Questo lavoro è supportato da finanziamenti NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick della Fondazione, Dana Foundation, Gabrielle Angelo Foundation, e Hyundai Motors of America &quot;Hope-on-Wheels&quot; Program.

1. Mouse Holder Assembly <ol><li> Sovrapporre il coperchio di 100-mm piatto di vetro Petri su una 100-mm coperchio di plastica capsula Petri rivolto verso il basso. Il vetro deve essere appena tocca il punto centrale del piatto di plastica. Utilizzando il vetro come stencil, tracciare un segno sul piatto di plastica. </li><li> Utilizzare un trapano a mano (cioè Dremel) per rimuovere una porzione di un coperchio 100-mm piatto di plastica per creare una forma di mezzaluna piattaforma. Questa forma di mezzaluna coperchio di plastica servirà come supporto per il torso superiore del topo (Figura 1a). Praticare due fori sul coperchio a forma di mezzaluna per fissare la maschera antigas con una fascetta di metallo torsione. Fissare il coperchio di plastica al bordo del piatto di vetro Petri con super colla o un adesivo equivalente forte (Figura 1b). </li><li> Colla i coperchi di due cupola-PCR tappo provette (tagliati a cerniera) 1 cm di distanza dal centro del piatto inferiore allo scopo di ancoraggio lembi cutanei poplitei. </li></ol> 2. Preparazione del mouse <strong&gt; Nota: Con la pratica sufficiente, si dovrebbe essere in grado di eseguire la preparazione del mouse e fasi chirurgiche in 20-30 minuti. <ol><li> Anestetizzare il mouse con isoflurano (2 al 2,5% per l&#39;induzione, 1,5 al 2% per l&#39;intervento / imaging) miscelati in 1:01 O 2: miscela aria ad una velocità di flusso di 1L/min utilizzando un IACUC approvato procedura. Una volta che il mouse è anestetizzato, fissare una maschera antigas sul naso con nastro adesivo. Determinare se il mouse è completamente anestetizzato dalla mancanza di risposta ai piedi e / o pizzichi coda. Il livello di isoflurano può essere regolata di conseguenza per assicurare l&#39;animale è completamente sedato, con una costante, non lavorò frequenza respiratoria tra 60-80 respiri al minuto. </li><li> Utilizzare un trimmer elettrico per eliminare i peli sulla zampa posteriore destra e la zona inguinale del mouse. </li><li> Spazzolare via i capelli sciolti e delicatamente applicare una mano modesta di lozione Nair sulla zona rasata con un batuffolo di cotone. Dopo un minuto di applicazione iniziale, togliere la Nair e pulire la pelle esposta con un panno umidotovagliolo di carta. Assicurarsi che il mouse sia pulita e asciutta prima di procedere. </li><li> Fai una piccola incisione 2-3 mm con le forbici al ginocchio destro per esporre il tendine estensore. </li><li> Applicare Vetbond lungo il centro del supporto topo dove il corpo e la gamba del mouse viene posizionato. Fissare con cura il mouse sul supporto, con il ginocchio destro verso il basso, per esporre la fossa poplitea destra. Fissare il tendine ginocchio destro con Vetbond tra i titolari della pelle 2 ribalte per contribuire a stabilizzare il settore imaging. </li><li> Stretch nastro e le braccia e la gamba sinistra alla piattaforma superiore del supporto. </li><li> Utilizzare una fascetta torsione per fissare la maschera antigas al suo posto. </li><li> Collocare il supporto sotto il microscopio di dissezione. Il LN deve rimanere immobile, indipendente dal movimento del mouse respirazione. Pertanto, devono essere prese precauzioni durante operazioni chirurgiche per ottimizzare la stabilità della gamba. Determinare la posizione della coda (tipicamente sopra la testa) che contribuiranno alla massimastabilità alla gamba destra e il nastro la coda verso il basso. </li></ol> 3. Chirurgia <ol><li> Mentre nel campo di applicazione dissezione, mantenere la temperatura corporea del mouse utilizzando una stufetta o una piastra elettrica. Per immagine positiva del LN poplitea, è fondamentale per sostenere la corretta temperatura del corpo durante la chirurgia così come per preservare l&#39;umidità del tessuto costantemente applicando caldo PBS al tessuto esposta. </li><li> Sterilizzare la pelle con Betadine. Utilizzando forbici sterili, praticare un&#39;incisione mediana attraverso la pelle a destra a metà polpaccio, e continuare a tagliare verticalmente fino alla parte superiore della coscia destra. </li><li> Fare due incisioni cutanee orizzontali nella parte superiore della linea di incisione verticale per creare lembi cutanei su entrambi i lati. </li><li> Ritrarre e colla premuti entrambi i lembi cutanei con Vetbond. Tirando la pelle tesa prima di applicare Vetbond permetterà di promuovere ulteriormente la stabilità della gamba, tuttavia, accertarsi che la tensione della pelle non occlude il flusso sanguigno (ossia a cambiamenti nella vessel colore o diametro). Continuare ad incollaggio altre aree della pelle per assicurare la stabilità della gamba prima di esporre la LN. La dimensione del mouse determinare la quantità di pelle è richiesta per incollaggio. In genere, i topi più grandi richiederà più la pelle da incollare al titolare. </li><li> La LN devono ricadere all&#39;interno della fossa poplitea sia a destra oa sinistra della vena poplitea, a seconda della posizione del mouse sul supporto. Separare con attenzione il LN dai tessuti adiposi e muscoli circostanti che utilizzano micro-dissezione pinzette e pinze. Per ridurre al minimo il sanguinamento e trauma, utilizzare le tecniche dispiegamento con micro-dissezione pinzette ai tessuti separati. Con attenzione esporre la LN poplitea senza compromettere l&#39;integrità dei vasi sanguigni afferenti ed efferenti e dei vasi linfatici afferenti. </li><li> Per la stabilità del tessuto aggiunto, un vetro di copertura quadrato può essere posizionato sopra la LN umida, appena toccando il LN evitando l&#39;occlusione del vaso. Il vetro di copertura può essere SECURed modellare con argilla su entrambi i lati del mouse. </li><li> Coloranti fluorescenti vaso di varie dimensioni (ad esempio TRITC-destrano, minimo di 70kDa) possono essere introdotti per via endovenosa a questo punto per aiutare evidenziare il rapporto strutturale e l&#39;integrità del LN durante l&#39;imaging. </li></ol> 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** <ol><li> Una volta che la LN sia adeguatamente esposta e la stabilità viene raggiunta, a trasferire rapidamente l&#39;intero gruppo porta mouse sul microscopio scena munito di un pad programmabile retroazione riscaldamento a temperatura controllata in una camera ambientale microscopio mantenuta a 37 ° C. Aggiungi abbastanza sterile calda (37 ° C) o PBS HBSS far immergere la LN. Il volume cambia a seconda della dimensione e la posizione del mouse. In alternativa, calda o PBS HBSS può essere applicato direttamente al LN sezionato attraverso una pipetta di vetro fine montata una pompa peristaltica e registrato alla colonna della lente obiettivo ad immersione. Il flusso del liquido deve essere tale dacolonna d&#39;acqua può essere mantenuta stabile tra la lente e il tessuto. </li><li> Mantenere la temperatura HBSS o PBS a 37 ° C usando un tampone di riscaldamento con una sonda di retroazione. Una sonda di temperatura separata deve essere inserito nel supporto mouse per confermare la temperatura del PBS nell&#39;intervallo di 36,5-37,5 ° C. Una sonda rettale può anche essere usato per monitorare la temperatura corporea del mouse sperimentale per tutta la sessione di imaging. </li><li> Utilizzare un epi-lampada fluorescente per aiutare il posizionamento LN guida sotto l&#39;obiettivo. Acquisire serie di immagini fluorescenti che utilizzano intervalli di tempo che sono appropriate per l&#39;interazione cellulare desiderata (in genere da 10 secondi a 1 minuto tra ogni serie di immagini xyz). </li><li> Monitorare lo stato dell&#39;animale nella camera microscopio frequentemente mediante ispezione visiva o utilizzando un sistema di monitoraggio animale. Determinare se il mouse è completamente anestetizzato dalla mancanza di risposta ai piedi e / o pizzichi di chiodi, e una costante, non lavorò frequenza respiratoria tra i 60-80 breaths / min. Il livello di isoflurano può essere regolato di conseguenza per assicurare che l&#39;animale è completamente sedato. Con un adeguato monitoraggio e l&#39;idratazione, gli animali possono essere esposte per 4-6 ore, o forse più. </li><li> Dopo l&#39;esperimento di imaging, l&#39;eutanasia l&#39;animale in una camera di CO 2 con IACUC approvato protocollo di eutanasia. L&#39;animale non dovrebbe essere permesso di uscire da anestesia prima all&#39;eutanasia. </li></ol> ** Questa procedura chirurgica può essere utile anche per altre forme di imaging intravitale diverso da 2P-LSM. 5. Risultati rappresentativi Diverse le cellule immunitarie circolanti vengono reclutati alla LN a ritmi diversi a seguito di trasferimento adottivo. Per CD4 + e CD8 + linfociti, queste cellule cominciano ad arrivare nel LN attraverso le venule endoteliali alte (HEV) minuti dopo il trasferimento iv con i numeri consistenti che arrivano nella LN popliteo dopo 2 a 4 ore 6,17-18. Per B cells, un numero considerevole si accumulano dopo 8 a 24 ore 19. Dendritiche attivate dovrebbe iniziare ad apparire nei drenanti poplitea LN 8 a 16 ore dopo l&#39;iniezione footpad 3,11,16-17. La figura 2a mostra che anche senza altri punti di riferimento, strutture come follicoli di cellule B possono essere individuate facilmente l&#39;accumulo rotonda cella sferica visibile sotto 2P-LSM 19. L&#39;utilizzo di un giornalista endogena fluorescente come i ubiquitina-GFP splenociti (Figura 2, video supplementari 1 e 2), si può tenere traccia di queste migrazioni di linfociti e comportamenti per giorni fino a una settimana in condizioni non-stimolatori condizioni fisiologiche. Con il multi-canale rivelatori ad alta sensibilità, è possibile acquisire un set di dati di imaging multiplex che comprende informazioni sulla struttura e le dinamiche di interazione tra più partner cellulari 17,19. Quando le tecniche chirurgiche siano eseguiti correttamente e le condizioni ambientali attentamente monitorato, lymphocytes deve presentare caratteristiche di velocità di migrazione, come mostrato nella Figura 2c, 2d e altrove 13-14,16. I linfociti si possono presentare anche differenze nella velocità di migrazione a seconda delle sub-regioni della LN in fase di imaging, così ulteriori punti di riferimento come i vasi sanguigni (come evidenziato dalla introduzione di coloranti nave) contribuirà a determinare la qualità complessiva imaging (ad esempio il controllo della temperatura corretta , minimo trauma alla LN, ecc) 3,6,20. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Figura 1. Costruzione di un supporto per mouse per il mouse popliteo LN Imaging a) Schema di montaggio del mouse titolare;. B) preparazione del mouse Rappresentante intravitale; c) Completato il montaggio supporto per mouse; d) Close-up vista della LN popliteo dopo l&#39;esposizione chirurgica. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi migrazione di GFP + linfocitinel LN poplitea. (a) istantanea 3D presa da 2P-LSM sequenza di immagini del LN poplitea in C57BL / 6 topo ricevente adoptively trasferito con 1x10 7 GFP + linfociti 1 giorno prima di imaging. Linea tratteggiata indica il confine di follicoli di cellule B, (b) tracce di migrazione dei linfociti durante 1 ora di continuo immagini; c) la distribuzione complessiva di velocità di migrazione dei linfociti. Velocità media = 10,04 ± 4,26 micron al minuto (per un totale di 15.125 brani analizzati), d), differenziale cellulare distribuzione velocità di migrazione delle cellule presenti nel follicolo delle cellule B (bar aperto; velocità media = 8.79 ± 3.90 micron / min; totale 1.525 brani analizzati ) e delle cellule T della zona (bar chiusi, velocità media = 13,77 ± 5.93 micron / min; di un totale di 1.250 brani analizzati). Scala bar = 50 micron. Supplemental Video 1. Time-lapse intravitale 2P-LSM immagini di un topo LN popliteo come descritto nella Figura 2. Un totale di 1x10 7 linfociti sono stati isolati from uno ubiquitina-GFP + topo donatore e adoptively trasferito per via endovenosa in un topo ricevente C57BL / 6 24 ore prima di imaging. Una serie di xy (750 um x 750 um) immagini di fluorescenza sono state prese attraverso fisso z pile (5 passi micron, 13 passi) per generare un pila xyz immagini (750 um x 750 um x 65 um), che è stata ripetuta ogni 20 secondi per un totale di 60 minuti, risultando in una sequenza di imaging xyzt per l&#39;analisi della velocità (figure 2c, 2d). La velocità di riproduzione = 450X. Scala bar = 50 micron. Time stamp = min: sec. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">Clicca qui per guardare il video supplementare</a> . Supplementare Video 2 vista ingrandita della sequenza di imaging in Video supplementare 1 al follicolo cellula B -. Cellule T confine di zona. La velocità di riproduzione = 450X. Scala bar = 25 micron. Data e ora = min: sec. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>leccare qui per guardare il video supplementare.

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	<li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node:+lessons+from+the+movies.">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+friends+in+out-of-the-way+places:+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging.">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I recenti progressi ad alta risoluzione a tecniche di imaging in situ, in particolare 2P-LSM, sono stati accompagnati da un crescente interesse per lo studio della dinamica il comportamento cellulare in vivo. La tecnica di imaging 4D sulla LN poplitea di un topo vivo permette tali analisi nel comportamento dinamico di cellule immunitarie nel tessuto senza disfunzioni micro-ambiente. L&#39;uso di 2P-LSM con rivelatori multipli che coprono l&#39;intero spettro visibile permette la raccolta simultanea di dati di immagini di popolazioni di cellule multiple. Questo può essere realizzato attraverso l&#39;uso in vivo di cellule specifiche topi reporter fluorescenti (ad esempio Ubiquitina eGFP-,-RFP, o-ECFP) combinato con l&#39;uso di trasferimento adottivo di popolazioni cellulari differenzialmente marcato utilizzando coloranti organici cellulari fluorescenti (ad es CFSE , SNARF-1, e Cell Tracker Orange) per esaminare i meccanismi cellulari e la funzione all&#39;interno della LN. In aggiunta l&#39;osservazione diretta delle interazioni tra differenziale rintracciato cell popolazioni, il dataset di immagini multiplex può essere sottoposto a ulteriori analisi con programmi di elaborazione immagini disponibili in commercio software (ad esempio Imaris, Bitplane Inc.) per chiarire ulteriormente il comportamento delle cellule e la funzione. Una vasta gamma di possibilità di interazione per studiare i meccanismi cellulari che utilizzano questi in vivo e in silico. La limitazione principale del metodo sperimentale qui descritto è la complessità tecnica inerente l&#39;approccio chirurgico. Questa tecnica richiede una formazione rigorosa di acquisire familiarità con l&#39;anatomia pertinente e le precise modalità tecniche e le competenze specifiche richieste dal presente protocollo. Ulteriori fattori di complicazione sono la difficoltà nel ridurre al minimo i danni ai tessuti durante l&#39;esplorazione LN, ottimizzando la stabilità dei tessuti durante l&#39;imaging, e prevenire lesioni termiche e laser per la LN prima e durante la sperimentazione di imaging. Perturbazione a uno di questi fattori si tradurrà in meno non ottimale linfamotilità ocyte e quindi interferire con la corretta interpretazione della conseguente analisi dei dati di imaging.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurano, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - rimozione lozione per capelli</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS, 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Riscaldamento pad</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Riscaldamento Pad controller</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Air e O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sonda di temperatura</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzette Dumont # 5</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14.101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinza, Graefe Iris, 7 cm curvo</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14.141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Forbici</td&gt;<td&gt; Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Copertina del piatto di vetro 100x20 millimetri coltura cellulare</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Copertina del piatto di polistirolo 100x20 millimetri coltura cellulare</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430.167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine soluzione (10% Povidine soluzione di iodio-topica)</td&gt;<td&gt; Prodotti Purdue, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

I linfonodi (LNS) sono organi linfatici secondari, che sono strategicamente ubicati in tutto il corpo per consentire la cattura e la presentazione di antigeni estranei dai tessuti periferici per innescare la risposta immunitaria adattativa. Giustapposti tra le risposte immunitarie innate e adattative, la LN è un luogo ideale per studiare le interazioni delle cellule immunitarie 1,2. Linfociti (cellule T, cellule B e cellule NK), cellule dendritiche (DC), e macrofagi comprendono la maggior parte di midollo osseo derivati ​​da elementi cellulari del LN. Queste cellule sono strategicamente posizionati nel LN per consentire sorveglianza efficace di antigeni self e potenziali antigeni estranei 3-5. Il processo con cui i linfociti successo incontrano gli antigeni affini è un oggetto di intensi studi negli ultimi anni, e prevede l&#39;integrazione di contatti molecolari tra cui recettori degli antigeni, molecole di adesione, chemochine, e strutture stromali come la fibro-reticolare rete 2,6-12 . </p&gt; Prima dello sviluppo ad alta risoluzione in tempo reale fluorescente imaging in vivo, gli investigatori invocati immagine statica, che offre solo una risposta per quanto riguarda la morfologia, la posizione e l&#39;architettura. Anche se queste domande sono fondamentali nella nostra comprensione del comportamento delle cellule immunitarie, i limiti intrinseci a questa tecnica non consente analisi per decifrare il traffico dei linfociti e gli indizi ambientali che influenzano il comportamento dinamico delle cellule. Recentemente, lo sviluppo di intravitale due fotoni microscopia a scansione laser (2P-LSM) ha permesso ai ricercatori di visualizzare i movimenti dinamici e le interazioni delle cellule individuali all&#39;interno LNs dal vivo in situ 12-16. In particolare, noi e altri hanno applicato questa tecnica al comportamento immagine cellulare e le interazioni all&#39;interno del popliteo LN, dove la sua compatta, la natura densa offre il vantaggio di acquisizione dati multiplex su una superficie del tessuto di grandi dimensioni con diversi tessuti sotto-strutture 11,17-18 . E is importante notare che questa tecnica offre ulteriori vantaggi rispetto alle tecniche di imaging espiantati tessuto, che richiedono interruzione del sangue, flusso linfatico, e in ultima analisi, le dinamiche cellulari del sistema. Inoltre, i tessuti espiantati hanno una finestra di tempo molto limitato in cui il tessuto rimane vitale per l&#39;imaging dopo espianto. Con una corretta idratazione e il monitoraggio delle condizioni ambientali dell&#39;animale, il tempo di imaging può essere significativamente esteso con questa tecnica intravitale. Qui, presentiamo un metodo dettagliato di preparazione topo LN popliteo per lo svolgimento delle immagini intravitale.

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

I recenti progressi nella microscopia a due fotoni hanno permesso in tempo reale<em&gt; In</em&gt; Immagini in situ di tessuti vivi in ​​modelli animali, in modo da migliorare la nostra capacità di indagare il comportamento cellulare sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui si delineano i preparativi necessari per eseguire l&#39;imaging intravitale del nodo poplitea linfa mouse.

Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.2K Views.  Case Western Reserve University. I recenti progressi nella microscopia a due fotoni hanno permesso in tempo reale In Immagini in situ di tessuti vivi in ​​modelli animali, in modo da migliorare la nostra capacità di indagare il comportamento cellulare sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui si delineano i preparativi necessari per eseguire l'imaging intravitale del nodo poplitea linfa mouse.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine superficiale Lymph Chirurgia Node

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...