Gli autori ringraziano Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quémeneur e Gil Toombes per i loro contributi essenziali per stabilire il metodo di nanotubi nel gruppo. Il gruppo di P.B. appartiene al Consorzio CNRS CellTiss, il Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) e di Scienze di Parigi et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai è stato finanziato dal EMBO fellowship a lungo termine (ALTF 1527-2014) e Marie Curie actions (H2020-MSCA-IF-2014, progetto membrana-ezrin-actina). M.S. è un Junior Fellow della Society of Fellows Simons.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo di tirare tubi da GUV dà ricco di informazioni sul sistema proteina di membrana, come non è solo il mezzo per misurare le proprietà meccaniche fondamentali della membrana, ma aiuta a far luce sull'accoppiamento tra membrana e proteine curvatura. Come discusso nell'introduzione, esistono altre tecniche per misurare gli effetti delle proteine di membrana-curvatura, o incubando le proteine con liposomi di sub-micron legati a una superficie passivata18,19 , o osservando la formazione spontanea di tubuli in GUV micropipetta-aspirato dopo l'iniezione di una proteina20,21. Il metodo qui descritto fornisce connessione diretta geometrico per endocitosi ed è unico nel fornire le misurazioni fisiche importanti del sistema allo stesso tempo, come densità di proteine, tensione nelle membrane e forza di membrana.
Una limitazione importante del metodo è che non è banale per costruire e calibrare tutti i componenti coinvolti nell'analisi. Tuttavia, mentre una combinazione di microscopia confocale, pinzette ottiche e micromanipolazione fornisce informazioni di massimale, alcuni componenti possono essere sostituiti come descritto nell'introduzione, a seconda delle informazioni che deve essere imparato a conoscere il sistema. I componenti minimi necessari per sonda con successo l'accoppiamento di curvatura di una proteina, o qualsiasi altre potenziale accoppiati a curvatura della molecola, sono un aspiratore micropipetta e un microscopio confocale, con la pinzetta ottica essere superflua. Soprattutto, molte delle calibrazioni (ad esempio la calibrazione per raggio del tubo della membrana e per determinare la densità di superficie di proteina) sono in genere solo necessari essere eseguita una sola volta. Un'altra limitazione del metodo è che si può misurare solo un capo alla volta, pari a due-tre GUV ogni ora (con la pratica); Tuttavia ogni misurazione fornisce una ricchezza dei dati.
Per misurazioni di velocità effettiva più elevata o se è essenziale per studiare l'interazione delle proteine con geometrie sferiche e non tubolare, altri saggi dovrà essere esplorato o sviluppato. Gli sforzi futuri saranno dedicati a: (1) progettazione di un sistema di throughput più elevato in cui tubi multipli (da multiple GUV) potrebbero essere tirati e misurati allo stesso tempo e (2) l'integrazione di microscopia di Super-risoluzione così per studiare i dettagli dell'impalcatura della proteina che forma i nanotubi.

Molti processi cellulari, come endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, infezione, ecc., sono accompagnati da un drammatico cambiamento nella forma di membrane cellulari1,2. Nella cella, un numero di proteine partecipa a questi processi legandosi alla membrana e alterare la loro forma. Gli esempi più notevoli sono membri della famiglia di proteine Bin/anfifisina/Rvs (BAR), contenente una caratteristica intrinsecamente curvata BAR dominio3,4,5,6,7. In genere, essi interagiscono con la membrana aderendo il dominio di BAR alla superficie e, in molti casi, anche superficialmente inserimento eliche amphipathic in doppio strato. La forma, la dimensione e la carica del dominio BAR insieme al numero delle eliche amphipathic determina: (1) la direzione della curvatura della membrana (cioè, se inducono i invaginations o sporgenze) e (2) l'entità della membrana curvatura5,8. Di nota, qui curvatura positiva è definito come il lato convesso della membrana curvilinea, vale a dire, il rigonfiamento verso la particella interagente e negativa altrimenti. Inoltre, gli studi quantitativi di BAR proteine ha rivelato che il loro effetto sulla membrana dipende un set di parametri fisici: densità di proteine, tensione nelle membrane e forma di membrana (piatto contro tubolare contro sferica di superficie forma)7. In base a questi parametri BAR proteine può: (1) fungono da sensori di curvatura della membrana, (2) piegare membrane o (3) indurre membrana scissione7.
Dovuto il numero di componenti coinvolti nella membrana rimodellamento nella cella, studiando gli aspetti quantitativi dei fenomeni, quali endocitosi, in vivo è estremamente impegnativo. In vitro la ricostituzione del numero minimo di componenti che imita curve membrane nella cella fornisce mezzi per acquisire una comprensione meccanicistica di proteine di membrana-curvatura come operare. Questo articolo descrive un protocollo per ricostituire una membrana nanotubi in vitro mediante micromanipolazione, microscopia confocale e pinzette ottiche. L'approccio può essere utilizzato per studiare in modo quantitativo, come proteine, lipidi o piccole molecole interagiscono con le membrane curve. GUV del lipido sono utilizzati come modelli di una membrana cellulare, cui curvatura è trascurabile rispetto alle dimensioni delle molecole interagenti curvatura a membrana. Essi sono preparati utilizzando il metodo di electroformation9 in cui le vescicole sono formate da idratante un film lipidico e gonfiore in GUV sotto una corrente alternata (AC)10. Sono più comuni substrati su cui sono coltivati GUV o semi-conduttori piatti ricoperti di ossido della latta dell'indio (ITO) o fili di platino (Pt-fili)11. In questo lavoro, GUV sono coltivate su Pt-fili come questo metodo ha dimostrato di funzionare molto meglio rispetto all'alternativa nel rendere GUV in presenza di sali nei buffer12. Anche se il protocollo di electroformation è qui descritto in dettaglio sufficiente per riprodurlo, rimandiamo il lettore ad articoli precedenti in cui simili e altri metodi di fare GUV sono stati descritti in dettaglio13,14. Nelle nostre mani, electroformation il Pt-fili ha correttamente dato GUV da un mix di lipidi sintetici o da lipidiche naturali estratti in un tampone contenente ~ 100 mM NaCl. Inoltre, era anche possibile incapsulare GUV contiene proteine durante la crescita. Una camera di electroformation esempio è mostrata in Figura 1A; si compone di due ~ 10 cm-lunghezza Pt-fili inserite in un supporto effettuato in politetrafluoroetilene (PTFE) che può essere sigillato su entrambi i lati con lamelle di vetro ~ 1-2 cm di distanza (Figura 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Figura 1: messa a punto sperimentale. (A) il GUV electroformation camera con connettori elettrici collegati ai fili di Pt. Sinistra (B): il sistema sperimentale mostrando il microscopio, la camera sperimentale sopra l'obiettivo e due Micropipette (sinistra e destra) associati ad i micromanipolatori e inseriti nella camera sperimentale per tubo tirando e proteina iniezione. A destra: una vista ravvicinata della camera sperimentale montato sopra l'obiettivo mostrando le punte di aspirazione e le micropipette di iniezione inserite. (C) A siringa dotata di un erogatore sottile inserito in una micropipetta a suo back-end. Il fondo è una vista ravvicinata del dispenser all'interno la micropipetta con la linea tratteggiata blu che delinea la micropipetta. Questo sistema è utilizzato per riempire la micropipetta con caseina per passivare la superficie di vetro e anche per eseguire il riempimento con olio minerale quando necessario. (D) A sistema utilizzato per aspirare quantità µ l della soluzione della proteina. L'ago è collegato ad una siringa e al tubo che è collegato alla micropipetta di iniezione. La punta della micropipetta è accuratamente immerso nella soluzione della proteina e aspirata così per riempire la punta della micropipetta. La micropipetta indietro viene poi riempita con olio minerale, utilizzando il sistema mostrato nel pannello di C. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Un nanotubo di membrana, che vanno nel raggio da 7 a diverse centinaia nm, può essere tirato da un capo da una forza esterna. Questo metodo è stato inizialmente progettato per misurare le proprietà elastiche delle membrane cellulari e vescicole, ad esempio il piegamento rigidità15,16. Nelle opere più recenti, il metodo è stato esteso per studiare l'interazione delle proteine con membrane curve di microinjecting le proteine vicino il nanotubo tirato7,17. Altri metodi sono stati sviluppati per lo studio delle proteine di membrana-curvatura. In un unico metodo, proteine vengono incubate con diverse dimensioni liposomi legati ad una superficie passivata. La microscopia confocale è utilizzata per misurare il legame con le proteine in funzione del diametro di liposomi, che può indicare indotta da curvatura ordinamento18,19. In un altro metodo, proteine vengono iniettate nei pressi di un micro-aspirato GUV per misurare la loro capacità di indurre spontaneamente tubuli20,21. Il metodo descritto in questo protocollo è in grado di studiare la curvatura a membrana proteine coinvolte nell'endocitosi, dove la maggior parte delle proteine in genere incontrano nanotubi di membrana preformata collegando l'invaginazione della membrana contenenti merci con il fondo piatto della membrana plasmatica. Inoltre, in questo metodo, a differenza nell'analisi con liposomi piccoli tethered, i nanotubi di membrana sono continuamente collegato alla membrana; Pertanto, è in equilibrio meccanico con il capo, una situazione previsto in vivo. Quindi, fisica fondamentale della membrana si applica e si può dedurre una pletora di proprietà meccaniche da nostre misure22,23,24.
Per una piena attuazione di questo metodo, l'attrezzatura comprende un microscopio confocale, pinzette ottiche e uno o due Micropipette collegate ad un serbatoio di acqua (Figura 1B). Combinando tutti e tre, è possibile misurare la tensione della membrana, membrana della curvatura, densità di superficie delle proteine, e contemporaneamente forza25del tubo. Micropipetta aspirazione è essenziale e facilmente è costruito mediante l'inserimento di una micropipetta di vetro in un supporto collegato ad un serbatoio di acqua, che, tramite pressione idrostatica, controlla la pressione di aspirazione26. La micropipetta e il titolare sono controllati da un micromanipolatore e, idealmente, in una direzione da un attuatore piezoelettrico per il movimento di precisione. Per tirare un nanotubo, la microaspirated GUV brevemente è attaccato ad una perlina micron imprese poi tirata via creando un nanotubo. In questa implementazione, il tallone è detenuto da Pinzetta ottica, che può essere costruita seguendo un protocollo pubblicato27. È possibile fare a meno delle pinzette ottiche e nanotubi di tirare in modi diversi, anche se a costo di misure di forza accurata. Se è troppo difficile da costruire un'ottica trap o se misure di forza sono non essenziali, come se uno vuole semplicemente verificare la preferenza delle proteine per membrane curve, un tubo può essere estratto utilizzando una perlina aspirata all'estremità di una micropipetta secondo28. È anche possibile tirare tubi mediante forza gravitazionale29 o30,31di flusso. Inoltre, la microscopia confocale è non è essenziale; Tuttavia, si è preferito così per misurare la densità di superficie delle proteine. Permette inoltre di misurare il raggio di nanotubi da intensità di fluorescenza dei lipidi nel tubo, così indipendentemente dalla forza della membrana e la tensione. Raggio del tubo deduzione da fluorescenza è particolarmente importante se il rapporto tra queste quantità si discosta dalle equazioni ben consolidate a causa della presenza di proteine di membrana-aderito25. Cosa importante, uno non può erogare della trappola ottica e microscopia confocale, poichè non è possibile misurare la curvatura del tubo.
Il metodo descritto in questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'ordinamento di curvatura-indotta di varie proteine di membrana periferici su nanotubi, soprattutto quelli dalla famiglia25,BAR32,33,34 . Inoltre è stato indicato che il canale del potassio del transmembrane conicamente sagomato che KvAP si arricchisce il curvo nanotubi nello stesso modo come BAR proteine35. Grazie all'ottimizzazione del metodo per incapsulare GUV contiene proteine, l'interazione delle proteine con curvatura negativa è stato recentemente studiato come ben36. Inoltre, questo metodo è stato usato per delucidare la formazione di proteina scaffold25,37 e per studiare il meccanismo di scissione di membrana da entrambi linea tensione38, proteina dinamina39, o da BAR proteine40,41. Oltre alle proteine, piccole molecole o ioni possono anche indurre la curvatura. Utilizzando questo metodo, gli ioni di calcio sono stati indicati per indurre la curvatura positiva sotto condizioni senza sale42. Interessante, ha anche dimostrato che i lipidi possono subire curvatura differenziata, anche se solo per le composizioni che sono vicino a un demixing punto43,44. In sintesi, il metodo può essere utilizzato dai ricercatori interessati a indagare come entrambi componenti integrali di membrana (ad es., lipidi o proteine transmembrana) o marginalmente associazione molecole (sia all'interno o all'esterno di GUV) interagire con membrane cilindricamente curve, dal punto di vista meccanico e quantitativa. Inoltre è inteso per coloro che sono interessati a misurare le proprietà meccaniche della membrana stessa22,23,45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td>Example lipid used in data for Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880129</td>
			<td>biotinylated lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td>D7540</td>
			<td>fluorescent lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent lipid for protein density calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg L-&#945;-phosphatidylcholine (eggPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051</td>
			<td>used for calibrating the tube radius constant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-casein from bovine milk (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmometer</td>
			<td>Loser</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td>
			<td>Goodfellow USA</td>
			<td>PT005139</td>
			<td>used for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to create current for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putty sealant</td>
			<td>Vitrex (from CML France)</td>
			<td>CRIT 140013</td>
			<td>used to seal the electroformation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&#955; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&#955; &#62; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezoelectric actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &#181;m)</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-30-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

Il rimodellamento della membrana cellulare è parte integrante di molti fenomeni cellulari, come ad esempio endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, ecc. Molte proteine diverse associano con membrane curve a causa della loro capacità di percepire o indurre la curvatura della membrana. In genere, questi processi comportano una moltitudine di proteine che li rende troppo complessa per studiare quantitativamente nella cella. Descriviamo un protocollo per ricostituire una membrana curvilinea in vitro, che imita una struttura cellulare curva, come il collo di endocitosi. Delle vescicole unilamellari gigante (GUV) viene utilizzata come modello di una membrana cellulare, in cui pressione interna e la tensione superficiale sono controllato con l'aspirazione di una micropipetta. L'applicazione di una forza di trazione di punto su GUV utilizzando pinzette ottiche crea un nanotubo ad alta curvatura collegato ad una membrana piatta. Questo metodo è stato utilizzato tradizionalmente per misurare le proprietà meccaniche fondamentali delle membrane lipidiche, quali rigidità di piegamento. Negli ultimi anni, esso è stato ampliato per studiare come le proteine interagiscono con curvatura della membrana e il modo che interessano la forma e la meccanica delle membrane. Un sistema che unisce la micromanipolazione, microiniezione, Pinzetta ottica e microscopia confocale permette la misura della curvatura della membrana, tensione nelle membrane e la densità di superficie delle proteine, contemporaneamente. Da queste misurazioni, si può dedurre molte importanti proprietà meccaniche e morfologiche del sistema proteina-membrana. Inoltre, abbiamo stendere un protocollo di creazione GUV in presenza di concentrazione salina fisiologica e un metodo per quantificare la densità superficiale delle proteine sulla membrana da intensità di fluorescenza di etichettato proteine e lipidi.

L'esperimento di tubo-tirando può dare informazioni vitali meccaniche su membrana. In assenza di proteine o altre molecole che forza la coppia con curvatura della membrana, la membrana e raggio del tubo può essere correlato con tensione nelle membrane applicando l'Hamiltoniana di carnevali-Helfrich equazione ad un tubo tirato da un GUV50,51 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg">(Equazione 1)
dove <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq4v3.jpg"> è la membrana energia libera del tubo, membrana K piegatura rigidità, r e R0 sono, rispettivamente, la media e lo spontanei raggi di curvatura, la tensione nelle membrane σ, all'area del tubo, L la lunghezza del tubo e f il punto di forza esercitata dal tubo sul tallone. All'equilibrio, r è il raggio del tubo, denotato come R, e f diventa la forza di tubo-ritrazione, F, vale a dire, la forza di equilibrio di cui il tubo è tirando il tallone nella trappola ottica. Per calcolare F e R, minimizziamo <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq4v3.jpg"> per quanto riguarda L e r, producendo22,23
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq5v4.jpg">(Equazione 2)
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq6v5.jpg">(Equazione 3)
R 0 è trascurato se entrambi gli opuscoli della membrana hanno la stessa composizione, anche se è speculato che altri fattori, come carica repulsioni possono indurre alcuni di curvatura spontanea42. Misure di forza e raggio in tubi tirati da 100% DOPC GUV sono in eccellente accordo con predizioni teoriche in equazione 2 e 3 di equazione (Figura 4). Le due misure sono indipendenti come la forza è misurata dallo spostamento dei talloni la trappola ottica e il raggio dall'intensità di fluorescenza, fornendo quindi due modi di calcolare la membrana rigidità di piegamento. Raccordo 2 equazione ed equazione 3 per i rendimenti indicati dati: K = (25,1 ± 1.4) (media ± SD) kBT e (22,1 ± 1,5) kBT, rispettivamente, come precedentemente misurato42 .
Se sperimentando con curvatura-accoppiamento proteine, è suggerito di utilizzare più sofisticati equazione di Hamiltoniana di quella equazione 1, come equazione 1 rappresenta soltanto una curvatura spontanea efficace e non tiene conto per il effetto delle proteine della membrana proprietà meccaniche o interazioni proteina-proteina possibile. Vedi, per esempio,25,35,36,52,53. Sebbene i modelli teorici avanzati sono essenziali per una comprensione approfondita di un sistema di specifiche proteine-membrana, senza ricorrere a loro, è ancora possibile ottenere informazioni molto utili dal metodo tubo-tirando.
Ad esempio, per verificare se proteine senso di curvatura, l'intensità relativa delle proteine sul tubo è misurato rispetto al capo, che è considerato piatto. L'interazione con curvatura positiva è studiato iniettando le proteine vicino il tubo con la micropipetta secondo25. L'interazione con curvatura negativa o il comportamento delle proteine transmembrana è studiato da incapsulamento o ricostituire le proteine durante GUV formazione35,36. Il relativo arricchimento della barra e proteine KvAP su tubi di membrana sopra il GUV sottostante indica che essi preferiscono curve membrane (Figura 5). Per essere più quantitativa, questo arricchimento può essere calcolato come un coefficiente di ordinamento, S, secondo:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq7v4.jpg">(Equazione 4)
dove hoprot, idromassaggio e hoprot, GUV sono rispettivamente le intensità di fluorescenza di proteine sul tubo e sul capo, e hoillabbro, idromassaggio e holabbro, GUV sono le intensità di fluorescenza di lipidi sul tubo e sul capo, rispettivamente.
Un altro esempio sta misurando la forza di tubo come la proteina si lega alla membrana. Figura 5B, C Mostra che un endophilin di proteina N-BAR che a2 riduce gradualmente la forza di tubo, diminuendolo a zero, che indica che si è formata una struttura tridimensionale che mantiene il tubo stabile, che è definita un ponteggio. Tali strutture svolgono i ruoli importanti nell'endocitosi, fissando il raggio del tubo, ma anche nel rendere possibile scissione7,41. Misurazione di S, così come gli effetti meccanici e morfologici che impongono di proteine sulle membrane fornisce importanti intuizioni come operano nei fenomeni della membrana-flessione nella cella.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig4.jpg"> Figura 4: risultati rappresentativi di misure meccaniche in assenza delle proteine. Visualizzati sono forza linearizzato e tubo raggio dipendenza sulla tensione di membrana per una membrana DOPC 100%, da tre misurazioni indipendenti, pubblicati precedentemente42. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56086/56086fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig5.jpg"> Figura 5: risultati rappresentativi della formazione di rilevamento e impalcatura di curvatura da BAR proteine. Curvatura (A) di rilevamento dalla proteina BAR IRSp53. La proteina senses curvatura negativa della membrana ed è associata all'interno del capo, con trascurabile quantità di proteine presenti sull'opuscolo di membrana esterna. Barra della scala = 5 µm. ristampato da36, termini della licenza Creative Commons CC-BY, Copyright 2015, Nature Publishing Group. (B) la creazione di un'impalcatura di proteine tramite il endophilin di proteina N-BAR. Le proteine sono iniettate in prossimità del tubo e sono pertanto tenute sull'opuscolo della membrana esterna. Come descritto in37, endophilin lega alla base del tubo e forma un ponteggio che cresce continuamente lungo il tubo da GUV verso la trappola ottica (OT, cerchio bianco). (C) A kymogram di endophilin crescita patibolo il GUV-il tallone, con i canali del lipido e della proteina sovrapposti. Il grafico mostra il tubo forza, F, come funzione del tempo, t. Le scale cronologiche nella kymogram e la trama sono le stesse (x-axis è condivisa). In B e C, scala bar = 2 µm. ristampato con il permesso di riferimento37, Copyright (2016) Accademia nazionale delle scienze. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56086/56086fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

pulling-membrane-nanotubes-from-giant-unilamellar-vesicles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  PSL Research University, CNRS UMR168. Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Video: Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Ricerca

Biologia

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Esaminando BCL-2 Funzione Famiglia con grandi vescicole unilamellari

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...