This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. הכנת תרבויות טוס, פתרונות, ומכשירי טיפול בעובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות כלוב של דרוזופילה. הנח 500 זבובים + הזדווגות של הזן הרצוי במצוידים בצלחת ענבים אגר 10 סנטימטר ומקום של שמרים להדביק כלוב אוכלוסייה. לשמור על התרבות בחממה מבוקרת C לחות 25 °. הערה: &#160; תרבויות כלוב דורשות יום או ימים של אוויר, כדי לרכוש דפוסי עובר הנחת עקביים. צלחות ענבים עם שמרים להדביק משתנות פעם בבוקר ופעם בערב באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן EPS. פתרונות חמים של חומרים פעילי שטח (DEA cocamide ואלכוהול Ethoxylated) ב 37 ° C. פיפטה 18 מיליליטר של d-limonene לבקבוקון נצנץ זכוכית מצויד בבר ומערבב קטן. פיפטה 1 מיליליטר כל אחד משני החומרים פעילי השטח (5% הריכוז סופי של כל אחד) לd-limonene. מערבבים היטב ולהסיר בר ומערבב. הערה: פתרון מניות זה של רווח למניה הוא טוב לכ 2 חודשים בטמפרטורת חדר. הפתרוןיש לחמם על 37 מעלות צלזיוס והסתחרר לsolubilize מלוא שטח לפני השימוש. EPS ו-D-limonene צריך להיות מאוחסן במכל זכוכית כפי שהם יהיו לפזר כמה פלסטיקים לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון dechorionation העובר, מדיומים דגירה, צבע ופתרונות בסמים. מערבבים 25 מיליליטר של אקונומיקה עם 25 מיליליטר H 2 O ומקום בצלחת רדודה. להכין מדיום שונה בסיסי דגירה (MBIM) וMBIM-T על פי מתכון שלפני 1,12. הכן ילדס וסאנג בינוני M3 תא התרבות וPBS על פי הפרוטוקול של היצרן (ראה חומרי רשימה). הכן פתרון מניות של צבע permeabilization ב10 מ&quot;מ ריכוז בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מכשירי עובר טיפול ובאספקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן dechorionation וסל טיפולי EPS (ראה איור 1 א). חותכים את סעיף 3 סנטימטר של צנטריפוגות תרבות צינור חד פעמי 50 מיליליטר פוליפרופילן / עם מסור עדין שיניים. הפוך את סומק ריתוך משטח על ידי שפשוף קטע הצינור על נייר זכוכית דבקלמשטח המעבדתיים. ולד קטע הצינור לרשת ניילון Nitex ידי התכת שולי סעיף הצינור על אש ולחיצה על לרשת על צלחת זכוכית. בואו מגניב ולקצץ את רשת נוספת. הערה: הצדדים ותחתונים העצום לאפשר לשטיפה מהירה ומלאה משל אקונומיקה והרווח למניה שיורית בצעדים המתאימים. צריכה להתבצע פעולות הריתוך מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סל פיתוח. חותכים את החלק העליון של צנטריפוגות / תרבות צינור 50 מיליליטר מיושר עם שולי הכובע. להסיר ולשנות את הכובע על ידי חיתוך פתיחה מרכזית וחריצים לאורך השפה כפי שמוצג באיור 1. הברג את הכובע על הרשת ועל האשכולות של סעיף הצינור מנותק ולקצץ רשת נוספת. הערה: הכובע מכיל חריצים בשפה המאפשרות דיפוזיה למדיום בתפזורת כשהוא מוצב בצלחת המאגר 60 מ&quot;מ (איור 1 ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מרכיבי תא שקופיות. לחתוך רבוע של קרום לעשות את זה הוא גדול יותר מאשרקאמרי פתיחת השקופית. למרוח שכבה דקה מאוד של שומן ואקום לשפה הפנימית של הפתח. להדביק את קרום DO לתוך הפתח איטומו נגד הגריז עם הטבעת המייצבת. לקצץ קרום DO עודף על ידי קיצוץ אותו קרוב לטבעת המייצבת. הערה:. ניתן למצוא מפרט לקאמרי השקופית בKiehart et 13 אל חדר זה ​​אינו זמין באופן מסחרי ודורש ייצור מותאם אישית על ידי חנות מכונה. </li></ol></li></ol> 2. Staging, dechorionation, והרוויחו למניה טיפול בעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Staging עוברים על ידי אוסף מתוזמן. הגדר ענבים / שמרים טרי צלחת לכלוב התרבות לטוס בבוקר. אפשר לעוברים להיות מונחים לשעה 1 ב25 ° C. בטל צלחת זו ולהחליף עם ענבים / שמרים טרי לצלחת הנחת עובר הבאה של שעה 2 ב 25 ° C. לאסוף צלחת זו ומקום ב18 חממת מעלות צלזיוס למשך בימוי התפתחותיים נוסף. הערה: 1 שעות של פיתוח ב ° C25 שווה לשעה 2 בפיתוחב18 ° C. ההשפעה של הזדקנות על 18 מעלות צלזיוס לעומת 25 ° C ב שמירת permeabilization EPS בעוברים בשלב מאוחר ניתן לראות באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionation. לשטוף בעדינות עוברים מצלחת ענבים לתוך סל רשת באמצעות 25 מים מעלות צלזיוס ברז ומכחול. יש לשטוף את השמרים עודפים מהעוברים בסל מתחת לזרם עדין של מים ברז. לטבול את הסל באקונומיקת 50% למשך 2 דקות. שטוף ביסודיות עובר תחת זרם של מים ברז. הערה: בעדינות להשפריץ פתרון אקונומיקה על העוברים לסירוגין באמצעות פיפטה פלסטיק. בעוד 2 דקות בדרך כלל מספיק עבור dechorionation מלא, זמן דגירה זה צריך להיבדק על ידי בדיקה ישירה ובהתאם. לשמור עובר Dechorionated בסל השקוע במים ברז ולפנות מייד לצעד EPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EPS טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שש מנות 60 מ&quot;מ עם כ 10 מיליליטר של PBS בכל אחד. הכן את הדילול הרווח למניה על ידי המסת 75 EPS μl ב2.925 מיליליטר MBIM (1:40) בכוס זכוכית מיליליטר 50 עם מתערבל. הערה: צורות תחליב לבנים מתערובת זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מים עודפים מתחתית סל הרשת עם מעבדה לנגב. לטבול את הסל ברווח למניה מדוללת בכוס ומייד מערבולת כדי לפזר עוברים בפתרון EPS בחלק התחתון של הסל. המשך מתערבל בקשה ל30 שניות. הערה: יכולים להיות מגוונים דילולים EPS וזמני חשיפה לשלוט חדירות. מומלץ כי דילולים EPS האופטימלי וזמני טיפול שיוקמו באופן אמפירי עם הזנים של זבובים בשימוש. הגדלת זמן חשיפה ל60-90 שניות היא חיובית לבמה 12 ועוברים מבוגרים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סל, למחוק משם EPS העודף עם מעבדה לנגב. להמשיך עם שש שטיפות רציפים ב10 מיליליטר של PBS במנות 60 מ&quot;מ. השתמש פיפטה פלסטיק להשפריץ בעדינות עוברים עם PBS בכל אחד מששת שוטף. המשך לצבוע וצעדים לטיפול בסמים. הערה: יכולה להיות מסולקת למניה של את הכיור. </li></ol></li></ol>3. דיי והתרופות טיפול בעוברי permeabilized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיי טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 10 מ&quot;מ Cy5 * צבע חומצה קרבוקסילית ל1 מיליליטר של MBIM-T (50 מיקרומטר ריכוז סופי) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge ומערבולת לערבב. הערה: * בחירה של צבע תלוי בניתוח במורד הזרם. חומצה קרבוקסילית Cy5 היא יעילה לניתוחים שלאחר מכן באמצעות קיבוע וimmunostaining. Rhodamine B הוא שימושי עבור ניתוח של עוברי חיים. הפליטה האדומה של Rhodamine B, והפליטה הירוקה של מטבוליטים שלה 1, יכולים להציג כמה סיבוכים עם יישומים במורד הזרם באמצעות הקרינה. תרופה או רעלן ניתן להוסיף לפתרון הצבע להתחיל בטיפול בשלב זה, או להגביל את הטיפול תרופתי / רעל לדופק בשלב זה. יש להקפיד לטפל ולהיפטר מתרופות ורעלים על פי MSDS ותקני בטיחות סביבתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים מסל הרשת לפתרון לצבוע באמצעות מכחול. שווי הצינור ולהפוך שוב ושוב על מנת להבטיח אתעוברים לצוף בחופשיות בתרחיף בתמיסת הצבע. הנח צינור על כיסא נדנדה nutating 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מnutator ולתת עובר להתיישב. הסר את פתרון צבע עם טפטפת קנס ולהחליף עם 1 מיליליטר של MBIM-T כדי לשטוף. הפוך לצינור מחדש להשעות עוברים לחלוטין. בואו עוברים להתיישב וחזור עם עוד שלוש שטיפות MBIM-T. הסר את כל MBIM-T משטיפה סופית ולהמשיך לשלב דגירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של התפתחות עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עובר לאחד משני תאים: סל הפיתוח או קאמרי שקופיות. הערה: סל הפיתוח עדיף לתקופות ארוכות יותר התפתחותית, והיא נדרשת לצעדי קיבעון וimmunostaining הבאים הם להיות מוצא להורג. קאמרי השקופיות הוא אופטימלי עבור הזמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, והוא יעיל ביותר לתקופות קצרות התפתחותית (למשל, האירועים העובריים המוקדמים). תרופה או רעלן ניתן להוסיף לבינונית בריכוזים שונים וד העוברevelopment ניתן לנטר בזמן אמת עם עוברים בשידור חי או בנקודתי קצה באמצעות קיבוע סטנדרטי וimmunostaining פרוטוקולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח בסלסלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את סל פיתוח על ידי התזה עם 70% אתנול, לשטוף היטב במים דה מיונן וכתם יבש עם מעבדה לנגב. הכן 6 מיליליטר של מדיום דגירה עם ריכוז רצוי של תרופה או רעלן. הנח את סל הפיתוח במדיום בטיפול נטילת מנה 60 מ&quot;מ לא לבועות אוויר מלכודת מתחת לבסיס הרשת. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי permeabilized לרשת פני השטח בבסיס של סל עם מכחול. בעדינות להשפריץ את העוברים עם תקשורת מהמאגר שמסביב. לפזר את העוברים עם המכחול, כך שהם בשכבה על הרשת. הערה: המשך להדמיה מיקרוסקופית ולהעריך את מאפייני permeabilization ויכולת קיום של יחסי הציבורeparation (ראה שלב 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח בלשכת השקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא שקופיות ולהחיל חרוז קטן של שומן ואקום על המערכת של הפתיחה. הנח 150 μl של מדיום עם כמות רצויה של תרופה או רעלן על פני השטח של קרום לעשות בתוך הפתח. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי permeabilized לירידה של תקשורת עם מכחול. לפזר את העוברים שהופך אותם להתיישב על הקרום בירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחיל coverslip מעגלי 25 מ&quot;מ מעל הפתח ובכך משטח את המדיום. לחץ כלפי מטה בעדינות לאורך ההיקף של coverslip כדי ליצור חותם עם הגריז. הערה: המשך כדי מיקרוסקופיה הדמיה כדי להעריך את מאפייני permeabilization וכדאיות של ההכנה (ראה שלב 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identification של עוברי קיימא permeabilized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברי permeabilized. שים לב עוברים תחת epifluorescence עם מיקרוסקופ מצויד במצלמה דיגיטלית. לרכוש תמונות (באורך הגל הכחול כדי לקבוע את autofluorescence חלמון הפרופיל) של מספר שדות באמצעות מיקרוסקופ קבוע והגדרות מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע permeabilization של עוברים המבוססים על עוצמת הקרינה היחסית. השתמש בסטראו עם מרחק עבודה גדול כדי להכיל את הסל ולאפשר למניפולציות של העוברים. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בשלב תכנות XYZ, תאורת epifluorescence ומצלמה דיגיטלית. תמונת העוברים דואגים להקליט חשיפה ופרמטרי עמדת במה של כל תמונת עובר כדי לאפשר הערכה מחדש של אותו עובר בנקודת זמן מאוחרת יותר (ראו תוצאת נציג באיור 3). הערה: דפוסי ספיגת צבע ישתנו בהתאם לצבען המשמש, משך חשיפה וגיל עובר. מגוון רחבשל ספיגת צבע על פני הכנה אחת אופיינית ומשקפת את השונות במידת permeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברים ובת קיימא. לאחר סימון מיקום של עוברי permeabilized, להמשיך בפיתוח עובר בטמפרטורת חדר או 25 ° C. חזור סל או תא שקופיות למיקרוסקופ. שים לב תחת הקרינה ערוץ כחולה ולרכוש תמונה של autofluorescence חלמון בזוהו בעבר עוברי permeabilized. להעריך את הכדאיות לפי התקדמות רגילה של הפצת חלמון (ראה ראנד et al. 1 ותוצאת נציג באיור 3). הערה: תכונות מורפולוגיות אחרות של העובר נצפה עם מיקרוסקופ brightfield ניתן להשתמש כדי להעריך את הכדאיות. מומלץ כי קביעת הרמה של חדירות התואמת את הכדאיות להיקבע באופן אמפירי עם כל צבע ומתח של זבוב בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את השפעות תרופה או רעלן בעוברי קיימא permeabilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי processed עם הפרוטוקול הנ&quot;ל עומדים על מספר הניתוחים הקונבנציונלי לאחר סמים או חשיפת רעלן. כמה סוגים השונים של ניתוחים נחשבים בדיון שלהלן וכוללים תצפית ישירה של המורפוגנזה בעוברת לחיות כמו גם immunostaining הודעה הקיבעון-מנתח. שתי גישות אלה משופרים על ידי שימוש בצבעים חיוניים (למשל, ה-GFP) החושפים דפוסי ביטוי גנים ושושלת תא ופרופילי מורפולוגיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis.">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li><li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation.">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li><li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes.">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li><li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique.">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li><li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microscopic+methods+for+the+analysis+of+cellular+movements+in+Drosophila+embryos.">High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos.</a> Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).</li><li>Patel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology.">Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה הנ&quot;ל מתארת ​​אמצעי להשגת עוברי דרוזופילה קיימא, כי הם נגישים לטיפולי מולקולה קטנים על פני מגוון רחב התפתחותית. שיטה זו מציגה את הרומן וממצא פשוט שהזדקנות עוברים על 18 מעלות צלזיוס מאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר באותה היעילות כפי שניתן לראות בעבר רק בעוברים בשלב מוקדם. בנוסף, שימוש בחומצה מרחיק האדומה צבע Cy5 קרבוקסיליות כאינדיקטור חדירות הוכחה כיעילה ביישומים שלאחר תיקון, ואינו מתערב בסמני ניאון אדומים וירוקים קונבנציונליים שניתן להשתמש בם כדי לחשוף פנוטיפים התפתחותית. ממצאים אלה לקדם באופן משמעותי את היעילות ותועלת של שיטת EPS. שיטה זו ניתנת לניתוח של שניהם חיים והכנות עובר קבועים. באמצעות מיקרוסקופ brightfield וקאמרי השקופיות להגדיר, תכונות אופייניות להבקיע במחצית הראשונה של התפתחות עובר הן תנועות morphogenetic כזהcellularization של blastoderm, היווצרות תלם cephalic, התארכות germband והכחשת germband 1. עם כתבי GFP או RFP ניתן להבחין בנקודתי קצה ספציפיות יותר, למשל דפוסי פילוח מוקדם והיווצרות של מבנים עצביים בפיתוח 1 מאוחר יותר. דיווחי ה-GFP ו RFP גם לאפשר תצפית של אירועים התפתחותיים בחיים עובר permeabilized בשני קאמרי שקופיות והכנות סל התפתחותית. שיטה פשוטה כדי לקבוע רעילות ברוטו של תרופה או כימי מיושמת היא לפקח את הדפוס אוטומטי הקרינה חלבון חלמון בערוץ הכחול כדי לקבוע עיכוב או הפסקה של פיתוח 1. EPS המתודולוגיה יש גם פוטנציאל גדול להרחבת כלי החקירה לחרקים שאינם מודל, בפרט נגד היתושים, אשר מניות ארכיטקטורה דומה של קליפת הביצה. היישום של מולקולות קטנות לעוברים של מיני חרקים אחרים היה לפתוח את שדרה של investigatiעל איפה גישות גנטיות סטנדרטיות ללימודים תפקודיים כרגע חסרות. עוברים שפותחו בסלים יכולים להיות מעובד לקיבעון פורמלדהיד, ולכן נפתחו ניתוחים למגוון הרחב של חומרים כימיים immunostaining זמינים ללימודי דרוזופילה. עם זאת, צעד זה מחייב קביעת הודעה תיקון של permeabilization להיות ריאלי, כדי לקשר בין פנוטיפים עם עוברים שנעשו נגיש לתרופה. יישום של צבע חומצה קרבוקסילית Cy5 הוכח כיעיל ביותר לגישה זו. החומצה קרבוקסילית Cy5 הוא נלקחה ביעילות בעוברי permeabilized (איור 3 א). במהלך פיתוח Cy5 מרוכז בחלמון, אשר מוחרם סופו של דבר בלומן של מעי ויוצר בשלב 14 ומאוחר יותר (איור 3 ב). לאחר קיבוע, הקרינה Cy5 היא במידה ניכרת ירד, ובכל זאת באופן אמין לגילוי במעי ומשמשת כסמן של אלה עוברים שpermeabilized ביעילות בתחילת הדרך (ראה מיל נציגאיור ult 4). יש לציין כי זיהוי Cy5 בשלב זה דורש חשיפות ארוכות מצלמה (למשל, 1-4 שניות) לצורך זיהוי. לכן, ניקוד של פנוטיפים עם דפוסי immunostaining יכול להמשיך להשתמש באות Cy5 כדי לאשר עוברי permeabilized דומה יחד עם סמני רקמות ספציפיים (למשל, נוגדנים ספציפיים עצביים לראות באיור 4). האתגר הגדול ביותר בשיטה זו הוא הרגישות של כדאיות עובר לתהליך permeabilization, משהו שהטריד את הניסיונות קודמים לפתח שיטה זו 9,10,16 ארוכה. כדאיות לאחר permeabilization היא תלוי גיל בוטה, ועולה באופן דרמטי מבוגר העובר הוא על permeabilization 9. עם זאת, כפי שהראינו בעבר, חדירות הופכת להיות קשות יותר ויותר עם ​​גיל 1. לאחרונה דווח החברה מדגימה את יכולת permeabilize עוברי שלב מאוחר (שלב 14) על ידי בעניינים מחדש פנייהTane כממס בשיתוף עם D-limonene 17. השירות הרחב של שיטה השנייה זה לא ברור כמו שרק אחד השפעת הסמים התאפיינה (nocodazole) ויישום לעוברי שלב מוקדם יותר לא תואר 17. יתר על כן, יישום של שלב פיתוח C ° 18 שתואר לעיל תשואות חדירות בשלב מאוחר ועוד יותר מונע שימוש בממסים אורגניים רעילים. החוקר שהוא חדש לפרוטוקול EPS חווה השתנות בתוצאות permeabilization וכדאיות על ניסיונות ראשוניים. השלבים המתוארים כאן נותנים לחוקר את הכלים להשתנות באופן שיטתי תנאים של טיפולי permeabilization וצעדי דגירה לאחר מכן כדי לייעל את התנאים לזנים ספציפיים של דרוזופילה שהם עובדים בסביבה המעבדה שלהם. אתגר נוסף עם השיטה הוא ההשתנות בספיגה כימית ראתה מעוברים לעובר. השתנות זו באה לידי ביטוי בהטרוגניות שלראתה את ספיגת צבע Cy5 בעוברים מייד לאחר טיפול צבע (איור 3 א). לעומת זאת, Rhodamine B הצבע הוא במהירות רבה יותר ובאופן שווה, מפוזר ברקמות העוברית מאשר צבע Cy5 (איור 2 &quot;). לכן, כמה השתנות עובר לעובר עשויות להיות טיפחו במאפייני ההפצה של החומר הכימי, תרופה או רעלן של עניין, והוא טבועים בשיטה. איפה כימות של מינון היא קריטית, מומלץ שספיגה של התרופה או רעלן של עניין מאופיינת באמצעות שיטה אנליטית חלופית. יחד עם זאת, את הקלות של הפרוטוקול הנ&quot;ל, ואת היכולת לסנן מאות עוברים, מאפשר לחוקר להעריך את תגובות מינון ולהבקיע פנוטיפים אופייניים עם השקעה קטנה של משאבים, מה שהופך לגישה חזקה ראשונה לסמים או רעלים המאפיינים בזה מפותח מאוד מערכת מודל.

עובר דרוזופילה ממשיך להיות מודל המוביל לחקירה של מנגנונים בסיסיים של פיתוח 2. מודל רב עוצמה זו נתמך על ידי מערך רחב של כלים גנטיים מולקולריים המאפשרים מניפולציות של מהות כל גן בכל נקודת זמן ובמסגרת כל איבר מתפתח. הגודל הקטן, התפתחות מהירה, ואפיון המקיף של המורפוגנזה של עובר דרוזופילה להפוך אותו למודל של בחירה עבור מסכי גנטיים, שרבים מהם נחשפו מסלולים התפתחותיים בסיסיים 3,4. פנוטיפים רבים בעובר דרוזופילה אופיינו ולפרש בקלות, לעתים קרובות מתן אמצעים לזיהוי מנגנונים גנטיים מולקולריים שבבסיס אחראי לתכונה חריגה. מבחינה היסטורית, חסרון של מודל עובר הזבוב היה הקושי בהחדרת מולקולות קטנות לרקמות עובריים. מכשול זה מציב מגבלות על: 1)ing מולקולות קטנות ביו ידועות כמו בדיקות לחקור את מנגנוני התפתחות ו2) שימוש במודל שהוקם זה כדי להעריך פעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized. כתוצאה מכך, פוטנציאל ההקרנה של עובר הזבוב כבר לא מנוצל באפיון של פעילות מולקולה קטנה. משלוח של מולקולות קטנות לעובר הזבוב יכול להיות מושגת בשתי שיטות: 1) permeabilization של קליפת הביצה ו2) microinjection. מאמר זה מציג התקדמות לשיטה של permeabilization, כי הם קלים לביצוע בהגדרה של מעבדה דרוזופילה קונבנציונלית. יצוין, כי ההתקדמות בשיטות microinjection עם טכנולוגית מיקרופלואידיקה תורמת גם היא לשיטות של החדרת תרכובות ל5,6 העובר. היכרות עם מולקולות לעובר הוא למנוע על ידי שכבת שעווה של קליפת הביצה 7. קליפת הביצה דרוזופילה מורכבת מחמש שכבות. מןמבפנים החוצה הם: קרום vitelline, שכבת השעווה, שכבת כוריוני הפנימית, endochorion וexochorion 8. שלוש שכבות כוריוני חיצוניות ניתן להסיר על ידי emersion הקצר של העובר באקונומיקה מהולה, צעד המכונה dechorionation. שכבת השעווה נחשפה אז יכולה להיות בסכנה כתוצאה מחשיפה לממסים אורגניים, כגון heptane ויוקטן 7,9, טיוח את עובר dechorionated חדיר, בזמן שהוא נשאר עטוף בקרום vitelline הבסיסי. עם זאת, שימוש בממסים אלה מציג סיבוכים בשל רעילותם ואת הקושי בויסות פעולתם החזקה permeabilizing, אשר שניהם יש השפעות שליליות מוחלטת על 9,10 כדאיות עובר. שיטה של permeabilization באמצעות permeabilization עובר הרכב כינה ממס (EPS) כבר תיארתי בעבר 1. ממס זה מורכב מחומרים פעילי שטח D-limonene וצמחי המאפשרים הממס להיות misciblE עם מאגרים מימיים. הרעילות הנמוכה של d-limonene והיכולת לדלל את הממס לריכוזים רצויים הניבה שיטה יעילה ליצירת עוברים חדירים עם כדאיות גבוהה 1. עם זאת, שני גורמים אנדוגני המשיכו להביא מגבלות ליישום. ראשית, עוברים להפגין את ההטרוגניות בחדירות לאחר טיפול EPS, גם כאשר הטיפול נלקח כדי לשמור על היערכות התפתחותיים קרובה. שנית, עוברים מבוגרים יותר משמונה שעות כ הוכיחו קשה permeabilize, עולה בקנה אחד עם התקשות של קליפת הביצה שמתרחשת לאחר הטלת הביצים 11. שתואר כאן הן התקדמות בשיטת EPS כי: 1) לסייע בזיהוי וניתוח עוברי permeabilized כמעט זהה, גם לאחר צעדי הקיבעון וimmunostaining הוצאו להורג ו2) לאפשר permeabilization של עוברים בנקודות זמן התפתחותיים מאוחרות (&gt; 8 שעות, שלב 12 ומעלה). באופן ספציפי, יישום של צבע מרחיק אדום,חומצה קרבוקסילית Cy5, מתוארת המשמשת כמחוון חדירות, שנמשך בעובר במהלך התפתחות ולאחר קיבוע פורמלדהיד. בנוסף, הוא הראה כי גידול עובר ב18 ° C שומר על קליפת הביצה במצב רגיש EPS, המאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר (שלבי 12-16). מקדמות אלה להתגבר על המגבלות שהוזכרו קודם לכן למתודולוגיה EPS. יישום זה ולכן יספק לחוקרי אמצעי להציג את המולקולות קטנות של עניין לעובר בנקודות זמן התפתחותיים שונים, תוך שמירה על כדאיות.

<table><tbody><tr><td>Fly Cage</td><td>Flystuff.com</td><td>59-101</td><td>http://flystuff.com/general.php</td></tr><tr><td>Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&amp;nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>call for special order</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr><tr><td>Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&amp;nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>call for special order</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr><tr><td>d-limonene (Ultra high purity grade)</td><td>Florida Chemical Co.&amp;nbsp;</td><td>call for special order</td><td>http://www.floridachemical.com/</td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SS290-4</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr><tr><td>PBS powder</td><td>Sigma</td><td>56064C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma</td><td>R6626</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>CY5 carboxylic acid</td><td>Lumiprobe</td><td>#23090</td><td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472310-100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Nitex Nylon mesh&amp;nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>57-102</td><td>http://flystuff.com/misc.php</td></tr><tr><td>Dissolved oxygen (DO) membrane&amp;nbsp;</td><td>YSI</td><td>#5793</td><td>http://www.ysireagents.com/search.php</td></tr><tr><td>25 mm circular no.1 cover slip&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48380-080</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr><tr><td>Grape-agar plate mix&amp;nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>47-102</td><td>http://flystuff.com/media.php</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr></tbody></table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

עובר דרוזופילה כבר זמן רב מודל מעבדה רב עוצמה להבהרת מנגנונים מולקולריים וגנטיים המפקחים על פיתוח. הקלות של מניפולציות גנטיות עם המודל הזה החליפו גישות תרופתי כי הם דבר שבשגרה במודלים של בעלי חיים אחרים ומבחנים מבוססי תאים. כאן אנו מתארים ההתקדמות בפרוטוקול המאפשר יישום של מולקולות קטנות לעובר זבוב הפירות הפיתוח. השיטה מפרטת צעדים כדי להתגבר על האטימות של קליפת הביצה, תוך שמירה על כדאיות עובר. permeabilization קליפת הביצה על פני מגוון רחב של שלבי התפתחות מושגת על ידי יישום של permeabilization שתואר קודם לכן d-limonene עובר ממס (EPS 1) ועל ידי עוברי הזדקנות בטמפרטורה נמוכה (18 ° C) לפני טיפולים. בנוסף, שימוש בצבע מרחיק אדום (Cy5) כאינדיקטור permeabilization מתואר, אשר תואם עם יישומים במורד הזרם מעורבים שפעת אדומה וירוקה סטנדרטיתצבעי orescent בהכנות בשידור חי וקבועות. פרוטוקול זה הוא ישים למחקרים באמצעות תרכובות ביו לחקור מנגנוני התפתחות, כמו גם למחקרים שמטרתם להעריך את הפעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized.

<html> מכשירי טיפול בעובר הם בתמונה באיור 1 על מנת לסייע בלדמיין את המכשירים &quot;תוצרת הבית&quot; למניפולציה בפרוטוקולים לעיל. תוצאות ניתן לראות באיור 2 ממחישות את ההשפעה החזקה של גידול עובר ב18 מעלות צלזיוס ביכולת שלהם להיות permeabilized ידי EPS בשלבים מאוחרים של התפתחות. מצב זה מיושם בשלב הפרוטוקול 2.1. יעילות של צבע החומצה קרבוקסילית Cy5 כדי לחשוף את הרמות השונות של חדירות לראות בדרך כלל בEPS עוברי מטופלים לראות באיור 3. הדינמיקה ההתפתחותית של חלוקת הצבע בחלמון הוא ראתה גם באיור 3, חושפת קריטריון המשמש להערכת כדאיות , כפי שתואר בפרוטוקול צעד 4.2. השירות של צבע Cy5 בקביעת permeabilization עובר לאחר טיפול רעלן, קיבעון פורמלדהיד וimmunostaining בא לידי ביטוי בתוצאה באיור 4. : לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig1highres.jpg" /> התקני איור 1. טיפול עובר לשיטת EPS. הסל השטוח קרקעי משמש בdechorination וEPS צעדי חשיפה (, &#39;). סל הפיתוח משמש לחשיפות ארוכות יותר התפתחותיות של עובר permeabilized (ב &#39;, ב&#39;). קאמרי השקופיות משמשת עבור חשיפות קצרות התפתחותיים והדמיה ברזולוציה גבוהה יותר של עוברים בשידור חי (C, C &#39;. ראה טקסט עבור תיאור נוסף). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig2highres.jpg" /> איור 2. השפעת הזדקנות על 18 מעלות צלזיוס ביעילות EPS בעוברים בשלב מאוחר. עוברים נאספו במשך שעות ואחרי הזדקנות ב18 מעלות צלזיוס למשך 20 שעה (AA פנלים &quot;, <sטרונג&gt; BB &quot;) או ב25 מעלות צלזיוס למשך 10 שעה (לוח CC&quot;). עוברים ב18 ° C ולאחר מכן היו dechorionated ומחולקים לשתי דגימות. המדגם הראשון טופל ישירות עם 1 מ&quot;מ Rhodamine B צבע בMBIM-T למשך 5 דקות, לשטוף ומדמיין תחת brightfield וקרינה כחולה ואדומה ערוצים (לוח AA &quot;). המדגם השני טופל ברווח למניה (1:10 בMBIM דקות 1), שטף ולאחר מכן טופל ב1 מ&quot;מ Rhodamine B למשך 5 דקות ולשטוף לפני ההדמיה (לוח BB &quot;). עוברים הועלו ב ° C25 היו dechorionated והתייחסו ישירות עם EPS (1:10 בMBIM דקות 1), שטף ולאחר מכן טופלו ב1 מ&quot;מ Rhodamine B למשך 5 דקות לפני ההדמיה (לוח CC &quot;). עוברים היו נחושים להיות בשלב 14 ידי הקפלים בבטן נחשפה על ידי autofluorescence חלמון בערוץ הכחול (לוח א &#39;, ב&#39;, ג&#39;). עוברים הועלו ב18 ° C הם בלתי חדירים לפני treatmen EPSלא כפי שניתן לראות בהעדר Rhodamine B ספיגה (לוח &quot;). טיפול EPS של 18 ° C עוברי תשואות ברמה גבוהה של חדירות כפי שניתן לראות על ידי Rhodamine B ספיגה (לוח ב &#39;&quot;). עוברים הועלו ב ° C25 יישארו בלתי חדירים אפילו עם טיפול EPS כפי שניתן לראות על ידי הרחקה של Rhodamine B (לוח C &quot;). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig3highres.jpg" /> איור 3. התאגדות של Cy5 בעוברים חדירים ובת קיימא. עוברים נאספו ב25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות והתיישנו במשך 14 שעות ב18 מעלות צלזיוס (שווה ערך ל 7-9 עוברי שעה 25 מעלות צלזיוס, שלב 12). לאחר dechorination, EPS טיפול נעשה (1:40 בMBIM דקות 1) ואחריו דגירה בצבע Cy5 (50 מיקרומטר בMBIM-T ל15 דקות). עוברים נשטפו שלוש פעמים בMBIM-T והועברו לסל פיתוח עם MBIM במאגר. פיתוח הורשה proceed במשך 8 שעות בטמפרטורת חדר. ספיגה של Cy5 (אדום) הוא צילם בערוץ מרחיק האדום מייד לאחר טיפול צבע וכביסה (לוח א &#39;) ולאחר פיתוח שעות 8 (לוח ב&#39;). הפצה של החלמון נתפס על ידי autofluorescence בערוץ הכחול. ספיגת צבע, ולכן חדירות, נתפסת להשתנות מעובר לעובר. צבע Cy5 (אדום) הוא ראה בתרגום לחלמון (הכחול), שהופך להיות מרוכז ללומן של המעי בשלב 16 (סגול, לוח ב &#39;). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig4highres.jpg" /> איור 4. קביעת השפעות permeabilization והתיל כספי בעוברים קבועים וimmunostained. עוברים נאספו ב25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות והתיישנו במשך 14 שעות ב18 מעלות צלזיוס (שווה ערך ל 7-9 עוברי שעה 25 מעלות צלזיוס, שלב 12). לאחר dechorination, טיפול EPS נעשה (1:40 בMBIM דקות 1) ואחריו דגירה בצבע Cy5 (50 מיקרומטר בMBIM-T ל15 דקות) יחד עם מתיל כספי (50 מיקרומטר MeHg, לוח ב &#39;) או שליטת ממס DMSO (0.1% ריכוז סופי, לוח א&#39;). עוברים נשטפו עם MBIM-T והניחו בסל פיתוח עם MBIM: בינוני M3 במאגר והתיישן במשך 8 שעות נוספות בטמפרטורת חדר. עוברים אז היו קבועים ב4% הכנת paraformaldehyde-heptane שני שלבים על ידי פרוטוקול סטנדרטי 14. צביעה בוצעה עם אנטי Fasciclin השני (ירוק ב, לינה ולבנה ב&#39;, ב &#39;) לתייג תאי עצב מוטוריים ונוגדנים נגד elav (אדום בA, B) לתייג את כל גופי תא העצב. צבע Cy5 מתגלה על ידי הקרינה ישירה, אשר דורשת חשיפה ממושכת בשל עוצמת הקרינה פחתה בשל קיבעון (Cy5 הוא פסאודו בצבע כחול בכל הלוחות). ההשפעות של MeHg נתפסות בדפוסים וcluste סדיריםטבעת של הגופים לרוחב תא נוירון chordotonal (elav חיובי, שכותרת באדום ומסומנים בחצים לבנים בB לעומת). בנוסף, הסתעפות אופיינית למגזרי (SN) (חיצים ירוקים מוצקים ב&#39;) נתפסת להיות משתנה מאוד עם חשיפת MeHg (חיצים ירוקים מוצקים בB &quot;) עולה בקנה אחד עם השפעות שדווחו בעבר של MeHg על העובר 15. השלכה של ינמיגזריות ומגזרית עצבים בשורשיהם נתפסות להיות עקורות בדיעבד עם חשיפת MeHg (חץ ירוק פתוח בב &#39;). הערה: מהתיל הכספי הוא עצבי חזק. יש להקפיד ללבוש כפפות ומשקפי מגן בעת ​​טיפול. רשות צריכה להיעשות דרך מתקן בטיחות סביבתית מוסדי ושירות.

Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K Views.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, ...

Video: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Bioengineering

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Developmental Biology

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or complete loss of viability at different stages of development. Our lab has developed a method to assess viability in Drosophila from embryo to fully mature adult. The method relies on quantifying the number of progeny present at different stages during development, starting with hatched embryos. After embryos have been quantified, additional stages are counted, including L1/L2, pupae, and mature adults. After all stages have been examined, a statistical analysis such as the chi-square test is used to determine if there is a significant difference between the starting number of progeny (hatched embryos) and later stages culminating in the observed number of adults, thus rejecting or accepting the null hypothesis (that the number of hatched embryos will be equal to the number of larvae, pupae, and adults recorded throughout the stages of development). The primary advantage of this assay is its simplicity and accuracy, as it does not require an embryo rinse to transfer them to the food vial, avoiding losses from technical errors. Although the protocol described here does not directly examine L2/L3 larvae, additional steps can be added to account for these. Comparing the number of hatched embryos, L1, pupae, and adults can help determine if viability was compromised during the L2/L3 stages for further studies (the use of colored food helps with visual identification of larvae). Overall, this method can help Drosophila researchers and educators determine when viability is compromised during the fly life cycle. Routine assessment of stocks using this assay can prevent accumulation of secondary mutations that may affect the phenotype of the originally isolated mutant, especially if the original mutations affect fitness. For this reason, our lab maintains multiple copies of each of our Dm ime4 alleles and routinely checks the purity of each stock with this method in addition to other molecular analyses.&#160;

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

This protocol is designed to assess the viability of Drosophila at every developmental stage, from embryo to adult. The method can be used to determine and compare the viability of different genotypes or growth conditions.

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

שיטה של permeabilization של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assay וMicroinjection פצע

הכנה בינונית של

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים

הר כולו RNA פלורסנט

שיטה של ​​permeabilization של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assay וMicroinjection פצע

הכנה בינונית של

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים

הר כולו RNA פלורסנט

שיטה של permeabilization של