Questo lavoro è stato finanziato da un BBSRC concedere a parlamentare europeo (BB / H010297 / 1), una quota borsa di studio BBSRC a SAR, e una borsa di studio MRC in SWF.

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The authors have no competing financial interests.

Una parte essenziale di questo protocollo genera ligandi biologicamente attivi che vengono normalmente trattati, secreti, e in grado di suscitare una risposta nella cellula ricevente, pur avendo una porzione fluorescente allegata. E &#39;fondamentale per stabilire che il prodotto del gene fluorescente-tag è biologicamente attivo utilizzando un dosaggio adeguato. Per Shh-GFP, la capacità di attivare l&#39;espressione di PTC1 stato confermato 16. Wnt8a ha notevolmente potente capacità di indurre un asse secondario, quando espresso in un unico ventrale blastomero 20-21, e Wnt8a-HA-eGFP è stato mostrato mantenere questa attività biologica. Wnt11b inibisce ACTIVIN trattati espianti ectodermici da subire estensione convergenti 21-22, e Wnt11b-HA-eGFP conserva anche la sua attività biologica 17. La capacità dei ligandi tag per ottenere risposte equivalenti alle proteine ​​senza tag suggerisce che le conclusioni basate su esperimenti usando ligandi fluorescenti si be rilevanti per la proteina normale. L&#39;aggiunta del epitopo HA tra il ligando e la proteina fluorescente fornito una regione spaziatrice che permette Wnt costrutti di essere attivo e fluorescenti. Il principale limite di questo tipo di analisi è che non informa direttamente su pendenze morphogen endogeni. Per esempio, la diffusione di Shh attraverso il campo delle celle a protezione animale non può riflettere il modo muove Shh endogeni attraverso l&#39;epitelio colonnare neurale nell&#39;embrione. Tuttavia, la semplicità di questo protocollo permette esperimenti in cui è possibile testare l&#39;effetto dei regolatori esogeni sulla distribuzione di ligandi. I risultati di questi approcci possono costituire la base di ipotesi da testare con più esigente in analisi vivo. Per esempio, la capacità di sovraespressa Sulf1 per restringere la distribuzione di Shh-GFP usando i metodi descritti in questo documento indicò il potenziale di Sulf1 nella modulazione morphogen grad Shhiente. Questo è stato direttamente testato e convalidato utilizzando antisenso morfolino knock-down di Sulf1 e immunocitochimica visualizzare endogena Shh nel tubo neurale 16. Un metodo simile al nostro è stato utilizzato per studiare i meccanismi specifici che potrebbe regolare ligando diffusione. Smith e colleghi hanno dimostrato che una nodale GFP-tagged (Xnr2) usato diffusione semplice, e non cellula estensioni (cytonemes) o transcitosi (utilizzando vescicole) per formare un gradiente 23. Ulteriori elaborazioni di questi metodi sono possibili in cui altre proteine ​​che bloccano particolari percorsi possono essere espressi in cellule bersaglio per verificare se una risposta alla molecola di segnalazione è necessario come intermediario per trasmettere segnali da una cellula all&#39;altra. Ad esempio, esprime un recettore dell&#39;activina dominante negativo tra la sorgente di activin e le cellule rispondenti mostrato che diffusione semplice ligando potrebbe provocare una risposta più diametri cellulari distanza dalla sorgente even con le cellule non rispondono in mezzo 24. Questa conclusione è stata sostenuta dal lavoro in zebrafish in cui le cellule di tipo selvatico in grado di rispondere ad una fonte di nodale, nonostante sia circondato da cellule mutanti che non rispondono privi di un co-recettore essenziale per nodale 25. Altri studi hanno utilizzato zebrafish per indagare la diffusione di fluorescenza ligandi con tag 28,29. Alcuni studi hanno osservato che codifica epitopo C-terminale delle proteine ​​Wnt può influire sull&#39;attività segnalazione, probabilmente a causa delle cisteine ​​altamente conservate che contribuiscono alla conformazione proteica. Il nostro lavoro precedente ha mostrato che tra cui un distanziatore (ad esempio il tag HA) provoca ligandi Wnt contrassegnate biologicamente attivi 17. Ciò è probabilmente perché il distanziatore prevede flessibilità necessaria per l&#39;interazione ligando del recettore, come ad esempio nel modello di pollice-indice di Wnt-Frz vincolante 30. Il prossimo passo per avanzare i nostri studi è quella di includere un vissessuale lettura per l&#39;attivazione della via di segnalazione. Per esempio, esprimendo GFP-tagged Dvl 26 in cellule lontane dalla fonte di ligando consentirà l&#39;intervallo attraverso il quale Wnt11b ha la capacità di segnale da misurare. La gamma di attività di segnalazione Wnt8a potrebbe essere dimostrata utilizzando colorazione anticorpale per misurare localizzazione nucleare di b-catenin in celle 27 ad una distanza dalla sorgente. Questi tipi di esperimenti sono possibili utilizzando le tecniche descritte in questo documento. Utilizzando una varietà di proteine ​​o fluorofori fluorescenti differenti, un ulteriore livello di informazioni saranno fornite in cui si misura non solo la distribuzione di un ligando, ma la anche l&#39;uscita dei percorsi di segnalazione, e in questo modo determinare la gamma di soglia di un morphogen . Xenopus laevis è un modello utile per la visualizzazione ligandi GFP-tagged e ulteriori dettagli sui metodi per procurare embrioni, sintesi di mRNA, microiniezione e sezionareion sono disponibili 31.

Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule sono progressivamente impegnati a seguire linee specifiche di differenziazione: questo significa un gruppo di totipotente (o pluripotenti) cellule diventano gradualmente limitarsi a verificare popolazioni di cellule progenitrici decisi a dare origine a un tipo di cellula. Segnalazione cellula-cellula è centrale per la regolamentazione specifica stirpe durante lo sviluppo embrionale. La manipolazione di questi segnali dovrà dirigere le cellule staminali verso particolari sorti per sostenere cure mediche innovative. Un numero relativamente piccolo di vie di segnalazione sono ribadito durante lo sviluppo, tra cui percorsi di rispondere alla superfamiglia TGF (nodals e BMP) 1-2, FGFs 3, 4 Wnt, e Hedgehogs 5. Queste proteine ​​secrete legano recettori presenti sulla membrana cellulare per attivare trasduzione del segnale modificando così l&#39;espressione genica e / o il comportamento cellulare. La stretta regolazione di segno cellulareAlling è essenziale per la specifica linea cellulare e lo sviluppo normale. Mentre il cross-talk tra questi percorsi è importante per determinare il destino delle cellule, un singolo ligando può sé suscitare risposte diverse a diverse concentrazioni. Gradienti morfogeno sono stati descritti più di 100 anni fa come una teoria per spiegare come i diversi tipi di cellule possono derivare da un campo di celle 6. Segnalazione molecole prodotte da un gruppo di cellule si diffonda in un determinato intervallo, diminuendo in concentrazione con una maggiore distanza dalla sorgente. Cellule esposte al segnale risponderà alla concentrazione locale nella loro posizione nel campo delle celle, con le cellule nelle posizioni distinte risposta diverso a diversi livelli di segnale. La prova dell&#39;esistenza di morphogens deriva da studi dei primi Drosophila embrione 7 e il disco dell&#39;ala 8, così come l&#39;arto vertebrato 9 e 10 del tubo neurale. I metodi sono necessari alvestigate come gradienti morfogeno sono stabilite e di individuare altre molecole importanti nella regolazione questi gradienti. Eleganti esperimenti che utilizzano immunoistochimica di visualizzare le proteine ​​endogene in vivo nel contesto di differenti background genetici sono stati utilizzati per indagare gradienti morphogen 11-12. Tuttavia, i buoni anticorpi e mutanti specifici non sono sempre disponibili, così abbiamo descritto qui un protocollo con sovraespressione di ligandi fluorescenti Xenopus, per fornire un&#39;alternativa, metodo semplice per analizzare come i prodotti genici esogeni possono influenzare la distribuzione di ligandi attraverso un campo di celle. Xenopus laevis fornisce un ottimo sistema di intraprendere questo tipo di esperimenti come i loro embrioni si sviluppano esternamente in modo che siano accessibili nelle prime fasi. Loro grandi dimensioni (1-1.5mm di diametro) semplifica microiniezione e manipolazione chirurgica e blastula stadi cellule sono facili da immagine in quanto sono ancora relativamente grande (circa 2081; m di diametro). Studi iperespressione di Xenopus sono semplici da fare: mRNA iniettate nel embrione precoce possono essere mirati a particolari cellule ed è efficace tradotti. I costrutti Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescente con tag sono stati generati utilizzando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 e eGFP. Il peptide HA è importante includere non solo per fornire un ulteriore indicatore molecolare, ma anche perché è pensato per fungere da distanziatore che separa le proteine ​​Wnt e eGFP permettendo entrambi i prodotti genici di funzionare. Il costrutto utilizzato per la visualizzazione di Shh è stato precedentemente utilizzato per generare un topo transgenico che esprime una proteina di fusione shh-eGFP 15; questo è stato gentilmente fornito da Andy McMahon. È importante sottolineare che il tag GFP per tutti i costrutti è clonato 3 &#39;alla sequenza del segnale in modo tale che viene mantenuta dopo l&#39;elaborazione. È anche essenziale per garantire che la proteina finale comprende sequenze necessarie modifiche, come la addition di lipidi, come è il caso di Shh e Wnt ligands.The cDNAs stati subclonato nel vettore pCS2 + di espressione che è ottimizzato per il prodution di mRNA sintetico; esso include un promotore SP6 e il segnale di poliadenilazione (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors). Il lavoro qui descritto fornisce un protocollo semplice per confrontare la secrezione e la diffusione di fluorescente tag Wnt e Shh contrassegnati leganti. Iniettando quantità definite di mRNA sintetico, il protocollo circumnaviga eventuali problemi connessi con l&#39;espressione variabile da vettori diversi utilizzando diversi promotori. Questi metodi sono stati recentemente applicato per studiare gli effetti del solfato endosulfatase eparan Sulf1 su Shh-eGFP e Wnt8a / secrezione Wnt11b-HA-eGFP e diffusione in Xenopus 16-17.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Ambion</td><td>From Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>Cap analog (m7G(5&#039;))</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J software</td><td></td><td></td><td>Free download http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips, No.1.5&amp;nbsp;</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glass needle puller</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>Glass pull needles</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Human chronic gonadotropin (HCG)</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Lithium chloride (LiCl)</td><td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 and Zen software (2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr><tr><td>Molecular grade water&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail varnish&amp;nbsp;</td><td>Boots</td><td>Bar code 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>Phenol-chloroform</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop software</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>High fidelity DNA polymerase and buffers&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&amp;nbsp; Buffer - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>PVC insulation tape</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzymes buffers</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free DNAse</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>Steel back single edge blades</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needles</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>Zen lite software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Free download&amp;nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

using confocal analysis of xenopus laevis to investigate modulators of wnt and shh morphogen gradients

Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare ligandi distribuiti attraverso un campo di cellule. La facilità di esprimere proteine ​​esogene, insieme con le grandi dimensioni delle loro cellule in embrioni precoci, fare Xenopus laevis un modello utile per la visualizzazione di ligandi GFP-tag. MRNA sintetici sono efficacemente tradotte dopo l&#39;iniezione in fase iniziale di Xenopus embrioni, e le iniezioni possono essere mirati a una singola cella. Se combinato con un tracciante lignaggio come membrana legato RFP, la cella iniettato (ei suoi discendenti) che stanno producendo la proteina overexpressed possono facilmente essere seguite. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione di fluorescenza etichettato Wnt e Shh ligandi da iniettare mRNA. I metodi coinvolgono la micro dissezione di espianti ectodermici (tappi di animali) e l&#39;analisi del ligando diffusione in più campioni. Utilizzando confocale, informazioni sulla secrezione ligando e diffusione su un campo di cellule può essere ottenuta. Le analisi statistiche delle immagini confocale forniscono dati quantitativi sulla forma di gradienti ligando. Questi metodi possono essere utili per i ricercatori che vogliono testare gli effetti dei fattori che possono regolare la forma di gradienti morphogen.

Analisi confocale di espianti protezione animale che esprimono proteine ​​fluorescenti tag fornisce un sistema efficace per la visualizzazione di distribuzione ligando in diverse condizioni sperimentali. In un esempio, la distribuzione di GFP etichettato Shh è mostrato (Figura 1). Nella fase 2 cellule, embrioni di Xenopus vengono iniettate in entrambe le cellule con una o con mRNA di controllo o con mRNA codificante per Sulf1, un enzima che modifica superficie cellulare eparan solfato e influenza il morphogen gradiente Shh 16. Questi embrioni vengono coltivati ​​fino allo stadio di 32 cellule e una singola cellula è co-iniettata con mRNA codificante per Shh-GFP e memRFP (come tracciante stirpe). Questo crea un clone di cellule che esprimono Shh-GFP che è contrassegnato con la membrana cellulare RFP legato. Nella fase blastula, espianti tappo animale sono prese per l&#39;analisi al microscopio confocale. La figura 1 mostra che in condizioni di controllo, Shh-GFP è secreta e diffonde al di fuori del reGion esprimere gli mRNA iniettati. Tuttavia, in presenza di Sulf1, Shh-GFP è più limitata nella sua distribuzione e, in questo esempio, non viene rilevato al di fuori del clone di cellule produttrici di esso. Gli effetti della Sulf1 sulla distribuzione Shh-GFP è stata analizzata più compiutamente 16. Quando espresso in embrioni di Xenopus, fluorescently etichettato ligandi Wnt sono secreti, accumulano sulla membrana cellulare, e diffondere attraverso il campo di cellule. Nella figura 2, ci caratterizzano le proprietà quantitaive e qualitative del due diversi fluorecently tagged ligandi Wnt nelle cellule iniettate ed esprimendo le proteine. Figura 2A-H mostra esempi di come Wnt8a e Wnt11b-HA-eGFP accumulano sulla membrana delle cellule del cappuccio animale . Confrontando pannelli 2B e 2F è chiaro che Wnt8a-HA-eGFP accumula più efficiente sulla membrana cellulare di Wnt11b-HA-eGFP. Le informazioni quantitative è stato estratto dalle immagini confocale utilizzando un comcombinazione di immagini e software di analisi di script (file di codice supplementare). La figura 2I mostra il relativo accumulo di Wnt8a-HA-eGFP sulla membrana cellulare rispetto al Wnt11b-HA-eGFP. I dati sono stati ottenuti utilizzando uno script computer che determina il numero totale di Wnt-HA-eGFP pixel co-localizzare con membrana cellulare pixel che compongono l&#39;immagine. In un altro approccio, il numero totale di Wnt-HA-eGFP puncta che co-localizza con la membrana cellulare vengono contati utilizza un software di analisi di immagine (Figura 2J). Informazioni qualitative circa le dimensioni e la forma del puncta individuo può anche essere estratto dai dati utilizzando un software di analisi delle immagini. Oltre a meno Wnt11b-HA-eGFP puncta co-localizzare con la membrana cellulare (Figura 2J) questi puncta hanno anche un dimensione media minore di Wnt8a-HA-eGFP puncta (Figura 2K). Inoltre, puncta Wnt11b-HA-eGFP hanno una circolarità ridotto rispetto al Wnt8a-HA-eGFP puncta (Figura 2L). Circularity è una misura di quanto un oggetto simile a un cerchio perfetto, con 1 che rappresenta un cerchio perfetto e 0,1 forma non circolare allungata. Questo approccio può essere utilizzato per testare qualsiasi regolatore candidato di Wnt ligando diffusione. Per fare ciò, le cellule di controllo devono essere iniettati con mRNA di controllo che codifica per una forma inattiva del regolatore candidato o una proteina irrilevante come il beta-galattosidasi (lacZ); ciò fornisce un controllo più valida che semplicemente non iniettare il regolatore. I dati in questi esempi sono stati analizzati con il test non parametrico di Mann-Whitney U 18-19. Un programma di analisi statistica è stato usato per eseguire il test. Nella figura 3, indaghiamo Wnt ligando diffusione. Una singola blastomere stato iniettato nella fase 4 celle tale che gli espianti tappo animale rappresenta un campo di celle in cui solo alcune cellule esprimono sia Wnt8a-HA-eGFP o Wnt11b-HA-eGFP. Inserendo un tracciante linea cellulare, possiamo identificare espressso a ip contro cellule non esprimere e questo permette la gamma di Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP ligando diffusione lontano dalle celle di origine da analizzare (figura 3B e 3C). A causa della curvatura delle espianti tappo animale, la distanza massima che può essere determinato in modo attendibile da questo test è stato 160μm, che non era sufficiente per misurare la distanza assoluta di ligando diffusione. Tuttavia, utilizzando una combinazione di analisi confocale, analisi delle immagini e l&#39;analisi scientifica e la rappresentazione grafica del software la forma complessiva del morfogeno gradiente Wnt-HA-eGFP potrebbe essere analizzato (Figura 3D). Questi dati possono essere utilizzati per verificare se overexpressing un&#39;altra proteina insieme con leganti taggati nelle stesse cellule possono influenzare la secrezione di Wnt o diffusione. In un altro tipo di esperimento (Figura 3E-3J) gli effetti di un potenziale regolatore a ricevere cellule può essere misurata attraverso la sovraespressione della proteina candidato cloni di cellule adiacenti cellule expremendo Wnt8a o Wnt11b-HA-eGFP. Questo consente a qualsiasi effetti non cellule autonome del regolatore su Wnt-HA-eGFP ligando diffusione da esaminare. Coerentemente con la Figura 2, più Wnt8a-HA-eGFP può essere rilevato diffondente distanti cellule rispetto Wnt11b-HA-eGFP in entrambi gli esperimenti di diffusione. I tipi di esperimenti descritti in questo documento sono stati utilizzati per analizzare l&#39;effetto di Sulf1 su Shh e Wnt segnalazione 16,17. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig1.jpg" /> Figura 1. Modulazione della distribuzione Shh-GFP può essere rilevato da analisi confocale di tappi animali Xenopus. (A) Un cartone raffigurante test sperimentale in cui gli embrioni sono dapprima iniettati con mRNA codificante per Sulf1 o un mRNA di controllo, gli stessi embrioni sono successivamente iniettati nella fase 32 celle con mRNA codificante per Shh-GFP in una singola cella. (BC) protezione animale espiantos sono stati presi in fase 8 e ripreso dopo 4 ore. Le immagini vengono visualizzate sul bordo di una Shh-GFP + memRFP esprimono clone di cellule. In embrioni di controllo (B), Shh-GFP è distribuito dalla memRFP marcata clone di cellule di produzione di segnali. In embrioni che esprimono Sulf1 (C), Shh-GFP è più limitata nella sua distribuzione, vedere 16. memRFP è mostrato in magenta e Shh-GFP in verde. Barre di scala rappresentano il 20 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53162/53162fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig2.jpg" /> Figura 2. quantitativa e qualitativa delle Wnt8a analisi e Wnt11b-HA-eGFP puncta sulla membrana cellulare. (AH) embrioni sono stati microiniettato bi-laterale con mRNA codifica memRFP (500 pg) nell&#39;emisfero animale allo stadio di due cellule. Inoltre gli embrioni sono stati iniettati con mR<html> Codifica NA (AD) Wnt8a-HA-eGFP (500 pg) o [EH] Wnt11b-HA-eGFP (1NG). Gli embrioni sono stati iniettati con codifica mRNA per LacZ per fornire un controllo per ulteriori mRNA / proteine ​​quando si analizzano gli effetti di qualsiasi regolatore di potenziale. Le scatole bianche in (C) e (G) segnano le zone ingrandite in pannelli (D) e (H), rispettivamente. La quantità totale Wnt-HA-eGFP fluorescenza co-localizzazione con la membrana cellulare è stato calcolato utilizzando il software di analisi di immagine e di script e quindi normalizzato (I). Informazioni di natura qualitativa è stato estratto utilizzando il software di analisi delle immagini. Wnt8a e Wnt11b-HA-eGFP punctae sono stati analizzati per numero di particelle (J), la dimensione delle particelle (K) e la circolarità delle particelle (L). Mann-Whitney U (** P &lt;0,01), N = numero di embrioni. memRFP è mostrato in magenta e Wnt8a / 11b-HA-GFP è mostrato in verde, barre di scala rappresentano 20μm.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig3.jpg" /> Figura 3. Misurazione della gamma di diffusione di fluorescente tag ligandi Wnt. (A) Schema raffigurante il test usato per misurare Wnt8a e Wnt11b-HA-eGFP secrezione e la diffusione via dalle cellule che esprimono. (BC) codifica mRNA (B) memCerulean (600 pg), LacZ (4NG) e Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) o (C) memCerulean (600 pg), LacZ (4NG) e Wnt11b-HA-eGFP (2 ng ) è stato iniettato nel nell&#39;emisfero animale di una blastomeri allo stadio di quattro cellule. (D) La gamma di diffusione di Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP è stata misurata attraverso un fondo di controllo. (E) Schema raffigurante il test usato per misurare Wnt8a e Wnt11b-HA-eGFP diffusione attraverso un fondo che esprime LacZ, vedi metodo per det<html> affligge. (FG) mRNA codificante memCerulean (600 pg) e (F e H) Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) o (G e I) Wnt11b-HA-eGFP è stata iniettata nell&#39;emisfero animale di un blastomero a quattro fase delle cellule. Un blastomeri adiacente è stato iniettato con mRNA codifica memRFP (600 pg) e LacZ (4 ng) vedi chiave per i dettagli. (J) La gamma di Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP diffusione è stata misurata attraverso un fondo che esprime LacZ. I dati sono stati quantificati e tracciati utilizzando l&#39;analisi confocale, analisi delle immagini e analisi scientifica e software grafici. memCerulean (blu (CD) e Giallo (F e H)), Wnt-HA-eGFP (verde), memRFP (magenta), barre di scala rappresentano 20 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53162/53162fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare una versione più grande di questo file.</a> file / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg &quot;/&gt; Tabella 1. Primer utilizzati per subclone Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP e Shh-GFP in pCS2. <table><tbody><tr><td> Reazione </td><td> Componenti </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esempio CS2 + digest </td><td> 1,5 mg di pCS2 + </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ml di restrizione enzimatica 1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ml di restrizione enzimatica 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 ml di tampone di restrizione enzimatica (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Costituito a 50 ml con acqua grado molecolare </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esempio di sintesi di mRNA </td><td> 2 ml modello linearizzato </td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 microlitri 10x Megascript mix trx </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ml 50mM ATP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 microlitri 50mM CTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 microlitri 50mM UTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ml 5mM GTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 microlitri 40mM Cap analogico (M7G (5 &#39;) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 microlitri mix SP6 enzima </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acqua di grado molecolare 3.5 ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esempio reazione PCR </td><td> 0,5 microlitri polimerasi del DNA ad alta fedeltà (2.000 unità / ml) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ng Sagoma del DNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 ml di forward e reverse primer (10 micron) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0.5ml di dNTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 ml di tampone ploymerase DNA (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Costituito a 50 ml con acqua grado molecolare </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Condizioni Esempio di PCR </td><td> Intial denaturazione 2 min a 98 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 sec 98 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 sec 65 ° C </td><td> 30 cicli </td></tr><tr><td></td><td> 40 sec 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Estensione finale 10 min a 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esempio di PCR prodotto digest </td><td> 28 ml di prodotto di PCR </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ml di restrizione enzyme 1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ml di restrizione enzimatica 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 ml di tampone di restrizione enzimatica (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acqua di grado molecolare 13 microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esempio T4 legatura </td><td> 1 ml Cut CS2 + </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 ml Cut PCR prodotto 1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 ml Cut PCR prodotto 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 ml di T4 DNA ligasi </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 microlitri DNA ligasi T4 tampone (10X) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acqua di grado molecolare 1 ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esempio modello digerire </td><td> Plasmidi DNA 5 ug </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 microlitri di buffer di restrizione enzimatica (10X) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 ml no1 (tranne Shh-GFP, Kpn1 è utilizzato) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Costituito a 100 ml con acqua grado molecolare </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Esempio condizioni di reazione utilizzate per la produzione di mRNA subcloning e sintetico per Wnt8a-HA-eGFP. <table><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Componenti </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Cisteina-HCL </td><td> 0,1 X. NAM </td></tr><tr><td></td><td> 2,5% di L-cisteina cloridrato monoidrato (pH7.8) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Sali NAM </td><td> 110 mM NaCl </td></tr><tr><td></td><td> 2 mM KCl </td></tr><tr><td></td><td> 1 CA mm (NO3) 2 </td></tr><tr> &lt;td&gt; </td><td> 0,1 mM EDTA </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 2 </td><td> Sali 0.5X NAM </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM HEPES pH7.4 </td></tr><tr><td></td><td> 0.25 Bicarbonato mM </td></tr><tr><td></td><td> 25 ug / ml Gentamicina </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 3 + Ficoll </td><td> Sali 0.33X NAM </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM HEPES pH7.4 </td></tr><tr><td></td><td> 0.25 Bicarbonato mM </td></tr><tr><td></td><td> 2 5UG / ml Gentamicina </td></tr><tr><td></td><td> 5% Ficoll </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 10 </td><td> Sali 0,1 X. NAM </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM HEPES pH7.4 </td></tr><tr><td></td><td> 25 ug / ml Gentamicina </td></tr></tbody></table> Tabella 3. soluzioni utilizzate durante la produzione e la microiniezione di Xenopus laevis embrioni.

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

using-confocal-analysis-xenopus-laevis-to-investigate-modulators-wnt

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

11.1K Views.  The Bateson Centre, University of Sheffield.  Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen. 

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

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The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neuroscienze

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt signaling operates via a dosage-driven mechanism, motivating the need to study and measure Wnt signaling in various cell types. Although several reporter models have been proposed to represent physiological Wnt expression, either the genetic context or the reporter protein highly influenced the validity, accuracy, and flexibility of these tools. This paper describes methods for acquiring and analyzing data obtained with the Axin2-mTurquoise2 mouse Wnt reporter model, which contains a mutated Axin2em1Fstl allele. This model facilitates the study of endogenous canonical Wnt signaling in individual cells over a wide range of Wnt activity.
This protocol describes how to fully appreciate Axin2-mTurquoise2 reporter activity using cell population analysis of the hematopoietic system, combined with cell surface markers or &#946;-catenin intracellular staining. These procedures serve as a base for implementation and reproduction in other tissues or cells of interest. By combining fluorescence-activated cell sorting and confocal imaging, distinct canonical Wnt expression levels can be visualized. The recommended measurement and analysis strategies provide quantitative data on the fluorescent expression levels for precise assessment of canonical Wnt signaling. These methods will be useful for researchers who want to use the Axin2-mTurquise2 model for canonical Wnt expression patterns.

Signaling levels are known to regulate cell fate, indicating that regulation of Wnt signaling constitutes an interesting therapeutic target. Here, we describe flow cytometry and confocal microscopy analysis methods for a robust murine canonical Wnt signaling reporter model that measures distinct Wnt signaling levels.

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt ...

Utilizzando Analisi confocale di

Riepilogo

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Cellule staminali simil-

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni

Culture Explant neurali di

Dissezione, Cultura, e analisi di

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes