המחברים מודים פטרישיה Baldacci, ונסה Lagal ו סבין Thiberge לקריאה ביקורתית, אירינה Dobrescu ו סבין Thiberge לעזרה מצלם ופאולין Formaglio להוראה בתחום ההדמיה vivo של תנועתיות sporozoite בעור העכבר. כמו כן, אנו רוצים להודות מארק Szatanik ומרכז ייצור הזיהום של אנופלס (פסטר CEPIA-Institut) לגידול יתושים. מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר AXA וקרנות מן Laboratoire ד אקסלנס &quot;לביולוגיה אינטגרטיבית של מתעוררים מחלות זיהומיות&quot; (מענק לא. ANR-10-LABX-62-IBEID).

<html> כל ההליכים אושרו על ידי ועדה של מכון פסטר על ידי ועדת האתיקה המקומית על ניסויים בבעלי חיים (ועדה אתית צה&quot;ל-פריז 1, פריז, צרפת; מספר הסכם: 2012-0015) וביצע בהתאם להנחיות והתקנות החלים. 1. חומרים ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אנופלס נקבה יתושים stephensi (זן Sda500) הניזונים עכברים נגועים 3-5 ימים לאחר הופעתה ומאחור כפי שתואר לעיל 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טפילים Plasmodium berghei אנקה שיבוט המבטאים את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הגן תחת שליטה של חלבון הלם חום המכונן 70 (HSP70) האמרגן. זה מניב קרינה בהירה לאורך כל מחזור החיים הטפילים 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נקבה C57BL / עכברים 6JRj (7 שבועות בן). הערה: כל החומרים הכימיים המשמשים הפרוטוקול המתואר מפורטים T המסוגל של חומרים / ציוד. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. בידוד Sporozoite קרינה מוחלשים מבלוטות הרוק נגד יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 18-25 ימים לאחר ארוחת דם זיהומיות, לאסוף וקור-להרדים יתושים לתוך צינור 15 מיליליטר על קרח כפי שתואר קודם לכן 21. בזהירות להעביר אותם על צלחת פטרי על ידי צינור היפוך. לשמור על חרקים על הקרח ולחשוף את היתושים מנה 12 krad של הקרנה x γ- או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד sporozoites מוחלש מבלוטות רוק יתוש מוקרנות כפי שתואר לעיל 21. אסוף בלוטות רוק נגועות בנפח קטן (סביב 15 μl) של בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS) על קרח בעדינות למחוץ אותם לשחרר sporozoites. הערה: ההזרקה של השעיה טפילה מרוכזת מאוד בנפח קטן להיות קריטי, לכן זה חיוני כדי לקצור מספר מספיק של בלוטות רוק ממספר רב של יתושים שנבחרו מראש גם נגועים, כפי שמעידים הביטוי החזק שלהםקרינה ירוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה sporozoite באמצעות כובע מסננת תא 35 מיקרומטר המותאמים צינור הידבקות 1.5 נמוך מ&quot;ל microcentrifuge כדי לחסל גושים ופסולת יתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של sporozoites מבודד כפי שתואר לעיל 21 ולהתאים את הריכוז של השעיה טפיל עם DPBS 1x קר להשיג 83,000 sporozoites / μl. אחסן את הטפילים על קרח תוך המשך בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המספר השווה של בלוטות רוק מפני יתושים נגועים כי תשמשנה שליטה שלילית ולעבד המדגם כמתואר בשלבי 2.2 ו -2.3. לדלל את המדגם כמצוין לעיל כדי להשיג ריכוז דומה של תמציות בלוטת רוק ההשעיה. הערה: ניתן לאחסן Sporozoites על הקרח לכל היותר 2 שעות. עם זאת, באופן אידיאלי הם מוזרקים תוך שעה לאחר ריסוק בלוטות הרוק. </li></ol> 3. הזרקה של Sporozoites לתוך La Dermalyer של האוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג) / xylazine (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) תערובת. חכה 5-8 דקות עבור בעכבר כדי להיות במצב של חוסר הכרה וליישם משחת עיניים אל העיניים כדי למנוע התייבשות קרנית. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ביצוע קמצוץ בוהן עדין על רגליים אחוריות הוא. הערה: המינון של הרדמה נמשך פחות מ -20 דקות, כך על פי השלבים הבאים חייבים להיעשות במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצבו את אפרכסת האוזן האוזן של העכבר על ידי תיקון בצד הגחון עם קלטת ברורה להציב בעבר תחת (איור 1 א) סטראו. לחץ בעדינות את האוזן כדי למנוע נזק של כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט ומהוקצע 10 מזרק μl / 35 מד עם 0.6 μl של טפילים resuspended 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את ההשעיה sporozoite ב 4 המוזרקים (0.15 μl לכל אתר) על ידי החדרת מחט על הגב בצד של האוזן (איור 1 א), מתחת לאפידרמיס בקפידה, עםאת ההטיה, מקפיד להימנע מכל כלי דם. אפשר מחט להישאר בדרמיס עבור כמה שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של injectant לפני הסרתו. שימו קשריר מאפיין בכל הזריקה בסוף ההליך (איור 1B ו 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, להסיר את האוזן בזהירות מהקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את האוזן הנגדית באותו המינון של טפילים על ידי ביצוע שלבי 3.2-3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 עכברים נוספים עם או 0.6 μl של 1x DPBS או 0.6 μl של תמצית בלוטת הרוק 1x DPBS + מפני יתושים נגוע על מנת להעריך את התגובה הדלקתית מתווכת על ידי הזרקת לבד ואת בתצהיר של חומר נגד יתושים בדרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התאוששות עכבר מן ההרדמה לפני ההצבה אותו בחזרה לתוך הכלוב. הערה: בתצהיר sporozoite הנאה בעור ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א ו -2), מכין את העכבר כמתואר previsously 23. </li></ol> עור 4. וניקוז הלימפה צומת Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני סטנדרטי (SM) כדלקמן: בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) + 25 מ&quot;מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) בתוספת 400 U / collagenase מ&quot;ל ו -50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​deoxyribonuclease (DNase) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי צלחות תרבית הרקמה 6 גם שטוח התחתונה על קרח עם 4.5 מ&quot;ל SM + 70 מיקרומטר תא מסננת לכל טוב עבור דגימות DLN (צלחת) ו -4.5 מ&quot;ל SM לכל טוב עבור דגימות עור (פלייט B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת הזמן הרצוי הבאה חיסון sporozoite, עמוק להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (125 מ&quot;ג / ק&quot;ג) / xylazine (12.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) נקע בצוואר הרחם לפני התערובת. ודא העכבר מדגים סימני מוות קליני ולהתחיל לנתיחה מיד. הערה: קינטיקה של גיוס תא מיאלואידית יכול להיבחן במועדים שונים לאחר injשיקוף (כלומר 2 hr, 4 hr ו -24 שעות כפי שתוארו לעיל 14). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את האוזן המחוסנת ובאזור הצוואר המקביל עם אתנול 70% כדי לצמצם את האפשרות של זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים מלקחיים סטרילית, בסביבה נקייה מחיידקים לנתח את DLN אזני הפרוקסימלי ללא איסוף השומן שמסביב. לבצע חתך ראשון מענית jugulo-carotidian ולהסיר את השערות משדה ההפעלה. למתוח את החתך עם 2 מלקחיים כדי לחשוף את DLN שמופיעה אפרפר לעומת הרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את רקמות החיבור בקפידה על החלק העליון של DLN עם מלקחיים כדי להקל הסרתו. חלץ את DLN ידי הצבת מלקחיים מתחת רקמת הלימפה (איור 3 א ו 3 ב). מניחים את DLN בתוך (צלחת) מסננת תא היטב המכיל 4.5 מ&quot;ל SM + 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את האוזן המחוסנת כולו באמצעות מספריים חדים סטרילית מלקחיים (איור 4 א). separאכל את ההיבטים הגב ועל הגחון של האוזן ידי צובט וריווח מלבד הקיצוץ מסתיים עם שני מלקחיים (איור 4 ב - 4E). מניח אותם (B פלייט) 4.5 היטב המכיל מיליליטר SM מוודא הרקמות הם שקועות לחלוטין בטווח הבינוני. הערה: על מנת לשפר את מהימנות הניסוי ולהגדיל את מספר התאים של עניין, ברכה 2 מוזרק אוזניים או 2 dLNs מאותו העכבר לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ולעבד במקביל האוזניים dLNs של עכברים מחוסנים עם או 1x DPBS או תמציות של בלוטות רוק. כלול 2 דגימות אוזן והלימפה נוספות צומת קוצרות עכבר נאיבי עבור פקדי פיצוי מכתים שליליים יחיד. </li></ol> בידוד תא 5. מן בלוטות הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת בלוטות הלימפה (צלחת) ב 37 ° C + 5% CO 2 במשך 15 דקות תחת תסיסה עדינה. הוסף 10 מ&quot;מ הסופי חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לכל טוב לנטרל collagenase ואת acti DNasevities. בצע את הצעדים הבאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק בלוטות הלימפה באמצעות הקצה העליון של הבוכנה מזרק 5 מ&quot;ל. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מסננת תא פעמיים עם 500 μl 1x DPBS + 2% עוברית בסרום שור (FBS) + 2 מ&quot;מ EDTA. העבר כל נפח של הבאר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את פעמיים היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 מ&quot;מ EDTA ולהעביר את נפח לתוך הצינור 15 מ&quot;ל. שמור צינורות על הקרח. </li></ol> בידוד תא 6. מעור של האוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת עלוני האוזן (פלייט B) ב 37 ° C + 5% CO 2 עבור שעה 1 תחת תסיסה עדינה. הערה: לאחר 20 דקות של דגירה, לחתוך את כרוזי אוזן עם מספריים לחתיכות קטנות כדי להקל על עיכול רקמות ולשים את הדוגמת לראש בחממה במשך 40 הדקות הנותרות. תאים בודדים ניתן לצפות בטווח הבינוני בסוף זמן הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;מ סופי<html> EDTA לכל טוב לנטרל פעילויות collagenase ו DNase. בצע את הצעדים הבאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את שברי רקמות אוזן ואת כל הנפח של מדיום חדש המכיל גם מסנן תא 70 מיקרומטר באמצעות פיפטה 1ml. חותכים 2 עד 3 מ&quot;מ מהקצה של קצה כדי לאסוף את שברי רקמות האוזן בקלות רבה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק שברי רקמת אוזן באמצעות הקצה העליון של בוכנת מזרק 5 מיליליטר. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את מסננות תא פעמיים עם 500 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את כל נפח של הבאר לתוך צינור מ&quot;ל 50 דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולהעביר את נפח לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. שמור את הצינור על הקרח. הערה: פעולות שונות על מנת לבודד תאים בסך הכל מן העור והרקמות DLN מסוכמים באיור 5. </li></ol>כותרת &quot;&gt; 7. רוזן ואת הכדאיות של תאים שנאספו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה העור דגימות DLN במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף נפח קטן של מדגם זה לספור את המספר הכולל של תאים מבודדים מן העור DLN באמצעות hemocytometer. להוסיף 0.04% trypan כחול כדי לקבוע את כדאיות התא. </li></ol> 8. חסימה ללא Antigen ספציפית מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של CD16 נטולות-תווית / CD32 Fc-בלוק נוגדן. דגירה 20 דקות ב 4 ° C (יכול ללכת יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של קר 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. צנטריפוגה מדגם במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולשמור על דגימות קרח. </li></ol> 9. עור מכתים תאי מיאלואידית הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת סקי חסם בעברn ו- DLN מבודדים תאים עם גשש Live / Dead (כלומר 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole או DAPI), אנטי CD45 ואנטי CD11b נוגדנים ספציפיים. הערות: על מנת להעשיר את תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של עניין, במיוחד אלו נדירים, CD45 + תאים לימפוציטים יכולים להיות מטוהרים בהתאמה מהעור או מדולדלת מן DLN ידי מיון תא מגנטי חרוז עזר &#39;. מאחר שרוב התאים המבודדים מן DLN הם CD45 +, השימוש בתרופות אנטי-CD45 הוא לא חובה. ניתן לכלול סמנים אחרים לזהות תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של הריבית על ידי אסטרטגיה חיובית או שלילית-gating. בפרוטוקול זה, התאים מיאלואידית גייס את DLN הועשרו על ידי למעט תאי CD8α + (תא תא T כולו יכול להיות ממוקד באמצעות נוגדן ספציפי אנטי CD3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך. הוספת 500 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 מ&quot;מ EDTA, צנטריפוגה דקות מדגם 5 ב 450 XG ב 4 ° C ו להתעלמות Supernatant. חזור על השלב לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דגימות עם 300 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 mM EDTA. מעביר את כל הנפח בתוך שפופרת FACS דרך מסננת תא 35 מיקרומטר. יש לשטוף את המסנן עם 100 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התאים מוכתמים בתוך cytometer זרימה. שער לחיות תאים בודדים (DAPI -, FSC-W) כדי לכלול תאים ו כפילויות מתים. מגרש CD45 + CD11b + אירועים העור (איור 6 א) ו- (+ CD45) CD8α - CD11b + אירועים עבור (6B איור) DLN. </li></ol>

<ol>
	<li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei.">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).</li><li>Hoffman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+humans+against+malaria+by+immunization+with+radiation-attenuated+Plasmodium+falciparum+sporozoites.">Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites.</a> J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).</li><li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+stage+developmental+arrest+by+depletion+of+a+protein+at+the+parasite-host+interface.">Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).</li><li>Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schl&#252;ter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells.">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).</li><li>Tarun, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protracted+sterile+protection+with+Plasmodium+yoelii+pre-erythrocytic+genetically+attenuated+parasite+malaria+vaccines+is+independent+of+significant+liver-stage+persistence+and+is+mediated+by+CD8++T+cells.">Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells.</a> J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).</li><li>van Dijk, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated,+P36p-deficient+malarial+sporozoites+induce+protective+immunity+and+apoptosis+of+infected+liver+cells.">Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).</li><li>Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+antimalarial+immunity+after+vaccination+with+late+liver+stage-arresting+genetically+attenuated+parasites.">Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites.</a> Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+immunity+against+malaria+liver+stage+after+vaccination+with+live+sporozoites+under+chloroquine+treatment.">Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment.</a> J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).</li><li>Behet, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporozoite+immunization+of+human+volunteers+under+chemoprophylaxis+induces+functional+antibodies+against+pre-erythrocytic+stages+of+Plasmodium+falciparum.">Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 13, 136 (2014).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+Plasmodium+transmission+from+mosquito+to+mammal.">Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal.</a> Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).</li><li>Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+sporozoites+trickle+out+of+the+injection+site.">Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).</li><li>Gueirard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host.">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).</li><li>Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+exo-+erythrocytic+forms+of+rodent+malaria+parasites+at+the+site+of+inoculation:+clearance+after+immunization,+susceptibility+to+primaquine,+and+contribution+to+blood-stage+infection.">Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection.</a> Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).</li><li>Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+protective+against+malaria+liver+stages+are+primed+in+skin-draining+lymph+nodes.">CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes.</a> Nat Med. 13 (9), (2007).</li><li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-draining+lymph+node+priming+is+sufficient+to+induce+sterile+immunity+against+pre-erythrocytic+malaria.">Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria.</a> EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+traversal+is+important+for+progression+of+the+malaria+parasite+through+the+dermis+to+the+liver.">Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-node+resident+CD8&#945;++dendritic+cells+capture+antigens+from+migratory+malaria+sporozoites+and+induce+CD8++T+cell+responses.">Lymph-node resident CD8&#945;+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).</li><li>da Silva, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+skin+immunological+disturbance+after+Plasmodium-infected+mosquito+bites.">Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites.</a> Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).</li><li>Mac-Daniel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+immune+response+to+injection+of+Plasmodium+sporozoites+into+the+skin.">Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin.</a> J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).</li><li>Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+capture+of+infected+neutrophils+by+dendritic+cells+in+the+skin+inhibits+the+early+anti-leishmania+response.">Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response.</a> PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo.+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).</li><li>Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-dependent+protein+kinase+regulates+Plasmodium+ookinete+access+to+the+midgut+epithelial+cell.">A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell.</a> Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+malaria+sporozoites+in+the+dermis+of+the+mammalian+host.">Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).</li><li>Ploemen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+load+following+parenteral+sporozoite+administration+in+rodents.">Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents.</a> Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).</li><li>Epstein, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity.">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li><li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation:+an+open-label+follow-up+study.">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li><li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בפרספקטיבה של החיסון בקנה מידה גדול של בני אדם באמצעות חיסון למלריה sporozoite שלם, אחד האתגרים העיקריים להתגבר היא לפתח נתיבים אופטימיזציה ושיטות ממשל טפיל על מנת להבטיח חיסון מוצלח והגנה 24,25. אצל בני אדם, הערכת יעילות מגנה בתיווך הטפיל מוחלשים חיים (LAP) שבוצעה בעקבות יתושים טבעיים נושך 2, כמו גם תוך-עורית, תת עורית 25,26 ו- IV חיסונים 27. כפי שדווח במכרסמים 28 והלא-אנושי הפרימטים 25, הרביעי מנהלה של LAP גורמת מערכת חיסונית מגן חזק לעומת המסלולים הנ&quot;ל. אף על פי כן, מסלולים שאינם IV של ממשל באמצעות מחט מזרק עדיין מתאימים יותר חיסון המוני אדם מאמץ כרגע נעשים כדי לייעל יעילות המגן שלהם. מחקרים שנערכו לאחרונה בעכברים להפגיןד, במיוחד במקרה של התוואי מזהה, כי בתצהיר של נפח קטן של השעית sporozoite (טווח של 1 μl) ב מוזרקים מרובים (4 נקודות) infectivity הטפיל גדל באופן משמעותי לעומת חיסון יחיד של טפילים מדוללים ובהיקפים גדולים (50 μl) 24. במערכת הניסוי שלנו (עכבר C57BL / 6 - פ berghei), הגנה מלאה הושגה לאחר זריקות מרובות בדרמיס האוזן של השעיה ריכוז גבוה של טפילים (50,000 RAS ב 0.6 μl, 4 המוזרקים) 19. בהקשר זה, הקמנו את הפרוטוקול המתואר לעיל כדי לנתח באופן מדויק יותר את התגובה המקומית החיסון של הפונדקאי כדי לחסן מינונים של RAS שאפשרו לנו לזהות 2 תת תא מיאלואידית גדול גייסו בעור DLN בתגובה הטפילה 19. זרימה רבה-פרמטרית cytometry מאפשרת זיהוי וכימות מדויקים של שינויי תא חיסון בהקשר של תגובה המארחתלזיהום 19,20. בידוד של מספר רב של תאי קיימא לכן זה קריטי לבצע ניתוח פנוטיפי לשחזור. לשם כך, ריכוז האנזים ואת משך עיכול רקמות חייב להיות מותאם. ואכן, ריכוז נמוך של אנזימים או זמן דגירה לא מספיק עלול להוביל עיכול לא שלם עם תשואה נמוכה של תאי בעוד לעיכול רקמת ממושך עלול לגרום כדאיויות תא ירידה ושינוי ביטוי אנטיגן פני תא 29. אף על פי כן, פרוטוקולים ומבוססים באמצעות טיפול collagenase הוכחו יש השפעה שולית על detectability של מולקולות פני שטח רלוונטיות שימוש תכוף עבור פנוטיפי מנתח 30. בין מספר הפרמטרים שיכולים לייעל את איכות בידוד תא, הפרדת הגבי וחתכי גחון של עור האוזן חיונית, שכן הוא מאפשר collagenase / DNAse לגשת הדרמיס. בנוסף, וקוצצים את העור לתוך קטןחתיכות מגדילות את שטח הפנים נגיש האנזימים, ובכך מאפשרות פחות זמן עיכול. לבסוף, השימוש ניתוק מכני מסייע להגדיל את התשואה בתא מס הן לעור DLN. עם זאת, דיסוציאציה מוגזמת עלולה לגרום ללחץ נוסף שיכול להשפיע על כדאיות התא שלילי. העדפנו רכישת תאי חיים מאז קיבעון מוביל מכתים לא טוב, שסבך הבחנה של אירועים חיוביים נדירים של עניין (מידע לא מוצג). יתר על כן, את האפליה של תאים מתים הייתה יותר בעייתית. במקרים בהם קיבוע התא נדרש, היינו מציעים את השימוש כתמים תאים מתים חי / מת אפשר לתקן. באמצעות הפרוטוקול המוגדר, אנחנו תאים מיאלואידית מבודדים בהצלחה שחדר לתוך עור DLN בתגובה טפיל הזרקה (איור 6 א &#39;וב&#39;). אנחנו בדרך כלל להשיג רמות גבוהות יותר של תאים בודדים קיימא מן DLN (70-90%) לעומתעור (40-70%). הבדל זה יכול להיות מוסבר על ידי זמן דגירה עוד צורך עיכול אנזימטי יעיל יחד עם צעדים נוספים של ניתוק מכאני לבודד תאי עור (פרדת שכבת עור, וקוצצים ואיחוד חזק). לבסוף, פרמטר חשוב לקחת בחשבון בעת ניתוח התגובה לארח הזרקת sporozoites מזהה היא הרמה של דלקת הנגרמת על ידי שתי החדרת מחט בתצהיר תמצית יתוש בלוטות רוק בעור 19,20. לפיכך, אנו ממליצים להזריק עכברים נוספים עם או 1x PBS לבד או תמציות של בלוטות רוק מאותו מספר היתושים שאינם נגועים להעריך את התגובה החיסונית הנגרמת על-ידי יצרן הטפיל. בסך הכל, אנו ממליצים לנתח יתושים נגועים עם עומס טפיל גבוה בבלוטות הרוק ולנפות את ההשעיה הטפילה להגביל את כמות חומר יתוש שיכול להיות מופקדת על העור. אניn לסיכום, הבידוד של תאי מיאלואידית מהעור DLN באמצעות הפרוטוקול המתואר מספק assay אמין להעריך שינויים הסלולר דינמיים במהלך תגובה דלקתית לזיהום Plasmodium וניתן להאריך לפתוגנים אחרים המועברים לתוך העור של המארח.

מלריה היא אחת המחלות הזיהומיות הקטלניות בעולם, הרג יותר מחצי מיליון בני אדם בשנה. זיהום על ידי Plasmodium, הסוכן סיבתי של המחלה, מתחיל שלב טרום האריתרוציטים (PE). במהלך שלב זה, sporozoites מוזרק לתוך העור מארח ידי יתוש נקבת Anopheline להגיע הכבד דרך מחזור הדם ולבדל hepatocytes בתוך לצורות הטפילות המדביקים תאי דם אדומים ולגרום הסימפטומים של המחלה. שלבי PE של Plasmodium מהווים יעד חסוי לחיסון נגד מלריה. אכן, לחיות חיסונים מוחלשים נגד בשלבים אלה, כגון sporozoites נחלש קרינה (RAS), טפילים נעצר גנטית (GAP) או chemoprophylaxis ו sporozoites (CPS) הוכיחו את יכולתם להגן הן מכרסמים ומארחים האנושי 1-9. במודל המכרסם, רוב מחקרי חיסון נערכים ניצול חיסון תוך ורידים, המהווה את תקן הזהב במונחים של יעילות מגן. עם זאת, התיאור של שלב עור ואת החשיבות של הבלוטה לימפה הניקוז הקשורים עור (DLN) ב לעורר הגנה השתנה התפיסה שלנו של שלב PE והדגיש את החשיבות של המסלול תוך-עורית של הזרקה. הדמיה Intravital של פ sporozoites berghei מוזרק לתוך העור של מכרסמים הראו כי רק ~ 25% של הבידוד מגיע הכבד דרך מחזור הדם. הנותרים ~ 75% מפיצה בין הפרוקסימלי DLN (~ 15%) ואת העור (~ 50%) 10,11, שבו חלק קטן יכול להפוך ולהישאר בחיים במשך שבועות בתוך תאי העור 12,13. יתר על כן, מחקרים מאוחרים יותר תיאר כי הקמת הגנה חיסונית יעילה לאחר חיסון intradermal בעיקר מתרחש בעור-DLN, שבו טפיל ספציפי תאי CD8 + T מופעלים, ורק באופן שולי בטחול או בכבד-dLNs 14,15. בזמןרוב המחקרים התמקדו באפיון תא המפעיל המעורב בהקמה בתגובת מגן חיסון, הרבה פחות ידוע על גורלם של טפילי מוחלשים חיים מוזרקים לתוך העור, במיוחד יחסי הגומלין שלהם עם מערכת החיסון המולדת. בפרט, אפיון של תאי מציגי אנטיגן מעורבים ספיג אנטיגן הטפיל, עיבוד והצגה לתאי CD8 + T הוא בעלת חשיבות מכרעת, בידיעה כי רכישת אנטיגן PE יכולה להתרחש הוא בעור ותאי DLN. מחקרי הדמיה intravital הקודם תיאר נהירה מוקדם של תאים חיוביים במאור פלורסנט ליס-GFP בעור בעקבות עקיצת יתוש זיהומיות 16 תוך אינטראקציות מוקדם בין sporozoites ותאים דנדריטיים נצפו DLN 10,17. לאחרונה, זה כבר דווח כי sporozoites המחוסן בעור על ידי יתושים מגביר את תנועתיות של שני תאי T הדנדריטים ורגולטוריים בעורעכברים, בעוד מספר ירידה של תאים מציגי אנטיגן נצפתה DLN 18. החוקרים ביקשו לזהות ולכמת ליתר דיוק תת לויקוציטים גייס בעור המקביל DLN כמו גם אלה אינטראקציה עם הטפיל לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של RAS 19. בהקשר זה, אנחנו מבודדים תאי מיאלואידית (CD45 + CD11b +) משני הרקמות ומאופיינות תת-אוכלוסיות של ריבית על ידי זרימה רבה = פרמטרית cytometry. עולה בקנה אחד עם התגובה החיסונית מתוארת בשלב המוקדם של דלקת עור גדולה שושנת יריחו 20, תגובת המארח העיקרית sporozoite הזרקת מורכב גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) ואחריו מונוציטים דלקתיים (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) אשר מזוהים על בסיס differentiביטוי אל של סמני משטח Ly6G ו Ly6C. אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאי מיאלואידית מעור עכבר DLN לאחר הזרקת intradermal של מחסנת מינונים של RAS שחולצו מן בלוטות רוק יתוש נגועות. זריקות תוך-עורית לשחזור ועיבוד רקמה הם שלבים קריטיים לכמת שינויים פנוטיפי של הסתננות אוכלוסיית תאים בתוך רקמות נגועות. הגישה כמפורט להלן מספק assay אמין להעריך את העור לתגובה דלקתית DLN כדי טפיל Plasmodium ויכול להתארך עד מערכות ניסיוניות שונות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine: Imalgene&#174; 1000</td>
			<td>Merial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine: Rompun&#174; 2%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican&#174; 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U.</td>
			<td>B. Braun Medical&#160;</td>
			<td>9151125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &#8211; Flat Bottom</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352350</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-02S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352098</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35&#181;m Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X + GlutaMAXTM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C5138</td>
			<td>400 U/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5025</td>
			<td>50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E-5134</td>
			<td>10mM or 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain (0,4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Dilution 1:10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>10&#181;g/ml final (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI FluoroPureTM grade</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D21490</td>
			<td>1&#181;g/ml final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559864</td>
			<td>&#160;Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td>&#160;Dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945; (5H10 clone)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MCD0830</td>
			<td>&#160;Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&#160;</td>
			<td>Janvier Laboratories</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

זיהום מלריה מתחיל כאשר בשלב sporozoite של Plasmodium הוא מחוסן לתוך העור של מארח יונק באמצעות עקיצת יתוש. הטפיל הניע מאוד לא רק מגיע הכבד לפלוש hepatocytes ולהפוך לצורה כדורית-זיהומיות. זה גם נודד לתוך העור כדי הלימפה הפרוקסימלי ניקוז באזור הזריקה, שם הוא יכול להיות מוכר מושפל על ידי תושב ו / או תאי מיאלואידית גייס. הדמית Intravital דיווחה על הגיוס המוקדם של לויקוציטים החיובי ליס-GFP ניאון בהיר בעור ואת יחסי הגומלין בין sporozoites ו CD11c + תאי הלימפה הניקוז. אנו מציגים כאן הליך יעיל להתאושש, לזהות למנות את תת תא מיאלואידית כי מגויסים על העור העכבר וניקוז בלוטת לימפה לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של sporozoites במודל בעכברים. זרימת אפיון פנוטיפי רבה פרמטרית באמצעות cytometry מספקתassay אמין להעריך שינויים הסלולר דינמיים מוקדם במהלך תגובה דלקתית לזיהום Plasmodium.

אנחנו לאחרונה הראינו כי הזרקת מחט מזרק של מינונים מחסנים של פ berghei sporozoites בעור העכבר גורם גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear ואחריו מונוציטים דלקתיים בעור DLN 19. באזור הפרוטוקול שתואר לעיל מפרט את ההליך המשמש לבודד תאי מיאלואידית חיו בהצלחה משני ברקמות באות זריקות מרובות של מספר רב של sporozoites בדרמיס האוזן (איורים 1 ו -2). בתוך 24 השעות הראשונות, DLN (איור 3) ואת זריקת עור (איור 4) היו מבודדים ומעובד כפי שמסוכם איור 5 לנתח את חדירת הסלולר על ידי זרימה רבה פרמטריים cytometry. בסך הכל, טכניקה זו אפשרה לנו לבודד בממוצע 10 4 CD45 + CD11b + ו- 2.10 4 CD11b + תאים בודדים חיעבור העור DLN בהתאמה. הכדאיות המקובלת של תאי בודדים שאינם פסולת נעה בין 40-70% עבור העור 70-90% עבור DLN. כפי שניתן לראות בתרשים 6, תדירות של תאים מיאלואידית בעור (CD45 + CD11b +) ואת DLN (CD8α - CD11b +) המגביר משמעותית לאחר ההזרקה intradermal של RAS לעומת עכברים שלא נדבקו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig1.jpg" /> איור 1: אני ntradermal הזרקת Sporozoites לתוך האוזן של עכבר. תמונה (A) מראה זריקה תוך-עורית של sporozoites של אפרכסת האוזן האוזן של העכבר בהרדמה. צד הגחון של האוזן הוא התייצב עם קלטת ברורה להציב בעבר תחת מיקרוסקופ לנתח. המחט מוחדרת בזהירות בצד הגבי של האוזן, מתחת לאפידרמיס, עם למעלה שפוע. (B - Cתמונות) מראה את הגב בצד של אפרכסת האוזן האוזן לפני (B) ואחרי (ג) הזרקה תוך-עורית של 0.1-0.2 μl של השעיה טפיל. קשריר מאפיין (חץ שחור) ניתן לצפות באזור הזריקה בסוף המבצע. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig2.jpg" /> . איור 2: הדמיה של Sporozoites שהופקדו האוזן הדרמיס של עכבר (א) מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה RAS נודדות מאתר ההזרקה (מסומן על ידי קווים מקווקווים) בעור עכבר 15 דקות לאחר ההזרקה (בר סולם = 60 מיקרומטר; 10X הַגדָלָה). הנתיב של sporozoites מיוצג על ידי הקרנת העוצמה המקסימלית של האות ניאון. מחדש קרינה ירוקה ואדוםspectively יראה את מיקומך הטפיל בעור בתחילה ואחרי 10 שניות של רכישה. (ב) הגדלה גבוהה של RAS (ירוק) מוזרק בעור (בר סולם = 20 מיקרומטר; 25x הגדלה). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig3.jpg" /> איור 3: ניקוז עיבוד הלימפה (א) תמונה המציגה דיסקציה של DLN אזני הפרוקסימלי לאחר ההזרקה intradermal של אוונס כחול למטרות הדגמה.. לאחר נקע בצוואר הרחם של העכבר, הצוואר הוא לחטא עם אתנול 70%. החתך ראשון הוא עשה באזור צוואר-התרדמה במספרי חדי העור הוסר משדה ההפעלה. החתך נמתח עם 2 מלקחיים כדי לחשוף את DLN שמופיעה גרעייש לעומת הרקמה הסובבת. רקמות החיבור ואז הם צבטו בזהירות עם מלקחיים על החלק העליון של DLN בהדרגה להינתק ממנה. לבסוף, DLN מופק על ידי הצבת מלקחיים מתחת רקמת הלימפה. (ב) תמונה מראה את DLN חילוץ ירידה של PBS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig4.jpg" /> איור 4:. עיבוד עור אוזן תמונות מראות את השלבים הרצופים לעבד את האוזן המחוסנת. (א) לאחר נקע בצוואר הרחם של העכבר, האוזן היא לחטא עם 70% אתנול ו להסיר באמצעות מספרי מלקחיים חדים סטרילי. (B - D) הגבו והיבטי גחון של האוזן מופרדים בקלילות על ידי צובט ו- sצעדה בנפרד לחתוך מסתיימת עם שני מלקחיים. (ה) תמונה המציגה את ההיבטים הגב ועל הגחון של טיפול אנזימטי לפני האוזן. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig5.jpg" /> איור 5:.. סיכום פרוטוקול ייצוג סכמטי של השלבים העיקריים לבודדות תאים הכוללים מן העור ורקמות DLN <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53796/53796fig6.jpg" /> איור 6: אוכלוסיית תאים מיאלואידית מבודדת מעור האוזן ואת DLN הפרוקסימלי מגרש FACS נציג מראה את.האסטרטגיה gating לנתח בתא מיאלואידית בעור (א) ואת DLN (B). CD45 + CD11b + ו- CD8α - CD11b + תאים היו מגודרים על אירועי גופייה הכוללים חיים עבור העור DLN בהתאמה. עבור כל תנאי, 5 x 10 5 סך כל האירועים נרכשו (2 האוזניים ו -2 DLN ונקווה לדגימה). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53796/53796fig6large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites at JoVE.com

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.1K Views.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Video: Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

צומת Murine שטחית לימפה ניתוח

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...