Noi riconosciamo il dottor Harold Dvorak per utili discussioni, tra cui il suggerimento di provare fissazione in 37 ° C PFA. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere P01 CA92644 e da un contratto della Fondazione Nazionale per la Ricerca sul Cancro.

1. Coltura cellulare sul collagene rivestito disco di vetro <ol><li> Dischi Luogo di vetro (12 mm di diametro) in un barattolo di vetro (4 oz) e autoclave per sterilizzare i dischi. </li><li> Mettete 25 ml di etanolo al 70% in un tubo Falcon da 50 ml e metterlo in una cappa di coltura cellulare. Questa soluzione può essere riutilizzato più volte fino a quando il livello della soluzione scende a 20 ml. </li><li> Posizionare una pinza nitide con un punto extra fine in etanolo al 70% per 5 minuti prima di utilizzarlo per gestire il disco di vetro. </li><li> Rimuovere con cautela la pinza dal tubo e chiudere il tappo, quindi inserire delicatamente i etanolo trattati pinza sulla parte superiore del tubo di aria secca per 2 min. Non permettere che la punta delle pinze per toccare nulla nel cofano. </li><li> Utilizzare le pinze sterili per afferrare un disco di vetro sterile fuori del vaso di vetro e metterla in un pozzetto della piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Ripetere l&#39;operazione fino a quando il numero desiderato di pozzetti è stato popolato con dischi. </li><li> Mettete 500 ml di soluzione di collagene bovino (50 ng / ml) in ciascun pozzetto contenente un disco di vetro e porlo in 37 ° C, 5% CO 2 incubatore di coltura cellulare per almeno 30 min. Non vi è nulla di male in un incubazione più lungo. </li><li> Harvest HUVEC (cellule umane ombelicale Vena endoteliali) o PC3 (prostata cellule tumorali) che erano già coltivate in 150 millimetri piastra di coltura cellulare attraverso tripsinizzazione e bloccano l&#39;attività tripsina utilizzando il suo terreno di coltura completo. Raccogliere le cellule in una provetta Falcon da 15 ml. </li><li> Contare il numero di cellulare e assicurarsi che la redditività è superiore al 90%. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 200 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. </li><li> Utilizzare il mezzo di coltura per diluire le cellule a 10 5 cellule / ml. Posizionare cellule su ghiaccio. </li><li> Aspirare il collagene nella cappa coltura cellulare e posizionare delicatamente 500 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto in cui i dischi di vetro sono state fase solida con collagene. 5 x 10 4 cellule / pozzetto della piastra a 24 pozzetti darà il 60% confluency per HUVEC e il 30% di confluenza di cellule PC3. Nota: aggiungi sospensione più cellulare per densità delle cellule superiore. </li><li> Cultura le celle di una 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 1 ora, 2 ore, 4 ore, 6 ore, o 24 ore per tracciare le attività nanopodia e il passaggio delle cellule. Tipicamente, le cellule saranno allegare al disco di vetro nei primi 30 min, poi iniziano a polarizzare e migrare nella prima ora, e svolgono interazioni intercellulari e divisione cellulare nelle ore successive. </li></ol> 2. Fissazione delle cellule <ol><li> Ogni bene avrà bisogno di 500 microlitri 4% PFA (paraformaldeide) per fissare le cellule. Sia fabbricata commercialmente o appena fatto 4% PFA può essere utilizzato. Calcolare la quantità di PFA necessario in base al numero di pozzetti preparati, e posizionare PFA in un tubo Falcon da 15 ml. ATTENZIONE: paraformaldeide è un sospetto cancerogeno. </li><li> Inserire il tubo falco in uno stand di polistirolo che era già in atto in un 37 ° C incubatore. Lasciare il tubo in incubatrice per 30 min alla guerram il PFA a 37 ° C. </li><li> Posizionare una piastra elettrica nel cofano cultura e accenderlo. </li><li> Estrarre la piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti e preriscaldata PFA fuori dell&#39;incubatore e collocarlo sulla parte superiore del pad di riscaldamento. </li><li> Utilizzare una sola mano per aspirare il mezzo da un pozzo, e subito dopo utilizzare l&#39;altra mano per far scorrere delicatamente 500 microlitri PFA nel pozzo attraverso il bordo bene. Per facilitare l&#39;aspirazione, inclinare la piastra di coltura a circa 45 °, appoggiandola contro il supporto polistirolo in modo che sia stabile a tale angolo. Ciò faciliterà l&#39;aspirazione e l&#39;aggiunta di soluzione PFA al pozzo senza disturbare le cellule in coltura. Questo è il passo più importante per preservare la struttura cellulare delle attività cellulari. </li><li> Ripetere il processo fino a quando tutti i pozzetti con un disco di vetro hanno ricevuto PFA. Nota: tutti i passi che devono cambiare soluzione pre-esistente dal pozzo si applicano stesse procedure di aspirazione. </li><li> Porre la piastra in 37 ° C per 5 min. </li&gt; <li> Prendere la piastra posteriore alla cappa cultura e inclinare contro Styrofoam come descritto al punto 2.5. Con una mano per trasferire delicatamente la PFA dal pozzo in un tubo di raccolta; utilizzare l&#39;altra mano per posizionare subito dopo almeno 500 microlitri camera temperatura PBS nel pozzo. Dopo che tutti i pozzetti sono stati lavati, tornare e ripetere il lavaggio PBS ancora una volta in ogni bene. Svuotare la raccolta PFA in un contenitore per rifiuti pericolosi. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio ICC con l&#39;aggiunta di 2% siero fetale bovino da PBS. Sodio azide 0,04% (diluito dal 20% soluzione madre) è aggiunto come conservante. ATTENZIONE: sodio azide è un composto tossico. Il tampone può essere conservato in 4 ° C per un lungo periodo di tempo senza contaminazione batterica. </li><li> Con la piastra di coltura ancora inclinata contro uno stand, ancora una volta, il ciclo attraverso ogni bene aspirando per rimuovere PBS e subito dopo l&#39;aggiunta di 500 ml di ICC tampone di bloccaggio. Le cellule sono ora pronti per immunofluorescenza. Se necessario, lacellule fisse possono essere memorizzati in un frigorifero a 4 ° C per una settimana senza significativa perdita di proteine ​​TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 immunofluorescenza colorazione di Nanopodia <ol><li> In ogni pozzetto, sostituire il tampone bloccante 500 microlitri ICC con un nuovo tampone di bloccaggio contenente 0,01% Triton X-100 e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 ora. Non utilizzare superiore a 0,03% Triton X-100 in cui solleverà TM4SF1 dalle membrane cellulari. PBS lavato cellule dal punto 2.10 possono essere spostati direttamente al tampone bloccante contenente Triton se la colorazione è pronta per essere avviata immediatamente. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo primario anti-TM4SF1 (o anti-CD9) a 0,5 mg / ml a ICC tampone di bloccaggio. </li><li> In ogni pozzetto, rimuovere il tampone Triton ICC/0.01% e sostituirlo con 300 microlitri della soluzione anti-TM4SF1-anticorpo. Incubare 2 ore a temperatura ambiente o lasciare per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare ogni pozzetto con non meno di 500 microlitri di PBS. Ripetere 3x; ogni volta dare a least 5 min di tempo di incubazione. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpo e phalloidin secondario ICC tampone di bloccaggio, utilizzando una diluizione 1.000 volte di Alexa 488 marcato asino anti-topo anticorpo secondario (2 mg / ml concentrazione finale) e 1000 x diluizione falloidina (50 ng / ml concentrazione finale). </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 300 ml di anticorpo secondario e la soluzione phalloidin ad ogni pozzetto e incubare per 2 ore o lasciare tutta la notte a 4 ° C. </li><li> Ripetere i passaggi di lavaggio PBS con almeno 5 minuti di incubazione per lavaggio. In ultimo lavaggio, lasciare ogni bene in PBS per 1 ora. </li><li> Cada una sola goccia (~ 10 ml) di fissaggio anti-sbiadimento media su un vetrino. </li><li> Piegare la punta di un 19 G 1 ½ in siringa 90 ° premendo delicatamente su una superficie dura. Con una mano tenere l&#39;ago piegato e sollevare delicatamente un disco di vetro dal pozzo, e utilizzare l&#39;altra mano per afferrare il disco usando le pinze taglienti. </li><li> Ruotare il disco di vetro &amp;# 160; rivolto verso il basso lasciando il contatto lato della cella del supporto di montaggio sul vetrino. Inserire delicatamente il disco di vetro e lasciare asciugare durante la notte in un luogo buio a temperatura ambiente. </li><li> Procedere con l&#39;immagine immunofluorescenza macchiato nanopodia, o conservare le diapositive in una scatola di diapositive a -20 ° C. Le diapositive resteranno visibili per alcuni mesi in -20 ° C. </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nanopodia sono sottili canali di membrana cellulare che attaccano saldamente alla matrice attraverso TMED e può estendersi più di 100 micron da una cella cellulare polarizzata di percepire l&#39;ambiente e mediare le interazioni intercellulari 2,3. Nanopodia aderire alla matrice così fermamente che i residui sono lasciati alle spalle come le cellule si allontana (figure 1 e 2). Nanopodia permettono quindi di studiare come le cellule percepiscono il loro ambiente e determinare il percorso di movimento delle cellule, e di come il movimento cambiamenti di espressione genica o farmaco di trattamento. Tuttavia, a causa della fragilità di queste sottili (100-300 micron di larghezza) strutture a membrana, la cautela deve essere presa al fine di preservarli. Al fine di registrare fedelmente attività cellulari senza disturbare nanopodia, e per studiare come condizioni sperimentali influenzano le attività nanopodia e il percorso del movimento delle cellule, si dovrebbe prima verificare che le cellule crescono in modo efficace in mezzo completo prima pursuing l&#39;esperimento. Le cellule normali sane primarie endoteliali, come HUVEC, in fresco mezzo di coltura completo EGM2-MV normalmente divide circa ogni 18 ore durante la fase di log della crescita entro i sei passaggi della loro cultura. Si dovrebbe evitare l&#39;uso di HUVEC che sono maggiori di passaggio-6 come numeri di passaggio più alti porteranno a un aumento del numero delle cellule senescenti o binucleari nella cultura 7 e influenzeranno la capacità delle cellule di polarizzare e produrre nanopodia 2. Le cellule tumorali della prostata PC3 sono più stabili alle culture (osservazione inedito), ma si dovrebbe comunque evitare l&#39;uso di cellule più di dieci passaggi dal loro allontanamento dallo stato congelato. Cellule aderenti sane in genere attribuiscono ai dischi collagene rivestite entro i primi 30 minuti dopo che sono teste di serie, seguiti poco dopo da polarizzazione cellulare. Così si dovrebbe aspettare di vedere la maggior parte delle cellule endoteliali in uno stato polarizzato alla fine della prima ora di incubazione. Se unmaggior parte delle cellule endoteliali non attaccare alla superficie del vetro, quindi verificare se (a) collagene ha superato la data di scadenza, (b) tripsinizzazione durante la raccolta delle cellule era troppo severo, o (c) le cellule sono malsani. Cellule PC3 polarizzano più lento di cellule endoteliali, ma devono dimostrare una morfologia polarizzata entro 2 ore dopo la semina. In caso di contaminazione si verifica in cultura, quindi esaminare se i dischi di vetro o pinze sono stati correttamente sterilizzati. In alternativa, si può considerare l&#39;utilizzo di slides da camera; il protocollo qui descritto suggerisce l&#39;uso di dischi di vetro in piastre di coltura da 24 pozzetti in modo da ridurre i costi e di gestire più facilmente un gran numero di campioni. Metodi di immunoistochimica convenzionali, l&#39;uso di PBS per lavare le cellule prima di aggiungere fissativo temperatura ambiente, facilmente disturbare strutture cellulari pregiati come nanopodia e li distruggerà durante il processo di colorazione. Ciò è dovuto al fatto che gli stress fisici, come variazioni di temperatura durante fixati cellulario rigorosa lavaggio PBS durante il processo di colorazione sono le principali cause di frammentazione o rimozione di strutture nanopodial. Con tre semplici modifiche metodologiche - (i) non disturbare cella stato di polarizzazione mediante lavaggio con PBS prima del fissaggio, (ii) risolvere le cellule direttamente nel 37 ° C preriscaldata PFA e incubare le cellule a 37 ° C durante la fissazione, e (ii) lavare delicatamente celle a temperatura ambiente PBS - nanopodia sono largamente conservate figura 1 mostra come temperature PFA e PBS influenzano la conservazione di nanopodia in cellule endoteliali coltivate; la figura 2A mostra che l&#39;espressione TM4SF1 è eterogeneo cellule PC3 e che le cellule con la più forte TM4SF1 colorazione visualizzano la più lunga. nanopodia. La temperatura è noto a pregiudicare le attività di F-actina e l&#39;integrità tubulina 8,9. Fissa così le cellule alla stessa temperatura in cui sono state coltivate cellule (questo è 37 ° C nel protocollo qui descritto) è probabile che meglio preservare lo stato cellulare polarizzata ( <sTrong&gt; Figure 1A e 1B) e giunzioni intercellulari (Figura 1C), permettendo la registrazione più fedele delle attività cellulari nel momento in cui le cellule vengono rimosse per studi sperimentali. A differenza sul lato di rientro, proiezioni nanopodia alla porta anteriore della cella sono di breve durata, in parte perché le cellule sono costantemente in movimento e superamento leader nanopodia bordo mentre si muovono in avanti 2,3. Così il momento migliore per osservare nanopodia al fronte principale non è lungo dopo che le cellule sono placcati, idealmente intorno ai 30-60 minuti dopo la semina, un momento in cui le cellule hanno attaccato alla matrice e stanno cominciando solo per avviare il movimento. Imaging cellulare dal vivo è un approccio alternativo che consente una registrazione precisa di attività nanopodia al fronte principale. PFA non è l&#39;unico reagente utilizzato nella fissazione; solventi organici come metanolo, etanolo, acetone e sono spesso utilizzati in fissazione delle cellule per immunoistochimica 10.Il miglior fissativo è spesso deciso dalla posizione epitopo di un anticorpo specifico utilizzato nella colorazione (dati non pubblicati). Per il mouse TM4SF1 antiumana anticorpo che riconosce domini extracellulari del TM4SF1 (Millipore, utilizzato in questo studio), PFA è l&#39;unico fissativo che rivela TMED in immuno-colorazione, indicando che altri solventi organici distruggono l&#39;epitopo. Al contrario, coniglio anti-umano TM4SF1 anticorpo policlonale da Acris (dati non mostrati), la cui epitopo si trova in diciotto aminoacidi vicino alla regione N-terminale, funziona anche con cellule fissate etanolo. Tuttavia, l&#39;anticorpo Acris non cede buona colorazione TM4SF1, probabilmente perché l&#39;epitopo N-terminale è preoccupato dalle interazioni TM4SF1 con molecola citosolico (s) che coprono parzialmente l&#39;epitopo. Triton X-100 è un tensioattivo non ionico ed è spesso usato in immuno-colorazione con l&#39;obiettivo di permeabile la membrana cellulare e ridurre la tensione superficiale di soluzioni acquose 11,12. However, questa capacità porta anche il rischio di solubilizzare le proteine ​​di membrana. TM4SF1 viene completamente rimosso dalla superficie cellulare da Triton X-100 concentrazioni superiori allo 0,05% 2,3. Per questo motivo, solo un trattamento di 1 ora con 0,01% Triton X-100 prima dell&#39;aggiunta dell&#39;anticorpo primario viene utilizzato nel metodo qui descritto. Questo trattamento permeabilizes la membrana sufficiente per permettere TM4SF1 peri-nucleare essere ben valutata dagli anticorpi, preservando più TM4SF1 sulla membrana cellulare. Per doppia colorazione di TM4SF1 con proteine ​​situate nel nucleo, utilizzare 0,03% Triton X-100 in fase di preincubazione se 0,01% Triton non funziona. Ciò faciliterà Triton X-100 perforazione della membrana nucleare. TM4SF1 è altamente specifico per le cellule endoteliali e cellule tumorali; la maggior parte degli altri tipi di cellule o non esprimono TM4SF1 o esprimono ad un livello molto basso 2,3. Tuttavia, tetraspanine classici - una famiglia che comprende trentatré membri sapg CD9, CD81 e CD151 - sono ubiquitariamente espressi 6, e si possono trovare anche in domini di membrana in nanopodia 2,3 (Figura 3A). Così, colorazione tetraspanine classici attraverso lo stesso metodo immuno-colorazione utilizzata per TM4SF1 può abilitare gli studi di nanopodia in tipi di cellule che non esprimono TM4SF1. Cellule tumorali che esprimono PC3 TM4SF1 altamente tendono a muoversi continuamente in una sola direzione, mentre le cellule PC3 debolmente esprimono TM4SF1 non hanno una direzione chiaramente definita di movimento (Figura 2A e dati non pubblicati). TM4SF1 livello di espressione nelle cellule tumorali è noto essere correlata con la loro potenziale metastatico 13, e ricerche sono attualmente in corso la capacità delle cellule tumorali linking &#39;esprimere TM4SF1 e produrre nanopodia al loro potenziale metastatico. In sintesi, padronanza di metodi efficaci per la colorazione nanopodia consente ai ricercatori di tracciare il percorso del movimento cellulare attraverso nanopodia residues, studiare come le cellule percepiscono il loro ambiente per il movimento, come il movimento delle cellule è modificato con l&#39;alterazione dei livelli di espressione dei geni (sia iperespressione o atterramento di geni di interesse). Nanopodia rappresentare un nuovo strumento per la ricerca di polarizzazione delle cellule e il movimento delle cellule.

Durante la polarizzazione per il movimento, cellule animali si estendono una serie di dinamiche, protrusioni di membrana dalle loro superfici, tra cui filopodia, lamellipodia, fibre di retrazione, e volant 1. Recentemente aggiunto a questa lista fosse nanopodia, un tipo recentemente riconosciuta sottile (100-300 micron di diametro), allungato (fino a 50-100 micron), membrana di proiezione che forniscono canali di membrana per l&#39;estensione delle strutture di F-actina come filopodia e fibra di svincolo e quella macchia positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) in endoteliali tumorali e cellule in coltura 2,3. TM4SF1 è una proteina con topologia tetraspanin-come originariamente conosciuto come un antigene sulla cellula tumorale 4 prima della scoperta che la molecola è un biomarker cellule endoteliali che gioca un ruolo essenziale nella proliferazione delle cellule endoteliali e la migrazione 2,3. Immunofluorescenza ha rivelato che TM4SF1 è localizzato perinucvescicole Lear e alla membrana plasmatica, e si arricchisce in TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED ancoraggio nanopodia alla matrice e presente in uno schema a fasce regolarmente distanziate di 1-3 lunghezza TMED / micron di nanopodia. Nanopodia tipicamente estendono dalla porta anteriore di una cella e finali posteriore durante polarizzazione cellulare per il movimento. A causa della natura aderente ditta di TMED, nanopodia sono in grado di rientrare nella cella mentre si allontana; residui nanopodia abbandonati tracciano così il percorso del movimento cellulare. Nanopodia fornire canali di membrana per l&#39;estensione F-actina e retrazione, e sono siti di interazioni intercellulari e comunicazioni 2,3. Queste caratteristiche fanno sì che nanopodia offrono un&#39;opportunità unica di studiare i meccanismi alla base di montaggio F-actina durante la polarizzazione cellulare, rilevamento cellulare dell&#39;ambiente, la determinazione del percorso e la direzione del movimento delle cellule, e le interazioni intercellulari unnd comunicazioni. A causa della natura altamente idrofoba TMED e la natura membranoso sottile e fragile di nanopodia, particolare attenzione deve essere presa al fine di preservare TMED e nanopodia. La distruzione di nanopodia e la rimozione di TMED con metodi di laboratorio più comuni è un possibile motivo per cui solo sessantatré pubblicazioni sono apparsi su TM4SF1 fin dalla sua prima scoperta nel 1986 1 e per la totale mancanza di conoscenza di TM4SF1 arricchimento 100-300 micron microdomini su superficie delle cellule fino alla relazione del TM4SF1 in cellule endoteliali nel 2009 2. Metodi di immunoistochimica convenzionali comunemente utilizzare solventi organici come etanolo, metanolo, acetone o riparare cellule e usare 0,1% o maggiore concentrazione di Triton X-100 per permeabilize celle 5. Gli studi qui descritti implementati tre importanti modifiche al metodo convenzionale per rivelare TMED e nanopodia: (i) utilizzano 37 ° C 4% PFA e fissare le cellule a 3776; C incubatore, (ii) applicare dolce temperatura ambiente lavaggio PBS, e (iii) utilizzare meno dello 0,03% Triton X-100 solo brevemente permeabilize celle prima aggiunta di anticorpo primario, come Triton X-100 superiore a 0,03% estrarrà TM4SF1. Tutti tetraspanine formano microdomini sulla membrana cellulare 6 e alcuni colocalize con TMED in endoteliali e cellule tumorali 2,3. Come tetraspanine come CD9, CD81 e CD151 sono espressi ubiquitariamente, il protocollo di colorazione qui descritto può essere estesa a diversi tipi di cellule che mancano TM4SF1 per il controllo della funzione nanopodia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass discs&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-545-82&#160;</td>
			<td style="width:983px;">12-mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-310</td>
			<td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-544-1</td>
			<td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50-ml falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:133px;">352070</td>
			<td>50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">15-ml falcon tube with Styrofoam rack</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:133px;">430790</td>
			<td>Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sharp forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">13-812-42</td>
			<td>Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353047</td>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">150-mm cell culture plate&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353025</td>
			<td>150-mm cell culture plate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">19G 1 &#189; syringe needle&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">309635</td>
			<td>19G 1 &#189;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td>Decon&#39;s Pure Ethanol 200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">collagen solution&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">354249</td>
			<td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:160px;">Cellgro</td>
			<td style="width:133px;">25-053-CI</td>
			<td><a name="RANGE!D15">0.25% Trypsin-EDTA 1X</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">75889 5 LT</td>
			<td style="width:983px;">PBS, 10X Solution, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">19943 1 LT</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td><a name="RANGE!D19">Fetal Bovine Serum</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EGM2-MV</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T8787</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">S2002-25G</td>
			<td>solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human TM4SF1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">MAB3127</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human CD9 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">555370</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">A-21202</td>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Chemicon</td>
			<td style="width:133px;">90324</td>
			<td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">anti-fade mounting media&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">P-36931</td>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Buffers and solutions</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">70% ethanol&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>17.5 ml of ethanol (200 proof) 
			7.5 ml of double deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS (make 200 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20 ml of 10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">180 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20% Triton X-100 (make 20 ml)&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">4 ml</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">16 ml double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4% NaN3 (make 25 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">1 g of NaN3</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Make stock soln. of 50 &#956;g/ml (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">830 &#956;l of Collage I (3 mg)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml PBS&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ICC Blocking Buffer (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">49 ml PBS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2% FBS (add 1 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">0.04% NaN3 (add 100 &#956;l of 4% NaN3)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml of ICC Blocking Buffer&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 &#956;l of 20% Triton X-100</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Cell</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">HUVEC&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Lonza&#160;</td>
			<td>C2517A</td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PC3</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-1435</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">cell culture hood</td>
			<td style="width:160px;">NuAIRE</td>
			<td style="width:133px;">Nu-425-600</td>
			<td>NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">37 &#176;C, 5% CO2 cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:160px;">CellStar</td>
			<td style="width:133px;">QWJ300DABA&#160;</td>
			<td>Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">heating pad&#160;</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td style="width:133px;">1020</td>
			<td style="width:983px;">K&#38;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">centrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorvall&#160;</td>
			<td style="width:133px;">T6000B&#160;</td>
			<td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopodia - thin, fragile membrane projections with roles in cell movement and intercellular interactions

Cellule aderenti in coltura mantenere uno stato polarizzato per sostenere il movimento e le interazioni intercellulari. Nanopodia sono sottili, di forma allungata, in gran parte F actina-negativo-proiezioni di membrana in cellule endoteliali e tumorali che possono essere visualizzati attraverso TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) immunofluorescenza. Cluster TM4SF1 di 100-300 micron di diametro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenente da 3 a ben 14 singoli TM4SF1 molecole. TMED sono disposte in modo intermittente lungo nanopodia ad una distanza regolare di 1 a 3 TMED per μ m ed ancorare saldamente nanopodia a matrice. Ciò consente nanopodia di estendere oltre 100 μ m dalla porta anteriore o posteriore finale delle cellule endoteliali tumorali o polarizzati, e fa sì che i residui di membrana di essere lasciato in matrix quando la cella si allontana. TMED e nanopodia sono stati trascurati a causa della loro estrema fragilità e sensibilità alla temperatura. Lavaggio di routine e la fissazione disturbare la struttura. Nanopodia sono conservate mediante fissaggio diretto in paraformaldeide (PFA) a 37 ° C, seguito da una breve esposizione al 0,01% Triton X-100 prima della colorazione. Nanopodia aprire nuovi orizzonti in biologia cellulare: promettono di rimodellare la nostra comprensione di come le cellule percepiscono il loro ambiente, rilevare e identificare altre cellule a distanza, avviare interazioni intercellulari a stretto contatto, e dei meccanismi di segnalazione coinvolte nel movimento, la proliferazione, e la cella -CELL comunicazioni. I metodi che sono sviluppati per lo studio nanopodia TM4SF1-derivati ​​possono essere utili per gli studi di nanopodia che si formano in altri tipi di cellule attraverso l&#39;agenzia di tetraspanine classici, in particolare il ubiquitariamente espressa CD9, CD81 e CD151.

Per la Fase 1: Se le cellule (come HUVEC e PC3 utilizzato in questo studio) sono in grado di crescere normalmente, le cellule si attaccano al disco collagene rivestite entro 30 minuti dopo che sono teste di serie, polarizzano e diventano mobili poco dopo, e si estendono nanopodia prima del loro percorso di movimento. figure 1A e 1B mostrano rispettivamente una polarizzata e proliferanti HUVEC. Figura 2A mostra cellule PC3 polarizzate in uno stato mobile. Per la Fase 2: Con preriscaldamento del 4% PFA a 37 ° C, che fissa le cellule a 37 ° C per 20 min, e lavaggio delicato con temperatura ambiente PBS, stati cellulari devono essere ben conservati. Generalmente, isolato individuo HUVEC (Figura 1A, 1) o PC3 (Figura 2A) cellule mostrerà una morfologia polarizzata, a meno che le cellule sono in stato di divisione cellulare (Figura 1B, 1). Interazioni intercellulariportando alla formazione di giunzione cellula (Figura 1C, 1) sono anche comunemente osservati. Nanopodia dovrebbe apparire sulla periferia cellulare, e F-actina sarà spesso presente nelle porzioni prossimale nanopodia alla cella. Le temperature fredde provocano F-actina a ritirare di nuovo in cellule lasciando dietro di canali di membrana nanopodia. Temperatura ottimale, come mostrato negli esempi utilizzando 4 ° C PFA fissaggio e lavaggio PBS freddo, disturberà e distruggere struttura nanopodia in cellule polarizzate (Figura 1A, 2), cellule proliferanti (Figura 1B, 2), e produrre artificialmente distanze in giunzioni intercellulari (Figura 1C, 2). Per Passo 3: Molte proteine ​​legate alla membrana compreso TM4SF1 sono molto sensibili al Triton X-100 e saranno rimossi dalla superficie cellulare se si utilizzano concentrazioni superiori allo 0,03% 2,3. Per preservare la maggior parte di TM4SF1 superficie cellulare, PCellule FA fissi devono essere trattati con 0,01% Triton X-100 contenente tampone bloccante per un&#39;ora prima di passare a anti-TM4SF1 anticorpo primario che è stato diluito in un tampone di bloccaggio regolare che non contiene Triton X-100. Come nanopodia sono proiezioni di membrana sottili e lunghe e allegare alla matrice attraverso TMED, intensità TMED sarà probabilmente bisogno di essere rafforzato attraverso le funzioni di luminosità e contrasto nel software di elaborazione delle immagini come Photoshop per rivelare e monitorare il percorso del movimento delle cellule attraverso i residui nanopodia (Figura 1, 2 inserti). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51320/51320fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51320/51320fig1.jpg" /> Figura 1. Proiezioni Nanopodia durante il movimento delle cellule endoteliali, la divisione cellulare e la formazione di svincolo. HUVEC erano appena coltivate per 6 ore after placcatura al 60% di confluenza sul disco di vetro rivestite di collagene. Le cellule sono state fissate con (1) il metodo modificato in cui le cellule sono state fissate in 37 ° C 4% PFA direttamente senza prelavaggio in PBS, e poste in un incubatore a 37 ° C durante il tempo di fissazione 20 min, o (2) un metodo di colorazione convenzionale in cui le cellule sono state lavate con PBS a temperatura ambiente per due volte e fissate in 4% PFA per 20 min a temperatura ambiente. Nanopodia, estensioni membrane sottili e lunghe che sono contrassegnati da un intermittente, modello a bande di TMED (frecce bianche), e che spesso racchiudono phalloidin macchiate di F-actina (frecce rosa) in porzioni prossimale alla cella, sono stati immunofluorescenza macchiato con anti-TM4SF1 Ab. Tre immagini rappresentative HUVEC sono state catturate per mostrare l&#39;aspetto di nanopodia durante (A) polarizzazione, (B) divisione cellulare, e (C) formazione di giunzione intercellulare. Scatole Inset mostrano ingrandimenti maggiori di nanopodia. Durante polarizzata (A) o retractestati cellulari d (B, C), le proiezioni nanopodia sono stati conservati fissando direttamente le cellule a 37 ° C PFA, mentre le strutture sono state in gran parte rimosse con il lavaggio e fissa le celle a temperatura ambiente PBS e PFA. (C) 37 ° C PFA fissazione conserva giunzioni intercellulari (frecce blu), mentre le giunzioni sono disturbati da temperature più fredde che causano le cellule a ritrattare, creando un divario tra le cellule a ponte da nanopodia, di cui la maggior parte contengono F-actina (frecce rosa) e alcuni non (frecce bianche) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51320/51320fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51320/51320fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51320/51320fig2.jpg" /> Figura 2. Nanopodia dimostrare la direzione del movimento delle cellule tumorali PC3. (A)Cellule tumorali PC3 erano appena coltivati ​​per 6 ore dopo la placcatura al 60% di confluenza sul disco di vetro rivestite di collagene. Le cellule sono state fissate direttamente in 37 ° C 4% PFA e poste in un incubatore a 37 ° C per 20 min per preservare nanopodia. Nanopodia (frecce bianche) e F-actina (frecce rosa) erano immunofluorescenza colorati con anti-TM4SF1 Ab e falloidina, rispettivamente. La casella inserto mostra nanopodia a maggiore ingrandimento. Questa immagine rappresentativa dimostra che l&#39;espressione TM4SF1 nelle cellule PC3 è eterogenea; una cella PC3 con una forte colorazione TM4SF1 (freccia gialla) ha prodotto lungo nanopodia ed è circondato da due cellule PC3 debolmente TM4SF1-macchiati (frecce rosse). Residui Nanopodia sul bordo d&#39;uscita (ib) indicano la direzione del movimento delle cellule PC3 durante il periodo di coltura cellulare 6 ore. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51320/51320fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:coS copi-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51320/51320fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51320/51320fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Visualizzazione di nanopodia attraverso tetraspanine CD9. (A) HUVEC sono stati di recente in coltura per 6 ore dopo la placcatura al 60% di confluenza su un disco di vetro rivestite di collagene. Le cellule sono state fissate nel 37 ° C 4% PFA e nanopodia (frecce bianche) sono stati rivelati mediante anti-CD9 Ab. F-actina (frecce rosa) è stato macchiato con falloidina. Questa immagine rappresentativa dimostra che CD9 localizza anche a nanopodia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51320/51320fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Nanopodia sono canali di membrana sottile ma fragili che si estendono fino a 100 micron dai principali anteriore o posteriore finale di una cella e percepiscono l&#39;ambiente cellulare. Fissaggio diretto a 37 ° C, lavaggio delicato, e di evitare di solventi organici come l&#39;etanolo, metanolo o acetone e di maggiori Triton X-100 le concentrazioni sono tenuti ad osservare queste strutture cellulari.

Nanopodia - sottili, fragili Proiezioni membrana con ruoli in movimento delle cellule e interazioni intercellulari

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Harvard Medical School.  Nanopodia sono canali di membrana sottile ma fragili che si estendono fino a 100 micron dai principali anteriore o posteriore finale di una cella e percepiscono l'ambiente cellulare. Fissaggio diretto a 37 ° C, lavaggio delicato, e di evitare di solventi organici come l'etanolo, metanolo o acetone e di maggiori Triton X-100 le concentrazioni sono tenuti ad osservare queste strutture cellulari. 

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Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Ricerca

Biologia

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash-e-Freeze: una tecnica innovativa per l&#39;acquisizione di membrana Dynamics con microscopia elettronica

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

Isolamento e imaging delle regioni pacemaker intatte e intatte della pelvi renale del topo mediante sezionamento del vibratoma

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...