We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

NOTA: Le tre parti del protocollo descrivono l&#39;esposizione acquosa del farmaco DZNep alle zanzare larvali, un&#39;esposizione a base di sangue di DZNep per femmine adulte di studiare l&#39;effetto della fecondità, e SAH idrolasi inibizione da DZNep misurati utilizzando una semplice tecnica colorimetrica. Una rappresentazione schematica di questi test è mostrato in figura 1. 1. immaturi Mosquito sviluppo e la sopravvivenza saggi NOTA: Questa sezione spiega l&#39;uso di un farmaco solubile in acqua che colpisce lo sviluppo larve di zanzara e la sopravvivenza. <ol><li> Hatch A. uova gambiae a 28 ° C in acqua distillata (dH 2 O) e posteriore loro di 2 ° instar larve. </li><li> Prendete un DNAse sei bene, RNAse gratuito piastra di coltura cellulare e versare 10 ml dH 2 O per ogni bene. </li><li> Selezionare le larve di zanzara al 2 ° instar e aggiungere 15 larve per bene. Prima di aggiungere 2 ° instar larve alla piastra, pli ut su un tovagliolo di carta per 2-3 secondi per eliminare l&#39;acqua in eccesso. </li><li> Pozzi Label con nastri colorati di randomizzare esperimento. Etichetta 2 pozzetti per concentrazione di prova su ciascuna piastra (Figura 2). </li><li> Preparare una cloridrato 1 DZNep mm (MW = 298,73) stock soluzione sciogliendo 0,3 mg DZNep in 1 ml di dH 2 O. Aggiungere soluzione madre di DZNep.HCl ai pozzi etichettati per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micron e 5,0 micron. NOTA: La soluzione madre può essere conservato a 4 ° C per il breve termine (1 giorno a un mese) o -20 ° C per un lungo periodo (più di un mese). NOTA: aggiunta della soluzione stock con concentrazioni suddetti non cambierà il volume di acqua nei pozzi significativamente. Tuttavia nel caso di concentrazioni molto più elevate, si consiglia di sciogliere il composto nel mezzo larvale per evitare qualsiasi diluizione inutili del composto. </li><li> Aggiungere la stessa quantità di cibo per pesci fiocco di ogni bene. Coprire la piastras e incubare a 28 ° C in un incubatore. </li><li> Registrare la mortalità per le zanzare larve DZNep-trattati e non trattati, dopo un periodo di esposizione di 24 ore. Rimuovere e scartare qualsiasi larve morte. Ripetere questa registrazione ogni giorno fino a quando tutti muoiono larve o pupate ed emergere come gli adulti. Registrare le dimensioni delle larve ogni due giorni, ossia, il giorno 0, 2, 4, 6, 8, fino pupate. </li><li> Analizzare lo sviluppo e mortalità larvale dati mediante un adeguato software di analisi statistica. NOTA: Un grafico a barre può essere utilizzato per rappresentare i dati di mortalità in Microsoft Excel. Analisi multivariata della varianza (MANOVA) eseguita con un software come JMP o SPSS rivelerà se diverse dosi del farmaco determinano sopravvivenza significativamente differente di larve di zanzara. </li></ol> 2. Fecondità Assay somministrando Drug Attraverso alimentatore artificiale a Female zanzare NOTA: Questa sezione descrive l&#39;aggiunta del farmaco al sangue unnd alimentandola a zanzare femmina adulti utilizzando un sistema di alimentazione artificiale. <ol><li> Impostare gabbie zanzara adulta, con uguale numero di zanzare maschio e femmina per il controllo e la gabbia di prova. Fornire una soluzione di zucchero del 10% imbevuto di batuffoli di cotone per entrambe le gabbie fino le femmine sono pronte per l&#39;alimentazione (3-5 giorni è ottimale per la Anopheles gambiae). </li><li> 2 ore prima della somministrazione di sangue, rimuovere le palline di cotone per assicurare le femmine sono affamati. </li><li> Assemblare due alimentatori sanguigni artificiali che consistono di un ampio imbuto rovesciato fondo di vetro (diametro = 50 mm, lunghezza = 70 mm) e una plastica circostante sigillato con colla industriale. Montare tubi di plastica (diametro = 7 mm) a due uscite alimentatori &quot;(diametro 10 mm) tramite connettori per afflusso e il deflusso delle acque. Etichettare i due alimentatori come &quot;controllo&quot; e &quot;5 micron DZNep.&quot; </li><li> Utilizzando un elemento riscaldante disponibile in commercio, impostare il programma per l&#39;alimentazione. In &quot;Menu&quot; andare su &quot;Impostazioni&quot;e selezionare &quot;Valori di riferimento&quot;; appariranno programmi precaricati. Selezionare &quot;SP1&quot; e impostare la temperatura per 37 ° C. NOTA: La resistenza assicura che il sangue somministrata viene mantenuto ad una temperatura costante. Impostazioni del programma aggiuntive possono essere utilizzate per diverse specie di zanzare o di insetti. </li><li> Riempire un secchio con acqua e immergere l&#39;elemento riscaldante in acqua. </li><li> Tagliare un pezzo quadrato di Parafilm (50 mm x 50 mm) e si estendono per fare un film sottile membranosa. Coprire il fondo delle mangiatoie artificiali con il Parafilm. Tagliare un altro pezzo di Parafilm (50 mm x 10 mm), allungare e sigillare i bordi degli alimentatori. </li><li> Assemblare il sistema, collegando gli alimentatori e resistenza dai tubi. Una volta completato, accendere il sistema e selezionare &quot;SP1&quot;. Premere &quot;Enter&quot; per avviare il sistema. NOTA: L&#39;acqua avrà riscaldata a 37 ° C e mantenuta a tale temperatura. </li><li> Monitor the la temperatura dell&#39;acqua con un termometro nel secchio d&#39;acqua. NOTA: I connettori e tubi aiutano a mantenere una costante circolazione di acqua attraverso il sistema in modo che la temperatura del sangue rimane a 37 ° C. </li><li> Riempire un vassoio fondo piatto con una soluzione di candeggina al 10% che verrà utilizzata per decontaminare eventuali sversamenti di sangue. </li><li> Aggiungere 2 ml di sangue di pecora defibrillato in una provetta. Etichettare questo come &quot;Control&quot;. Ripetere il processo per il tubo sperimentale etichettato come &quot;5 micron DZNep&quot; Add 6 ml di soluzione di riserva DZNep (vedi punto 1.5) al tubo sperimentale con l&#39;etichetta &quot;5 micron DZNep&quot; mescolare delicatamente il sangue e droga invertendo più volte. Incubare il tubo 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando una pipetta, aggiungere 2 ml di controllo e di sangue di prova per la parte superiore di alimentatori corrispondentemente etichettati. Gettare la pipetta nella soluzione di candeggina. Coprire la gabbia con un sacchetto scuro e respirare l&#39;aria sulla gabbia periodicamente per incoraggiare females per l&#39;alimentazione. </li><li> Lasciate che le zanzare si nutrono per circa 30 min. Una volta che l&#39;alimentazione è completata, spegnere la resistenza, prendere le mangiatoie fuori e striscia la Parafilm. Mettere a bagno l&#39;alimentatore in soluzione di candeggina per circa 5 minuti e risciacquare bene con acqua deionizzata. </li><li> Rimuovere gli alimentatori e mettere batuffoli di cotone con acqua e zucchero sulle gabbie per 48 ore. Inserire un piatto di uova contenente acqua e carta da filtro nelle gabbie durante la notte per facilitare la deposizione delle uova. Etichettare ogni piatto di uova con la rispettiva concentrazione di prova o di controllo. </li><li> Rimuovere il piatto di uova giorno successivo ed esaminare il numero e la struttura di uova al microscopio stereo. Ottenere immagini utilizzando il software Q-colors5. Contare il numero di uova. Analizzare differenza nel numero di uova provenienti da test e di controllo gabbie. NOTA: Un t-test non appaiati può essere utilizzato per determinare se il numero di uova sono significativamente differenti (p ≤0.05). </li></ol> 3. biochimica Assay di Mosquito Enzyme Inhibitionby Drug NOTA: Questa sezione descrive un saggio di attività enzimatica utilizzando DTNB come indicatore per determinare l&#39;effetto di DZNep su SAH idrolasi inibizione in maschio adulto e zanzare femmina. <ol><li> Preparare una soluzione 0,1 M Na 2 HPO 4 (sodio fosfato bibasico) aggiungendo 14,19 g di Na 2 HPO 4 a 1 L di dH 2 O. Quindi, preparare una soluzione 0,1 M NaH 2 PO 4 (sodio fosfato monobasico) aggiungendo 13,79 g di NaH 2 PO 4 a 1 L di dH 2 O. </li><li> Titolare il M Na 2 HPO 4 soluzione 0.1 con la soluzione 4 0.1 M NaH 2 PO a pH 8,5. NOTA: Questa sarà la soluzione madre di lavoro di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparare una soluzione di omogeneizzazione 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aggiungendo 0,3% Triton X-100. NOTA: La soluzione di omogeneizzazione può essere conservato a 4 ° C. </li><li> Prepare una soluzione 1.6 mM SAH (MW = 384,4) sciogliendo 6,15 mg di SAH in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparare una soluzione 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) sciogliendo 6,3 mg di DTNB in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenere la soluzione DTNB fresco sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare una DZNep.HCl 1 mM (MW = 298,73) soluzione sciogliendo 0,3 mg di DZNep in 1 ml dH 2 O. Successivamente, diluire la soluzione 1 mM DZNep in una serie di concentrazioni da 1,000 a 0,002 mM mM in dH 2 O. </li><li> Per misurare la SAH idrolasi inibizione da DZNep, preparare un estratto enzimatico crudo di zanzare: Omogeneizzare 10 zanzare adulte non sangue-fed in 1 ml di ghiacciata 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenente 0,3% Triton X- 100, utilizzando un omogeneizzatore fibra di vetro. Trasferire l&#39;omogeneizzato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato per 5 minuti a 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un ambiente pulito1,5 ml provetta. Utilizzare il surnatante come fonte dell&#39;enzima per il saggio biochimico SAH. </li><li> Per il trattamento vuota (cioè non DZNep, senza enzimi), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, e 100 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) per i singoli pozzetti di una 96 pozzetti, micropiastra fondo piatto. </li><li> Per il controllo (cioè non DZNep), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, 50 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) e 50 microlitri enzima (SAH idrolasi ottenuto da estratto grezzo) all&#39;individuo pozzi. </li><li> Per i trattamenti DZNep, aggiungere 50 ml 1.6 SAH mm, 50 ml 1.6 DTNB mm, 50 microlitri di enzimi e 50 ml concentrazione DZNep selezionato singoli pozzi. Preparare 4 repliche per il trattamento e il controllo. </li><li> Leggere la densità ottica (OD) dei campioni enzimatici SAH a 405 nm per 5 minuti a intervalli di 20 sec utilizzando un lettore di micropiastre a 96 pozzetti. </li><li> Sottrarre la DO vuoto dal controllo di unnd trattamento OD ottenuto da ciascun pozzetto. Calcolare la percentuale rimanente attività di idrolasi SAH utilizzando la seguente equazione:% residuo attività = (Trattamento OD / controllo OD) x 100. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ci sono diversi passaggi vitali per l&#39;efficace applicazione di questo protocollo. Per il saggio larvale, occorre prestare attenzione a etichettare e replicare ogni concentrazione correttamente. Randomizzazione campioni di prova e aggiungendo la quantità di farmaco designato a rispettivi pozzetti di test è una parte importante di questo set up sperimentale. Prima di aggiungere 2 ° instar larve di zanzara ad una micropiastra a 96 pozzetti, ogni larva può essere messo su un tovagliolo di carta per 2-3 secondi per eliminare l&#39;acqua in eccesso. Per prevenire l&#39;essiccamento, larve deve essere immediatamente trasferita ai pozzetti con un paio di pinze smussato. Ciò garantisce il volume d&#39;acqua in ciascun pozzetto della micropiastra e la concentrazione di farmaco rimane come previsto. Quando si trasferiscono le larve per misurare la lunghezza del corpo, si raccomanda di mettere le larve in ghiaccio per pochi minuti al fine di mantenerli stazionaria. Momento dell&#39;adeguamento di tale protocollo per una mescola diversa, occorre prestare attenzione per determinare la quantità di soluzione aggiunto ad ognibene. In tali casi, potrebbe essere preferibile sciogliere la quantità calcolata di composto in acqua direttamente prima di aggiungere le larve in ogni micropiastra. Per i test di alimentazione del sangue, è di vitale importanza che le zanzare sono affamate opportunamente rimuovendo acqua e zucchero, almeno 2 ore prima dell&#39;esperimento. In caso contrario, può causare alimentazione incompleta e poco effetto sulla produzione di uova femmina adulta. Miscelazione accurata e uniforme distribuzione del farmaco nel sangue è un passo importante e, come DZNep richiede alcuni minuti per sciogliere. Se il sangue di droga trattata è alimentato immediatamente, DZNep non ottiene equamente distribuita nel sistema zanzare. Si raccomanda vivamente che il sangue defibrillato è fresco (cioè meno di una settimana dalla data di estrazione) per ottenere risultati migliori. Ci sono più passaggi critici per il successo di un saggio biochimico con un composto di interesse. Le concentrazioni di ogni soluzione di riserva utilizzati in questo proto<html> col sono stati ottimizzati per DZNep. Per adattare il protocollo per un composto diverso, si consiglia di testare una serie di diversi pH, SAH, le concentrazioni DTNB e dimensioni del campione di insetti per determinare i risultati più affidabili. Preparazione dell&#39;estratto enzimatico greggio è il passo più tempo in questa procedura. Durante la preparazione omogeneizzato si consiglia di utilizzare non più di 10 zanzare adulte, come lipidi presenti nel surnatante può ostacolare la lettura di assorbanza. Per evitare questo problema, lo strato superiore di lipidi nel surnatante (utilizzando una micropipetta singolo canale) può essere rimosso dopo passo 3.8. Surnatante deve essere trasferito in una provetta per microcentrifuga pulita. Fase 3.8 deve essere ripetuta per ignorare le restanti lipidi viscosi. Il restante surnatante chiaro deve essere raggruppato da tutti i tubi e miscelato delicatamente. Una pipetta multicanale può essere utilizzato per una maggiore efficienza aggiungere SAH nei pozzetti. DTNB viene usato come indicatore nel test, e dovrebbe essere preparato ultima e tenuta in ghiaccio. nt &quot;&gt; Questo protocollo offre all&#39;utente semplici passi per testare gli effetti di un composto in diverse fasi della vita di zanzare. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni all&#39;utilizzo di questo protocollo. Questa tecnica dipende principalmente dalla solubilità in acqua di DZNep. Immaturo larve sono esposti al farmaco disciolto nei loro mezzi circostanti. Se il composto in fase di sperimentazione è insolubile in mezzi acquosi, si può rendere questo protocollo meno efficiente. Per testare la fecondità, abbiamo sottoposto le femmine adulte di droga disciolti nel sangue di pecora defibrillato. Questo non sarebbe possibile se un laboratorio alleva colonie di zanzare sul sangue di mammiferi direttamente (cioè, utilizza topi o cavie per l&#39;alimentazione zanzare). La combinazione di diversi saggi descritti in questo articolo fornisce all&#39;utente un nuovo modo di testare gli effetti di un composto solubile in acqua di insetti. DZNep è in gran parte aggiunta alle linee di cellule in vitro per la ricerca sul cancro; Tuttavia, questo protocollo permette user di esaminare eventuali effetti sulle diverse fasi di vita di un insetto in vivo. Inoltre, fornisce anche il ricercatore con le linee guida step-by-step per analisi tossicologiche. In letteratura, la conoscenza è limitata per quanto riguarda gli effetti dei farmaci epigenetici sugli insetti. Utilizzando DZNep come esempio, forniamo una procedura che può essere utilizzato come un passo prerequisito verso esplorare altri farmaci epigenetici o nuovi composti come potenziali agenti di controllo degli insetti. Sebbene questo protocollo è stato sviluppato per la zanzara malaria, può essere adattato per testare l&#39;effetto di DZNep, o qualsiasi composto idrosolubile di interesse, in altre specie di zanzara o insetti.

La malaria è responsabile per il maggior numero di decessi insetti correlati al mondo. Si stima che circa 219 milioni di casi si verificano ogni anno in tutto il mondo, causando circa 660.000 morti, soprattutto in Africa 1. Nonostante gli sforzi concertati, la malaria programmi devono affrontare diverse sfide. Mentre insetticide trattati zanzariere e coperte componenti chiave forma irrorazione residue del programma, la resistenza agli insetticidi in popolazioni locali ostacolano questi sforzi 2. Il rapido aumento delle popolazioni di zanzare resistenti agli insetticidi è in gran parte attribuibile alla capacità delle zanzare di malaria di adattarsi rapidamente ai cambiamenti nel loro ambiente e sfruttare diverse nicchie 3,4,5. Per superare gli attuali meccanismi di resistenza agli insetticidi, l&#39;esplorazione di nuovi obiettivi insetticida e composti di nuova generazione è garantito. Un protocollo semplice, step-by-step per determinare l&#39;efficacia di insetticidi sperimentali sulle diverse fasi di vita della malaria mosquitoes avrebbero migliorare significativamente questi sforzi. Studi farmacologici di effetti dei farmaci sulle linee cellulari e modelli animali hanno stabilito l&#39;uso di farmaci epigenetici come un utile strumento per modulare la genetica e la fisiologia delle cellule e degli organismi. Metilazione del DNA e modificazione degli istoni sono due meccanismi epigenetici che influenzano l&#39;espressione genica in organismi pluricellulari senza cambiare la sequenza del DNA sottostante 6. Modificazioni post traduzionali quali metilazione svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell&#39;integrità cellulare e l&#39;espressione genica, e possono influenzare alcuni processi fondamentali 7,8,9. La ricerca in alcune specie di insetti hanno evidenziato l&#39;importanza di epigenetica in processi che coinvolgono oogenesi e staminali manutenzione cella 10, così come compensazione del dosaggio 11. Tuttavia, sono ancora da esplorare questi aspetti in vettori di malattie. Utilizzo di un composto a modulare questo sistema in zanzare potrebbe fornirci inluoghi nel romanzo percorsi di destinazione insetticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) è un inibitore della metilazione dell&#39;istone noto, che hanno un impatto su vari tipi di tumori sono stati studiati 12,13,14,15,16. DZNep è un farmaco stabile idrosolubile epigenetica che inibisce indirettamente istone lisina N -methyltransferase (EZH2), un componente del complesso Polycomb repressione 2 (PRC2) in cellule di mammifero. PRC2 svolge un ruolo importante nel regolare la crescita delle cellule staminali in organismi pluricellulari, e metilazione è un aspetto fondamentale della PRC2 mediato silenziamento genico. Nei topi immunocompromessi, cellule pre-trattati con DZNep hanno dimostrato di essere meno cancerogeno 17. Questo farmaco sta diventando utilizzato per lo studio di altre malattie, come la malattia del fegato grasso non-alcolica, in cui è implicato EZH2 18. DZNep è un consolidato S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) inibitore idrolasi 19, 20. L&#39;inibizione dei risultati idrolasi SAH in unaccumulo di SAH e, a sua volta, porta alla inibizione dell&#39;attività metiltransferasi limitando gruppi donatori di metile disponibili. SAH è un derivato aminoacido utilizzato da molti organismi, inclusi gli insetti, nelle loro vie metaboliche. Un recente studio ha dimostrato che DZNep in basse dosi possono influenzare diapausa e ritardare lo sviluppo negli insetti 21. Qui, un protocollo robusto per studiare gli effetti di un composto solubile in acqua su diverse fasi di vita di zanzare si sviluppa. Le tre parti di questo protocollo sono le istruzioni per esaminare gli effetti di un composto idrosolubile sulle zanzare immaturi, adulti femmine si nutrono di sangue, e l&#39;attività enzimatica di maschio adulto e zanzare femmina. Innanzitutto, DZNep viene sciolto in acqua per studiare lo sviluppo zanzara immaturo e sopravvivenza. Questa operazione viene eseguita in due concentrazioni di confrontare le differenze derivanti da aumento di 10 volte in esposizione al farmaco. Per esplorare l&#39;effetto del farmaco sulla adulti zanzare femmina, DZNepsi aggiunge al sangue di pecora defibrillato e alimentato artificialmente il sangue alle femmine. Successivamente, il risultato del farmaco sulla fecondità viene esaminato. Infine, un saggio di attività enzimatica viene eseguita utilizzando 5,5&#39;-dithiobis- (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) come indicatore per determinare l&#39;effetto di DZNep sulla SAH idrolasi inibizione maschio adulto e zanzare femmina. Mentre questo protocollo è sviluppato con una zanzara malaria, Anopheles gambiae, può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei composti di interesse in qualsiasi specie di zanzara o altri insetti. Le tecniche descritti in questo protocollo non possono essere applicate in modo efficiente per un farmaco con limitata o nessuna solubilità in acqua o mezzi acquosi.

<table><tbody><tr><td>96-well microplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>A different centrifuge can be used</td></tr><tr><td>Colored tape rolls</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Egg dish cups</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter papers</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Glass feeders</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating element</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>A different incubator can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 2&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 1.5&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH meter&amp;nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>store at -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

Resistenza insetticida pone un grave problema per i programmi di controllo della malaria. Le zanzare si adattano a una vasta gamma di cambiamenti nell&#39;ambiente rapidamente, rendendo il controllo della malaria un problema onnipresente nei paesi tropicali. L&#39;emergere di popolazioni resistenti agli insetticidi garantisce l&#39;esplorazione di nuovi percorsi di destinazione della droga e composti per il controllo del vettore zanzara. Farmaci epigenetici sono ben stabiliti nella ricerca sul cancro, tuttavia, non si sa molto circa i loro effetti sugli insetti. Questo studio fornisce un semplice protocollo per esaminare gli effetti tossicologici di 3 Deazaneplanocin A (DZNep), un farmaco epigenetico sperimentale per la terapia del cancro, sul vettore della malaria, Anopheles gambiae. Un aumento di concentrazione-dipendente della mortalità e riduzione delle dimensioni è stata osservata in zanzare immaturi esposti a DZNep, mentre il composto ha ridotto la fecondità delle zanzare adulte rispetto a controllare i trattamenti. Inoltre, c&#39;è stata una diminuzione tossicodipendenti in S -adenosilomocisteina (SAH) attività di idrolasi in zanzare in seguito all&#39;esposizione a DZNep rispetto per controllare i trattamenti. Questi protocolli forniscono il ricercatore con una semplice procedura, step-by-step per valutare più endpoint tossicologici per un farmaco sperimentale e, a sua volta, dimostrano un approccio multi-polo unico per esplorare gli effetti tossicologici di farmaci o composti di epigenetici idrosolubili interessi contro le zanzare vettore e altri insetti.

La figura 1 è una rappresentazione schematica dei saggi; descrive le varie fasi della procedura descritta in questo articolo. Poiché il protocollo si basa su diversi cicli di vita zanzare, non vi è alcuna particolare sequenza da seguire per gli esperimenti qui descritti. L&#39;utente può scegliere di effettuare uno o più test contemporaneamente, a seconda della disponibilità di esempio. Figura 2 mostra la piastra impostato per lo sviluppo e la sopravvivenza delle zanzare saggi immaturi. Il numero di concentrazioni di prova e replicati può essere modificato a seconda delle esigenze dell&#39;utente e disponibilità di droga. Per il saggio di zanzara immaturo, 1 soluzione madre mM di DZNep inserito in acqua contenente le zanzare per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micron e 5 micron insieme con una padella di controllo con pozzetti contenenti una popolazione libera dalla droga. L&#39;esperimento ha dimostrato che più larve e pupe survived nei pozzetti di controllo che nei pozzetti DZNep trattati. Figura 3 mostra l&#39;effetto di DZNep sulla sopravvivenza complessiva delle zanzare malaria durante l&#39;esperimento. I risultati dimostrano che il farmaco DZNep epigenetica sopprime la crescita e lo sviluppo e induce la mortalità delle zanzare immaturi. La maggior parte della zanzara esposto a 0,5 mM morto per giorno 10 dell&#39;esperimento, mentre un gran numero di individui esposti a 5 pM morto per giorno 8. In contrasto, la mortalità delle zanzare nel trattamento di controllo (nessun farmaco) rimasta inalterato e diversi emerso come adulti il ​​giorno 8 dell&#39;esperimento. Una relazione inversa è stata osservata tra concentrazione di farmaco e le dimensioni del corpo della zanzara (Figura 4). Figura 5 illustra l&#39;effetto di DZNep sulla fecondità zanzara. Adulti zanzare femmine alimentate con sangue contenente DZNep mostrato una reductio significativon in numero di uova vitali. La figura 5A mostra uova provenienti da gabbia di controllo (nessun farmaco). La figura 5B mostra le uova provenienti da gabbia di prova. Un gran numero di uova provenienti da gabbia di prova erano di colore più scuro e mancava galleggianti (espansioni pieni d&#39;aria di exochorion) se confrontato con uova provenienti da normali zanzare femmina sangue-fed (Figura 6). L&#39;assenza di carri allegorici insieme con le uova di colore più scuro indica il potenziale ruolo dell&#39;epigenetica in formazione exochorion. Figura 7 dimostra l&#39;effetto di DZNep sull&#39;attività idrolasi SAH in maschio adulto e le zanzare della malaria femminili. Una diminuzione DZNep-dipendente in OD si osserva per ogni trattamento farmacologico rispetto al trattamento di controllo (nessun farmaco) che indica che DZNep inibisce l&#39;attività idrolasi SAH. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig1highres.jpg" width = &quot;700px&quot; /&gt; Figura 1:. Rappresentazione schematica di test utilizzando un farmaco epigenetico su zanzare della malaria La parte sinistra dello schema mostra lo sviluppo e la sopravvivenza test con zanzare immaturi. La parte centrale mostra l&#39;analisi fecondità via nutrono di sangue il farmaco per femmine adulte. La parte destra raffigura il saggio biochimico di inibizione enzimatica dal farmaco. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig2highres.jpg" /> Figura 2: Piastra descrive lo sviluppo di zanzara immaturo e test sopravvivenza Label pozzetti di controllo segni di &quot;C&quot;.. Label &quot;0,5&quot; mostra pozzi con 0,5 micron DZNep. Label &quot;5&quot; indica pozzi con 5 micron DZNep. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig3highres.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; Effetto DZNep sulla sopravvivenza delle zanzare della malaria. mortalità concentrazione-dipendente è osservato con zanzare immaturi. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig4highres.jpg" /> Figura 4:... Effetto di DZNep sullo sviluppo delle zanzare immaturi (A) Larva dal trattamento di controllo (size = 5 mm) (B), Larva trattati con 0,5 mM DZNep (size = 4 mm) (C), Larva trattato con 5 pM DZNep (size = 3 mm). Tutti larve sono stati misurati nello stesso giorno dell&#39;esperimento. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig5highres.jpg" /> Figura 5:. Effetto di DZNep sulla zanzara fecondità Piatto dell&#39;uovo dal trattamento di controllo (nessun farmaco) zanzare contiene molto maggiore numero di uova (A) comparosso con il piatto di uova delle femmine trattati con 5 mM DZNep (B). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig6highres.jpg" /> Figura 6: Effetto di DZNep sulla struttura uovo in zanzare malaria visto sotto un microscopio. (a) le uova dal trattamento di controllo (senza farmaco) zanzare visualizzare carri allegorici e gruppi rosetta. (b) le uova delle zanzare trattati con 5 micron DZNep mancano carri allegorici e gruppi rosetta-like. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig7highres.jpg" /> Figura 7:. SAH idrolasi inibizione da DZNep in zanzare malaria DZNep provoca una diminuzione OD rispetto al trattamento di controllo (nessun farmaco).

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Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Genetica

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Ibridazione in situ a fluorescenza per studiare la spermatogenesi delle zanzare

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

Autore in primo piano: Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Biologia

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolli per testare la tossicità di romanzo chimiche insetticide per le zanzare

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

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