This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. Preparazione delle Culture Fly, soluzioni e dispositivi Embryo Handling <ol><li> Preparare una cultura gabbia di Drosophila. Mettere 500 + accoppiamento in linea del ceppo desiderato in una gabbia di popolazione dotata di una piastra di uva-agar 10 centimetri e un po &#39;di lievito in pasta. Mantenere la cultura in un incubatore controllata di 25 ° C umidità. Nota: &#160; Culture Cage richiedono un giorno o due di condizionamento per ottenere modelli di embrione posa coerenti. Piastre di uva con lievito in pasta vengono cambiati una volta al mattino e una la sera durante il condizionamento. </li><li> Preparare EPS. Le soluzioni caldi di tensioattivi (cocamide DEA e alcool etossilati) a 37 ° C. Pipettare 18 ml di d-limonene ad una fiala di scintillazione in vetro munito di una piccola ancoretta. Pipettare 1 ml ciascuno dei due tensioattivi (concentrazione finale 5% di ciascuna) al d-limonene. Mescolare accuratamente e rimuovere ancoretta. NOTA: Questa soluzione stock di EPS è un bene per circa 2 mesi a temperatura ambiente. La soluzionedeve essere riscaldato a 37 ° C e agitato in modo da solubilizzare completamente tensioattivi prima dell&#39;uso. EPS e d-limonene devono essere conservati in un contenitore di vetro in quanto saranno sciogliere alcune plastiche nel tempo. </li><li> Preparare una soluzione embrione dechorionation, medium di incubazione, tintura e soluzioni di droga. Miscelare 25 ml di candeggina con 25 ml di H 2 O e mettere in un piatto poco profondo. Preparare mezzo modificato di base di incubazione (MBIM) e MBIM-T secondo la prima ricetta 1,12. Preparare Shields e Sang M3 terreno di coltura cellulare e PBS secondo il protocollo del produttore (vedi Materials List). Preparare soluzione stock di permeabilizzazione colorante a 10 mM di concentramento in DMSO. </li><li> Montare dispositivi embrione di gestione e forniture: <ol><li> Preparare dechorionation e cestino trattamento EPS (vedi Figura 1A). Tagliare una sezione di tre centimetri di un usa e getta polipropilene da 50 ml centrifuga / provetta di coltura con una sega a denti fini. Rendere la superficie a filo di saldatura strofinando la sezione del tubo su carta vetrata aderitoad una superficie da banco. Saldare la sezione del tubo di maglia di nylon Nitex fondendo il bordo della sezione di tubo a fuoco e premendo a maglia su una lastra di vetro. Lasciate raffreddare e tagliare a rete supplementare. NOTA: I lati a strapiombo e inferiore consentono un rapido e completo risciacquo di candeggina residua e EPS alle rispettive fasi. Le fasi di saldatura devono essere effettuate sotto una cappa aspirante. </li><li> Preparare un cesto di sviluppo. Tagliare porzione superiore di una centrifuga da 50 ml / provetta di coltura a filo con il bordo del tappo. Rimuovere e modificare il tappo tagliando un&#39;apertura centrale e tacche lungo il bordo come mostrato nella Figura 1B. Avvitare il tappo sulla maglia e sui fili della sezione del tubo tagliato e tagliare maglia supplementare. NOTA: Il tappo contiene tacche nel bordo che consente al mezzo di diffusione di massa quando posizionato nel piatto serbatoio 60 mm (Figura 1B &#39;). </li><li> Preparare componenti di una camera di scorrimento. Tagliare un quadrato di membrana DO che è maggiore dil&#39;apertura camera di scorrimento. Applicare uno strato molto sottile di grasso per vuoto al labbro interno dell&#39;apertura. Fissare la membrana DO nell&#39;apertura tenuta contro il grasso con l&#39;anello di fermo. Tagliare l&#39;eccesso di membrana DO tagliando di nuovo vicino al l&#39;anello di fermo. NOTA:. Specifiche per la camera di scorrimento si possono trovare in Kiehart et al 13 Questa camera non è disponibile in commercio e richiede fabbricazione su misura da un negozio di macchina. </li></ol></li></ol> 2. Staging, Dechorionation, e trattamento EPS di embrioni <ol><li> Messa in scena embrioni per collezione temporizzata. Impostare un piatto d&#39;uva / lievito fresco alla gabbia cultura mosca al mattino. Consentire embrioni da posare per 1 ora a 25 ° C. Scartare questa piastra e sostituirla con una piastra uva / lievito fresco per una successiva posa embrione di 2 ore a 25 ° C. Raccogliere questa piastra e il luogo in 18 ° C incubatore per ulteriore messa in scena dello sviluppo. NOTA: 1 h di sviluppo a 25 ° C è pari a 2 ore di sviluppoa 18 ° C. L&#39;effetto di invecchiamento a 18 ° C rispetto a 25 ° C sul mantenimento EPS permeabilizzazione embrioni in fase avanzata può essere visto in Figura 2. </li><li> Dechorionation. Lavare delicatamente gli embrioni fuori del piatto uva nel paniere mesh con 25 ° C acqua di rubinetto e un pennello. Sciacquare lievito in eccesso dagli embrioni nel cestino sotto una leggera corrente di acqua del rubinetto. Immergere il cestello nel 50% di candeggina per 2 min. Lavare gli embrioni accuratamente sotto un getto di acqua del rubinetto. NOTA: spruzzare delicatamente soluzione di candeggina sulle embrioni intermittenza con una pipetta di plastica. Mentre 2 min è solitamente sufficiente per una completa dechorionation, questo tempo di incubazione deve essere controllato da un esame diretto e adeguato di conseguenza. Mantenere gli embrioni dechorionated nel paniere immerso in acqua di rubinetto e procedere immediatamente alla fase EPS. </li><li> Trattamento EPS <ol><li> Preparare sei piatti 60 millimetri con circa 10 ml di PBS in ciascuna. Preparare la diluizione EPS sciogliendo 75 microlitri EPS a 2.925 ml MBIM (01:40) in un bicchiere da 50 ml in vetro con vorticoso. Nota: Una forma di emulsione bianchi di questa miscela. </li><li> Tamponare l&#39;acqua in eccesso dal fondo del cestello in rete con un laboratorio pulire. Immergere basket in EPS diluiti in coppa e immediatamente agitare per disperdere gli embrioni nella soluzione EPS nel fondo del cestello. Continua vorticoso movimento per 30 sec. NOTA: EPS diluizioni e tempi di esposizione possono essere variate per controllare la permeabilità. Si raccomanda che ottimali EPS diluizioni e tempi di trattamento stabiliti empiricamente con i ceppi di mosche in uso. Aumentare il tempo di esposizione di 60-90 secondi è favorevole per la fase 12 ed embrioni anziani. </li><li> Rimuovere cestino, asciugare lontano eccesso EPS con un laboratorio pulire. Procedere con sei lavaggi sequenziali in 10 ml di PBS nei piatti 60 millimetri. Utilizzare una pipetta di plastica a schizzare delicatamente gli embrioni con PBS in ciascuna delle sei lavaggi. Procedere per tingere e fasi di trattamento della droga. Nota: EPS possono essere smaltiti nel lavandino. </li></ol></li></ol>3. Dye and Drug trattamento di permeabilizzate embrioni <ol><li> Dye Trattamento <ol><li> Aggiungere 5 ml di 10 mM CY5 carbossilico acido colorante * a 1 ml di MBIM-T (50 mM concentrazione finale) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e agitare per miscelare. NOTA: * La scelta di colorante dipende l&#39;analisi a valle. L&#39;acido carbossilico CY5 è efficace per le successive analisi che utilizzano la fissazione e immunoistochimica. Rodamina B è utile per l&#39;analisi di embrioni viventi. L&#39;emissione rossa di rodamina B, e l&#39;emissione verde dei suoi metaboliti 1, possono presentare alcune complicazioni con applicazioni a valle che utilizzano la fluorescenza. Farmaco o tossina possono essere aggiunti alla soluzione colorante di iniziare il trattamento, in questa fase, o limitare il trattamento farmaco / tossina di un impulso in questa fase. Si deve prestare attenzione per gestire e smaltire farmaci e tossine in base alle scheda di sicurezza e gli standard di sicurezza ambientale. </li><li> Trasferire embrioni dal cestello a rete per la soluzione colorante con un pennello. Chiudere la provetta e invertire ripetutamente per assicurare laembrioni fluttuare liberamente in sospensione nella soluzione colorante. Mettere tubo su una sedia a dondolo oscillante per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il tubo da nutator e lasciare che gli embrioni si depositano. Rimuovere la soluzione colorante con un bel pipetta e sostituirlo con 1 ml di MBIM-T da lavare. Capovolgere il tubo di ri-sospendere completamente embrioni. Lasciate embrioni stabilirsi e ripetere con più di tre lavaggi MBIM-T. Rimuovere tutti MBIM-T da risciacquo finale e procedere alla fase di incubazione. </li></ol></li><li> Incubazione per lo sviluppo dell&#39;embrione <ol><li> Trasferire embrioni ad una delle due camere: Il cestino sviluppo o della camera di scorrimento. NOTA: Il cestino di sviluppo è preferito per lunghi periodi di sviluppo, ed è necessaria se le successive fasi di fissazione e di immunoistochimica devono essere eseguiti. La camera di scorrimento è ottimale per una maggiore risoluzione time-lapse imaging ed è più efficace per brevi periodi di sviluppo (ad esempio, gli eventi precoci embrionali). Farmaco o tossina possono essere aggiunti al mezzo a varie concentrazioni e embrione dviluppo può essere monitorato in tempo reale con embrioni vivi o su un endpoint mediante fissaggio standard ed immunoistochimica protocolli. </li><li> Sviluppo in cestini <ol><li> Pulire un cesto di sviluppo spruzzando con il 70% di etanolo, sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata e asciugare con il laboratorio pulire. Preparare 6 ml di medium di incubazione con concentrazione desiderata di farmaco o tossina. Posizionare il cestello sviluppo in media 60 millimetri di presa piatto attenzione a non intrappolare bolle d&#39;aria sotto la base della maglia. NOTA: Due supporti sono comunemente utilizzati: solo MBIM, o MBIM/M3 in una miscela 50:50, quest&#39;ultimo è più efficace per periodi più lunghi di sviluppo. </li><li> Trasferire gli embrioni permeabilizzate ad ingranare superficie di base del paniere con un pennello. Spruzzare delicatamente gli embrioni con i media dal serbatoio circostante. Disperdere gli embrioni con il pennello in modo che siano in un monostrato sulla mesh. Nota: Procedere con immagini di microscopia e valutare permeabilizzazione e vitalità caratteristiche del preparation (vedi punto 4). </li></ol></li><li> Sviluppo alla Camera diapositive <ol><li> Invertire camera di scorrimento e applicare una piccola quantità di grasso per vuoto sul perimetro dell&#39;apertura. Porre 150 ml di terreno con la quantità desiderata di farmaco o tossina sulla superficie della membrana DO all&#39;interno dell&#39;apertura. NOTA: Due supporti sono comunemente utilizzati: solo MBIM, o MBIM/M3 in una miscela 50:50, quest&#39;ultimo è più efficace per periodi più lunghi di sviluppo. </li><li> Trasferire gli embrioni permeabilizzate al calo di media con un pennello. Disperdere gli embrioni che li depositano sulla membrana all&#39;interno della goccia. </li><li> Coprire delicatamente un coprioggetto circolare di 25 mm l&#39;apertura appiattendo così il mezzo. Premere delicatamente verso il basso lungo il perimetro del vetrino per formare un sigillo con il grasso. Nota: Procedere alla microscopia imaging per valutare la permeabilizzazione e vitalità caratteristiche della preparazione (vedi punto 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identizione di permeabilizzate embrioni vitali <ol><li> Identificare gli embrioni permeabilizzate. Osservare gli embrioni sotto epifluorescenza con un microscopio equipaggiato con una fotocamera digitale. Acquisire le immagini (in lunghezza d&#39;onda blu per determinare il profilo tuorlo autofluorescenza) di diversi campi utilizzando microscopio fisso e le impostazioni della fotocamera. </li><li> Determinare permeabilizzazione di embrioni basato sull&#39;intensità di fluorescenza relativa. Utilizzare uno stereomicroscopio con una grande distanza di lavoro per accogliere il carrello e consentire manipolazioni degli embrioni. Il microscopio deve essere dotato di una fase programmabile XYZ, illuminazione epifluorescenza e una fotocamera digitale. Immagine embrioni avendo cura di registrare l&#39;esposizione e parametri di posizione fase di ogni immagine embrione per consentire la rivalutazione degli stessi embrioni in un punto secondo momento (vedi risultato rappresentativo in figura 3). Nota: Modelli di colorante assorbimento varieranno a seconda del colorante usato, durata dell&#39;esposizione e dell&#39;età embrione. Una vasta gammadell&#39;assorbimento colorante attraverso una singola preparazione è tipica e riflette la variazione nel grado di permeabilizzazione. </li><li> Identificare gli embrioni vitali. Dopo posizione di embrioni permeabilizzate marcatura, proseguire con lo sviluppo dell&#39;embrione a temperatura ambiente oa 25 ° C. Ritorno cestino o camera diapositiva per il microscopio. Osservare in fluorescenza blu canale e acquisire l&#39;immagine di tuorlo autofluorescenza in embrioni permeabilizzate precedentemente identificati. Valutare la vitalità secondo la normale progressione di distribuzione tuorlo (vedi Rand et al. 1 e risultati rappresentativi in Figura 3). Nota: Altre caratteristiche morfologiche dell&#39;embrione osservato con microscopia brightfield possono essere usate per valutare la vitalità. Si raccomanda di stabilire il livello di permeabilità che è compatibile con la redditività essere determinata empiricamente con ciascun colorante e lo sforzo di volare utilizzato. </li><li> Valutare droga o tossina effetti embrioni vitali permeabilizzate. </li><li> EMBRIONI proceduressed con il protocollo di cui sopra sono pronti per un numero di convenzionali analisi successive esposizione ai farmaci o tossine. Molti dei vari tipi di analisi sono considerati nella discussione qui sotto e comprendono l&#39;osservazione diretta della morfogenesi in embrioni vivi, così come le analisi post-fissazione immunoistochimica. Entrambi questi approcci sono arricchiti con l&#39;uso di coloranti vitali (ad esempio, GFP) che rivelano pattern di espressione genica e la linea cellulare e profili morfologia. </li></ol>

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis.">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li><li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation.">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li><li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes.">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li><li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique.">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li><li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microscopic+methods+for+the+analysis+of+cellular+movements+in+Drosophila+embryos.">High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos.</a> Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).</li><li>Patel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology.">Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il metodo di cui sopra delinea un mezzo per ottenere embrioni di Drosophila vitali che sono accessibili ai piccoli trattamenti molecola attraverso una vasta gamma di sviluppo. Questo metodo presenta il romanzo e semplice constatazione che l&#39;invecchiamento embrioni a 18 ° C permette di permeabilizzazione di embrioni in fase avanzata con la stessa efficacia, come visto in precedenza solo negli embrioni in fase iniziale. Inoltre, l&#39;uso del colorante CY5 acido carbossilico lontano rosso come indicatore di permeabilità è dimostrato efficace in applicazioni di post-fix e non interferisce con marcatori fluorescenti rosse e verdi convenzionali che possono essere utilizzati per rivelare fenotipi sviluppo. Questi risultati avanzano significativamente l&#39;efficacia e l&#39;utilità del metodo EPS. Questo metodo è suscettibile di analisi sia di vita e di preparazioni di embrioni fissi. Utilizzando la microscopia in campo chiaro e la camera di diapositive set up, caratteristiche tipiche di segnare nel primo semestre dello sviluppo embrionale sono movimenti morfogenetici talicellularization del blastoderm, la formazione solco cefalico, l&#39;allungamento germband e retrazione germband 1. Con reporter GFP o RFP endpoint più specifici possono essere individuate, ad esempio, i modelli di segmentazione precoce e la formazione di strutture neurali in sviluppo successivo 1. GFP e RFP report consentono anche l&#39;osservazione di eventi di sviluppo nel vivere embrioni permeabilizzate sia nella camera di scorrimento e preparazioni cesto di sviluppo. Un metodo semplice per determinare la tossicità lordo di un farmaco o sostanza chimica applicata è di monitorare il pattern di proteine ​​tuorlo auto-fluorescenza nel canale blu per determinare un ritardo o cessazione di sviluppo 1. La metodologia EPS ha anche un grande potenziale per ampliare gli strumenti investigativi per insetti non-modello, in particolare, la zanzara, che condivide una simile architettura del guscio d&#39;uovo. Applicazione di piccole molecole di embrioni di altre specie di insetti avrebbe aperto un viale di investigatidove approcci genetici standard a studi funzionali attualmente mancano. Gli embrioni sviluppati in cesti possono essere trattati per la fissazione di formaldeide, quindi aprendo analisi per la vasta gamma di reagenti di immunoistochimica disponibili per gli studi di Drosophila. Tuttavia, questo passaggio richiede una determinazione post-fix di permeabilizzazione essere fattibile per correlare fenotipi con embrioni che erano stati resi accessibili al farmaco. L&#39;applicazione di CY5 colorante acido carbossilico è dimostrato altamente efficace per questo approccio. Acido carbossilico CY5 è efficacemente ripreso in embrioni permeabilizzate (Figura 3A). Durante lo sviluppo CY5 è concentrato nel tuorlo, che poi è sequestrato nel lume intestinale formando nella fase 14, e successivamente (Figura 3B). Dopo la fissazione, CY5 fluorescenza è marcatamente ridotta, ma attendibilmente rilevabile nell&#39;intestino e serve come un marcatore di quegli embrioni che sono stati efficacemente permeabilizzate fin dall&#39;inizio (vedi ris rappresentativiult Figura 4). Va notato che il rilevamento CY5 in questa fase richiede esposizioni più lunghe videocamera (ad esempio, 1-4 secondi) per il rilevamento. Pertanto, il punteggio di fenotipi con i modelli di immunoistochimica può procedere utilizzando il segnale CY5 per confermare embrioni simile permeabilizzate insieme con marcatori tessuto specifici (ad esempio, gli anticorpi specifici neurali visto in Figura 4). La sfida più grande in questo metodo è la sensibilità della vitalità dell&#39;embrione al processo di permeabilizzazione, qualcosa che ha a lungo tormentato tentativi prima di sviluppare questo metodo 9,10,16. Viabilità a seguito di permeabilizzazione è età-dipendente crudamente, e aumenta notevolmente il vecchio l&#39;embrione è su di permeabilizzazione 9. Tuttavia, come si è illustrato in precedenza, permeabilità diventa sempre più difficile con età 1. Un recente rapporto ora dimostra la capacità di permeabilize embrioni fase avanzata (fase 14) da ri-invocando l&#39;epatitetane come solvente in combinazione con d-limonene 17. L&#39;ampia utilità di questo secondo metodo non è chiaro come solo un effetto della droga è stato caratterizzato (nocodazole) e l&#39;applicazione di precedenti embrioni stadio non è stato descritto 17. Inoltre, l&#39;applicazione del 18 ° C passo di sviluppo di cui sopra rese fase tardiva permeabilità e ulteriore evita l&#39;uso di solventi organici tossici. L&#39;investigatore che è nuovo per il protocollo EPS sperimenterà variabilità permeabilizzazione e vitalità risultati su tentativi iniziali. La procedura descritta qui danno il ricercatore gli strumenti per variare sistematicamente le condizioni di trattamenti di permeabilizzazione e le successive fasi di incubazione per ottimizzare le condizioni di specifici ceppi di Drosophila che stanno lavorando nel proprio ambiente di laboratorio. Un&#39;ulteriore sfida con il metodo è la variabilità assorbimento chimico visto dall&#39;embrione embrione. Questa variabilità si riflette nella eterogeneità deiCY5 colorante assorbimento visto in embrioni immediatamente dopo il trattamento colorante (Figura 3A). Al contrario, rodamina B colorante è più rapidamente e uniformemente dispersi tutti i tessuti embrionali di CY5 colorante (Figura 2B &quot;). Così, una certa variabilità embrione-to-embrione può essere ospitava nelle proprietà di distribuzione della sostanza chimica, farmaco o tossina di interesse ed è inerente al metodo. Dove quantificazione di dose è critico, si raccomanda che l&#39;assorbimento del farmaco o tossina di interesse è caratterizzato attraverso un metodo analitico alternativo. Tuttavia, la facilità di protocollo di cui sopra, e la capacità di schermare centinaia di embrioni, permette al ricercatore di valutare le risposte di dose e segnare fenotipi caratteristici con poco investimento di risorse, rendendo per un potente primo approccio a farmaci o tossine caratterizzano in questo altamente sviluppata modello di sistema.

L&#39;embrione Drosophila continua ad essere un modello di primo ministro per studio dei meccanismi fondamentali dello sviluppo 2. Questo potente modello è supportato da una vasta gamma di strumenti genetici molecolari che permettono manipolazioni essenzialmente qualsiasi gene in qualsiasi punto nel tempo e all&#39;interno di qualsiasi organo in via di sviluppo. Le dimensioni ridotte, rapido sviluppo, e ampia caratterizzazione della morfogenesi di Drosophila ne fanno un modello di scelta per schermi genetici, molti dei quali hanno scoperto percorsi di sviluppo fondamentali 3,4. Numerosi fenotipi in Drosophila sono stati caratterizzati e sono facilmente interpretabili, spesso fornendo un mezzo per identificare meccanismi genetici molecolari sottostanti responsabili di un tratto anormale. Storicamente, una lacuna del modello embrione fly è stata la difficoltà di introdurre piccole molecole ai tessuti embrionali. Questo ostacolo ha posto limitazioni: 1) ciing conosciuti piccole molecole bioattive come sonde per interrogare meccanismi di sviluppo e 2) con questo modello istituito per valutare l&#39;attività teratogena o farmacologica di non caratterizzate piccole molecole. Di conseguenza, il potenziale di screening della mosca embrione è stato sufficientemente sfruttato nella caratterizzazione di piccola attività molecola. Consegna di piccole molecole per la mosca embrione può essere realizzato con due metodi: 1) permeabilizzazione del guscio e 2) microiniezione. Questo articolo presenta anticipi al metodo di permeabilizzazione che sono facili da eseguire nel contesto di un laboratorio tradizionale Drosophila. Va notato che i recenti progressi nei metodi microiniezione con tecnologia microfluidica contribuisce anche ai metodi di introdurre composti al 5,6 embrione. Introducendo molecole per l&#39;embrione è impedito da uno strato ceroso del guscio 7. Il guscio Drosophila è costituito da cinque strati. Dal&#39;esterno che sono: la membrana vitellina, lo strato ceroso, lo strato interno corionica, il endochorion e il exochorion 8. I tre strati corionica esterni possono essere rimossi breve emersione dell&#39;embrione in candeggina diluita, un passo indicato come dechorionation. Lo strato ceroso esposto può essere compromesso dall&#39;esposizione ai solventi organici, come eptano e ottano 7,9, rendendo l&#39;embrione dechorionated permeabile, mentre rimane racchiusi nella membrana vitellina sottostante. Tuttavia, l&#39;uso di tali solventi introduce complicazioni dovute alla loro tossicità e la difficoltà di regolare la loro forte azione permeabile, entrambi i quali hanno effetti negativi Stark vitalità dell&#39;embrione 9,10. Un metodo di permeabilizzazione utilizzando una composizione definita embrione permeabilizzazione solvente (EPS) è stato descritto in precedenza 1. Questo solvente costituito da d-limonene e tensioattivi di origine vegetale che consentono il solvente sia miscibldi e con tamponi acquosi. La bassa tossicità di d-limonene e la capacità di diluire il solvente a concentrazioni desiderate ha dato un metodo efficace per generare embrioni permeabili con alta vitalità 1. Tuttavia, due fattori endogeni hanno continuato a portare limitazioni all&#39;applicazione. In primo luogo, gli embrioni dimostrano l&#39;eterogeneità della permeabilità dopo il trattamento EPS, anche se si ha cura di mantenere una stretta messa in scena dello sviluppo. In secondo luogo, gli embrioni più vecchio di circa otto ore hanno dimostrato difficile da permeabilize, coerente con un indurimento del guscio che si verifica dopo la deposizione delle uova 11. Descritto qui ci sono progressi nel metodo EPS che: 1) contribuire a individuare e analizzare gli embrioni quasi identico permeabilizzate, anche dopo il fissaggio e di immunoistochimica passi sono stati eseguiti e 2) consentire permeabilizzazione degli embrioni in punti ritardo dello sviluppo tempo (&gt; 8 ore, palcoscenico 12 anni e più). In particolare, l&#39;applicazione di un colorante rosso lontano,Acido carbossilico CY5, è descritto che funge da indicatore permeabilità, che persiste nell&#39;embrione durante lo sviluppo e dopo fissazione con formaldeide. Inoltre, è dimostrato che l&#39;allevamento embrioni a 18 ° C mantiene il guscio in uno stato sensibile EPS, consentendo permeabilizzazione di embrioni fase tardiva (fasi 12-16). Questi progressi superare i limiti precedentemente menzionati alla metodologia EPS. Questa applicazione sarà quindi fornire agli investigatori un mezzo per introdurre piccole molecole di interesse per l&#39;embrione in diversi momenti dello sviluppo, pur mantenendo la redditività.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

L&#39;embrione di Drosophila è stato a lungo un potente modello di laboratorio per chiarire i meccanismi molecolari e genetici che controllano lo sviluppo. La facilità di manipolazioni genetiche con questo modello ha soppiantato approcci farmacologici che sono comuni in altri modelli animali e saggi cellulari. Qui descriviamo i recenti progressi in un protocollo che consente l&#39;applicazione di piccole molecole per la mosca della frutta in via di sviluppo dell&#39;embrione. Il metodo dettagli passi per superare l&#39;impermeabilità del guscio, pur mantenendo la vitalità dell&#39;embrione. Guscio d&#39;uovo permeabilizzazione attraverso una vasta gamma di stadi di sviluppo si ottiene con l&#39;applicazione di una precedentemente descritto d-limonene embrione permeabilizzazione solvente (EPS 1) e gli embrioni di invecchiamento a temperatura ridotta (18 ° C) prima di trattamenti. Inoltre, l&#39;uso di un colorante rosso lontano (CY5) come indicatore di permeabilizzazione è descritto, che è compatibile con le diverse applicazioni che coinvolgono influenza rosso e verde di seriecoloranti orescent in preparazioni dal vivo e fissi. Questo protocollo è applicabile a studi utilizzando composti bioattivi per sondare meccanismi di sviluppo e per gli studi volti a valutare l&#39;attività teratogena o farmacologica di uncharacterized piccole molecole.

Dispositivi di manipolazione degli embrioni sono raffigurati nella figura 1 per aiutare a visualizzare i dispositivi &quot;fatti in casa&quot; per la manipolazione nei protocolli di cui sopra. Risultati visto in Figura 2 illustrano l&#39;effetto robusto di allevamento embrioni a 18 ° C sulla loro capacità di essere permeabilizzate da EPS in fase avanzata di sviluppo. Questa condizione è applicata nella fase protocollo 2.1. Efficacia dell&#39;acido carbossilico colorante CY5 per rivelare i vari livelli di permeabilità tipicamente osservati in EPS embrioni trattati è visto in Figura 3. La dinamica dello sviluppo della distribuzione colorante nel tuorlo è anche visto nella figura 3, rivelando un criterio usato per valutare la vitalità , come descritto nel protocollo fase 4.2. L&#39;utilità del colorante CY5 nel determinare embrione permeabilizzazione successivo al trattamento tossina, fissazione con formaldeide e immunocolorazione è illustrato dal risultato in Figura 4. Dispositivi di Figura 1. Manipolazione degli embrioni per il metodo EPS. Il paniere a fondo piatto è utilizzato in dechorination e EPS fasi di esposizione (A, A &#39;). Il cestino di sviluppo viene utilizzato per lunghi esposizioni sviluppo di embrioni permeabilizzate (B, B &#39;). La camera di scorrimento viene utilizzato per le esposizioni di sviluppo più brevi e maggiore risoluzione delle immagini di embrioni vivi (C, C &#39;. Vedere il testo per una descrizione più dettagliata). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig2highres.jpg" /> Figura 2. Effetto di invecchiamento a 18 ° C su EPS efficacia in embrioni in fase avanzata. Embrioni sono stati prelevati per due ore, seguita da invecchiamento a 18 ° C per 20 ore (Pannelli AA &quot;, <sTrong&gt; BB &quot;) oppure a 25 ° C per 10 h (Pannello CC&quot;). Gli embrioni a 18 ° C sono stati poi dechorionated e divisi in due campioni. Il primo campione è stato trattato direttamente con 1 mM rodamina B colorante in MBIM-T per 5 minuti, lavato e visualizzati sotto campo chiaro e fluorescenza blu e rosso canali (Pannello AA &quot;). Il secondo campione è stato trattato con EPS (1:10 in MBIM per 1 min), lavato e poi trattata con 1 mM rodamina B per 5 min e lavato prima della visualizzazione (Pannello BB &quot;). Embrioni sollevate a 25 ° C sono stati dechorionated e trattati direttamente con EPS (1:10 in MBIM per 1 min), lavate e poi trattate con 1 mM rodamina B per 5 min prima della visualizzazione (Pannello CC &quot;). Gli embrioni sono stati determinati per essere nella fase 14 dalle pieghe nell&#39;intestino rivelato da tuorlo autofluorescenza nel canale blu (Pannello A &#39;, B&#39;, C &#39;). Embrioni sollevate a 18 ° C sono impermeabili prima di EPS treatment visto da assenza di rodamina B assorbimento (Pannello A &quot;). Trattamento EPS di 18 ° C embrioni produce un elevato grado di permeabilità visto da rodamina B assorbimento (Pannello B &quot;). Embrioni sollevate a 25 ° C rimangono impermeabile anche con il trattamento EPS come visto per esclusione di rodamina B (pannello C &quot;). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig3highres.jpg" /> Figura 3. Costituzione di CY5 in embrioni permeabili e vitali. Embrioni sono stati prelevati a 25 ° C per 2 ore e invecchiato per 14 ore a 18 ° C (equivalente a 7-9 embrioni hr a 25 ° C, fase 12). Dopo dechorination, EPS trattamento è stato eseguito (01:40 in MBIM per 1 min) seguita da incubazione in CY5 colorante (50 pm di MBIM-T per 15 min). Gli embrioni sono stati lavati tre volte in MBIM-T e trasferiti al carrello sviluppo con MBIM nel serbatoio. Lo sviluppo è stato permesso di proceed per 8 ore a temperatura ambiente. La diffusione delle CY5 (rosso) è ripreso nel canale rosso lontano immediatamente dopo il trattamento di tintura e lavaggio (Pannello A) e dopo 8 ore di sviluppo (Panel B). La distribuzione del tuorlo è visto da autofluorescenza nel canale blu. Dye assorbimento, e quindi la permeabilità, si vede variare da embrione embrione. CY5 colorante (rosso) è visto di localizzare al tuorlo (blu), che diventa concentrato al lume intestinale nella fase 16 (viola, pannello B). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig4highres.jpg" /> Figura 4. Determinazione di permeabilizzazione e metilmercurio effetti in embrioni fissi e immunostained. Gli embrioni sono stati raccolti a 25 ° C per 2 ore e invecchiato per 14 ore a 18 ° C (equivalente a 7-9 embrioni hr a 25 ° C, fase 12). Dopo dechorination, trattamento EPS è stato fatto (01:40 in MBIM per 1 min) seguita da incubazione inCY5 dye (50 micron in MBIM-T per 15 min) insieme a metilmercurio (50 micron MeHg, pannello B) o DMSO controllo solvente (concentrazione finale 0,1%, Panel A). Gli embrioni sono stati lavati con MBIM-T e collocati in un cesto di sviluppo con MBIM: M3 fluido nel serbatoio e affinato per 8 ore aggiuntive a temperatura ambiente. Gli embrioni sono stati poi fissati in due fasi 4% paraformaldeide-eptano preparato da un protocollo standard 14. La colorazione è stata eseguita con anti-Fasciclin II (verde in A, B e nero in A &#39;, B&#39;) per etichettare i motoneuroni e anticorpi anti-ELAV (rossi in A, B) per etichettare tutti i corpi cellulari dei neuroni. CY5 colorante viene rivelata da fluorescenza diretta, che richiede l&#39;esposizione prolungata a causa di intensità di fluorescenza diminuita a causa di fissazione (CY5 è pseudo-colore blu in tutti i pannelli). Gli effetti di metilmercurio sono visti nel patterning irregolare e ClusteAnello dei corpi cellulari dei neuroni cordotonali laterali (ELAV-positivi, etichettati in rosso e denotati con le frecce bianche in B contro A). Inoltre, una ramificazione caratteristica del segmentale (SN) (frecce verdi solidi A &#39;) è visto essere altamente variabile con orientazione MeHg (frecce verdi solidi in B &quot;) conformi agli effetti precedentemente segnalati di MeHg sull&#39;embrione 15. Proiezione del intersegmentale e segmentaria nervi alle loro radici sono considerati essere spostato posteriormente con l&#39;esposizione MeHg (aperto freccia verde in B &#39;). Nota: Il metilmercurio è una potente neurotossina. Si deve prestare attenzione a indossare guanti e occhiali protettivi durante la manipolazione. Lo smaltimento deve essere fatto attraverso un impianto di sicurezza ambientale istituzionale e di servizio.

Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduzione di piccole molecole, allo sviluppo di Drosophila embrione offre un grande potenziale per la caratterizzazione dell&#39;attività biologica di nuovi composti, farmaci e tossine, nonché per sondare percorsi di sviluppo fondamentali. I metodi qui descritti delineano misure che superano le barriere naturali di questo approccio, ampliando l&#39;utilità del modello di embrione di Drosophila.

Un metodo di Permeabilization di<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli embrioni per saggi di piccole molecole di attività

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K Views.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  Introduzione di piccole molecole, allo sviluppo di Drosophila embrione offre un grande potenziale per la caratterizzazione dell'attività biologica di nuovi composti, farmaci e tossine, nonché per sondare percorsi di sviluppo fondamentali. I metodi qui descritti delineano misure che superano le barriere naturali di questo approccio, ampliando l'utilità del modello di embrione di Drosophila. 

Video: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Ricerca

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Saggi Neurocircuit per Sequestri in mutanti di Epilessia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imaging verticale di Drosophila Embrioni

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Due tipi di saggi per chemiotassi Frog rilevamento sperma

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Un metodo di Permeabilization di

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video