intradermica avviene principalmente nella pelle-DLN, in cui si attivano specifiche cellule parassita T CD8 +, e solo marginalmente nella milza o del fegato-dLNs 14,15. Mentrela maggior parte degli studi si sono concentrati sulla caratterizzazione delle cellule effettrici implicati nella creazione di risposta immunitaria protettiva, e tanto meno si sa circa il destino dei parassiti vivi attenuati iniettati nella pelle, in particolare le loro interazioni con il sistema immunitario innato. In particolare, la caratterizzazione di cellule presentanti l&#39;antigene coinvolti nella parassita antigene captazione, l&#39;elaborazione e la presentazione di cellule T CD8 + è di importanza critica, sapendo che l&#39;acquisizione di antigene PE può avvenire sia nella pelle e scomparti DLN. Precedenti studi di imaging intravitale descritto un afflusso iniziale di cellule positive fluorescenza brillante Lys-GFP nella pelle in seguito ad un morso di zanzara infettiva 16 mentre i primi interazioni tra sporozoiti e cellule dendritiche sono stati osservati nel DLN 10,17. Più recentemente, è stato riportato che sporozoiti inoculati nella pelle dalle zanzare aumenta la motilità sia delle cellule T dendritiche e regolamentari nella pelletopi, mentre è stata osservata una serie diminuzione di cellule presentanti l&#39;antigene nel DLN 18. Si è voluto identificare e quantificare più precisamente i sottoinsiemi di leucociti reclutati nella pelle e corrispondenti DLN nonché coloro che interagiscono con il parassita dopo iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS 19. In questo contesto, abbiamo isolato le cellule mieloidi (CD45 + CD11b +) da entrambi i tessuti e caratterizzato sottopopolazioni di interesse da parte di più = flusso parametrico citometria. Coerentemente con la risposta immunitaria descritto nella fase iniziale della Leishmania importante infezione della pelle 20, la risposta dell&#39;ospite principale per sporozoite iniezione è costituito da una assunzione successiva di neutrofili polimorfonucleati (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguita da monociti infiammatorie (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) che sono identificate in base ad DifferentiAl espressione dei marcatori di superficie Ly6G e Ly6C. Descriviamo qui un protocollo per isolare cellule mieloidi dalla pelle del mouse e DLN dopo l&#39;iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS estratti da infetti ghiandole salivari delle zanzare. iniezioni intradermiche riproducibili e lavorazione dei tessuti sono passi fondamentali per quantificare i cambiamenti fenotipici di infiltrazione popolazione di cellule all&#39;interno dei tessuti infetti. L&#39;approccio seguito dettagliato fornisce un test affidabile per valutare la pelle e la risposta infiammatoria DLN al Plasmodium parassita e può essere esteso a vari sistemi sperimentali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine: Imalgene&#174; 1000</td>
			<td>Merial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine: Rompun&#174; 2%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican&#174; 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U.</td>
			<td>B. Braun Medical&#160;</td>
			<td>9151125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &#8211; Flat Bottom</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352350</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-02S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352098</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35&#181;m Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X + GlutaMAXTM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C5138</td>
			<td>400 U/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5025</td>
			<td>50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E-5134</td>
			<td>10mM or 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain (0,4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Dilution 1:10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>10&#181;g/ml final (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI FluoroPureTM grade</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D21490</td>
			<td>1&#181;g/ml final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559864</td>
			<td>&#160;Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td>&#160;Dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945; (5H10 clone)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MCD0830</td>
			<td>&#160;Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&#160;</td>
			<td>Janvier Laboratories</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

Malaria inizia quando la fase sporozoite di Plasmodium è inoculata in pelle di un mammifero ospite attraverso una puntura di zanzara. Il parassita altamente mobili non raggiunge solo il fegato per invadere epatociti e la trasformazione in forma eritrociti-infettiva. Si migra anche nella pelle e per il linfonodo drenante prossimale sito di iniezione, dove può essere riconosciuto e degradato da residenti e / o di cellule mieloidi reclutate. L&#39;imaging intravitale ha riferito l&#39;assunzione precoce di fluorescenza brillante Lys-GFP leucociti positivi nella pelle e le interazioni tra sporozoiti e CD11c + cellule del linfonodo drenante. Presentiamo qui una procedura efficiente per recuperare, identificare e contare i sottoinsiemi di cellule mieloidi che vengono reclutati per la pelle del mouse e drenanti linfonodi dopo l&#39;iniezione intradermica di immunizzare dosi di sporozoites in un modello murino. La caratterizzazione fenotipica usando flusso multi-parametrica fornisce citometriaun test affidabile per valutare i primi cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium.

Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;ago-siringa per iniezione di immunizzare dosi di P. berghei sporozoiti nella pelle del mouse induce un reclutamento successiva di neutrofili polimorfonucleati seguite da monociti infiammatorie della pelle e DLN 19. La Sezione protocollo descritto in dettaglio la procedura utilizzata per isolare con successo cellule mieloidi dal vivo da entrambi i tessuti seguenti iniezioni multiple di gran numero di sporozoiti nel derma dell&#39;orecchio sopra (figure 1 e 2). Entro il primo 24 ore, il DLN (Figura 3) e il sito di iniezione cutanea (Figura 4) sono stati isolati e trattati come riassunto in Figura 5 per analizzare l&#39;infiltrazione cellulare dal flusso multi-parametrica citometria. Nel complesso, questa tecnica ci ha permesso di isolare una media 10 4 CD45 + CD11b + e 2.10 4 CD11b + dal vivo le singole cellulerispettivamente per la pelle e DLN. La vitalità accettabile di singole cellule non detriti variava dal 40-70% per la pelle e 70-90% per il DLN. Come mostrato in figura 6, la frequenza delle cellule mieloidi in pelle (CD45 + CD11b +) e il DLN (CD8α - CD11b +) fortemente aumenta dopo iniezione intradermica di RAS rispetto ai topi non infetti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig1.jpg" /> Figura 1: I ntradermal Iniezione di sporozoiti nell&#39;orecchio di mouse. (A) Immagine che mostra l&#39;iniezione intradermica di sporozoiti nel padiglione auricolare di un mouse anestetizzato. Il lato ventrale dell&#39;orecchio è stabilizzato con nastro adesivo trasparente precedentemente posto sotto un microscopio da dissezione. L&#39;ago viene accuratamente inserito sul lato dorsale dell&#39;orecchio, sotto l&#39;epidermide, con lo smusso up. (B - C) Le immagini del lato dorsale del padiglione auricolare precedente (B) e dopo (C) intradermica iniezione di 0,1-0,2 ml di sospensione parassita. Una papula caratteristica (freccia nera) è osservabile al sito di iniezione, alla fine dell&#39;operazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig2.jpg" /> . Figura 2: Imaging di sporozoiti Depositata nel derma all&#39;orecchio del mouse (A) microscopia a fluorescenza che mostra RAS migrazione dal sito di iniezione (indicata dalle linee tratteggiate) nella pelle del mouse 15 min dopo l&#39;iniezione (bar scala = 60 micron; 10X ingrandimento). Il percorso di sporozoiti è rappresentata dalla proiezione massima intensità del segnale fluorescente. Verde e rosso di fluorescenza remostrano rispettivamente la posizione del parassita nella pelle all&#39;inizio e dopo 10 secondi di acquisizione. (B) maggiore ingrandimento di RAS (verde) iniettato nella pelle (Barra di scala = 20 micron; 25X di ingrandimento). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig3.jpg" /> Figura 3: Drenaggio linfatico Picture nodo di elaborazione (A) che mostra la dissezione del prossimale auricolare DLN dopo l&#39;iniezione intradermica di Evans blu per scopi dimostrativi.. Dopo dislocazione cervicale del mouse, il collo è disinfettata con etanolo al 70%. Una prima incisione viene fatta nella zona giugulare-carotidea con forbici affilate e la pelle viene rimosso dal campo operatorio. L&#39;incisione è allungata con 2 pinze per esporre il DLN che appare grAyish rispetto al tessuto circostante. I tessuti connettivi sono poi accuratamente schiacciati con una pinza sulla parte superiore del DLN e progressivamente separati da esso. Infine, il DLN viene estratto mettendo una pinza sotto il tessuto linfoide. (B) Immagine che mostra il DLN estratto in una goccia di PBS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig4.jpg" /> Figura 4:. Ear lavorazione della pelle Immagini che mostrano le fasi successive per elaborare l&#39;orecchio inoculato. (A) Dopo dislocazione cervicale del mouse, l&#39;orecchio viene disinfettata con il 70% di etanolo e rimossi con forbici affilate sterili e pinze. (B - D) La dorsale e ventrale aspetti delle orecchie sono leggermente separate da pizzicare e sstimolazione a parte il taglio si chiude con due pinze. (E) Immagine che mostra gli aspetti dorsale e ventrale dell&#39;orecchio previo trattamento enzimatico. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig5.jpg" /> Figura 5:.. Protocollo Sommario Rappresentazione schematica dei passaggi chiave per isolare le cellule totali dalla pelle e dei tessuti DLN <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig6.jpg" /> Figura 6: mieloide popolazione di cellule isolato dalla pelle dell&#39;orecchio e il prossimale DLN FACS Rappresentante trame che mostrano la.strategia di gating per analizzare il compartimento mieloide nella pelle (A) e il DLN (B). CD45 + CD11b + e CD8α - cellule CD11b + sono stati gated sul totale eventi singoletto dal vivo rispettivamente per la pelle e DLN. Per ogni condizione, 5 x 10 5 eventi totali sono stati acquisiti (2 orecchie e 2 DLN raggruppati per campione). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.1K Views.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Video: Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine superficiale Lymph Chirurgia Node

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...