Wir danken Dr. Harold Dvorak für hilfreiche Diskussionen einschließlich der Vorschlag, Fixierung in 37 ° C PFA versuchen. Diese Arbeit wurde vom NIH P01 CA92644 und durch einen Vertrag von der Nationalen Stiftung für Krebsforschung unterstützt.

1. Zellkultur auf Collagen Beschichtete Glasplatten <ol><li> Platz Glasplatten (12 mm Durchmesser) in einem Glas (4 oz) und Autoklav, um die Scheiben zu sterilisieren. </li><li> Setzen Sie 25 ml 70% Ethanol in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und legen Sie sie in einer Zellkultur Kapuze. Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden, bis der Pegel der Lösung auf 20 ml sinkt. </li><li> Legen Sie ein scharfe Zange mit einer extra feinen Spitze in der 70% Ethanol für 5 Minuten, bevor Sie es auf die Glasscheibe zu behandeln. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Zange aus dem Rohr, und schließen Sie den Deckel, dann vorsichtig platzieren Sie die Ethanol behandelt Zange auf dem Rohr an der Luft trocknen für 2 min. Lassen Sie die Spitze der Zange, um alles in der Haube berühren. </li><li> Mit den sterilen Pinzette einem sterilen Glasplatte aus dem Glas zu greifen und es in eine Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte. Wiederholen, bis die gewünschte Anzahl von Vertiefungen hat, mit Scheiben besiedelt. </li><li> Geben Sie 500 ul Rinderkollagenlösung (50 ng / ml) in jede Vertiefung, die eine Glasplatte enthält und es in einem 37 ° C, 5% CO 2 Zellkulturbrutschrank für mindestens 30 min. Es schadet nicht, in einer längeren Inkubationszeit. </li><li> Ernte HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) oder PC3 (Prostata-Tumorzellen), die bereits in 150 mm-Zellkulturplatte durch Trypsinierung angebaut wurden, und blockieren die Trypsin-Aktivität mit seiner kompletten Kulturmedium. Sammeln Sie Zellen in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Zählen Sie die Anzahl von Zellen und sicherzustellen, dass die Überlebensfähigkeit von mehr als 90% ist. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Verwenden des Kulturmediums, um die Zellen zu 10 5 Zellen / ml zu verdünnen. Zeigen Zellen auf Eis. </li><li> Absaugen Kollagen in Zellkulturhaube und sanft Ort 500 ul Zellsuspension zu jeder Vertiefung, in der Glasscheiben wurden mit Kollagen vorbeschichtet ist. 5 x 10 4 Zellen / Well in 24-Well-Platte geben wird, 60% confluency für HUVEC und 30% Konfluenz für PC3-Zellen. Hinweis: fügen Sie mehr Zellsuspension für höhere Zelldichte. </li><li> Kultur die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 1 h, 2 h, 4 h, 6 h oder 24 h bis nanopodia Aktivitäten und Zellpassage zu verfolgen. Typischerweise werden die Zellen auf die Glasscheibe in der ersten 30 Minuten anzubringen, dann anfangen zu polarisieren und wandern in der ersten Stunde, und durchzuführen, die interzelluläre Wechselwirkungen und die Zellteilung in den folgenden Stunden. </li></ol> 2. Zellfixierung <ol><li> Jedes der gut brauchen 500 ul 4% PFA (Paraformaldehyd), um die Zellen zu fixieren. Entweder kommerziell hergestellt oder frisch zubereiteten 4% PFA verwendet werden. Berechnen der Menge des PFA bezogen auf die Anzahl von Vertiefungen hergestellt benötigt, und legen PFA in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen. ACHTUNG: Para steht im Verdacht, krebserregend. </li><li> Setzen Sie die Falcon-Röhrchen in einem Styropor-Stand, der bereits in einem 37 ° C-Inkubator war. Lassen Sie das Rohr in den Brutschrank für 30 Minuten in den Kriegm die PFA bis 37 ° C </li><li> Legen Sie ein Heizkissen in der Kultur Haube und schalten Sie ihn ein. </li><li> Nehmen Sie die 24-Loch-Zellkulturplatte und den vorgewärmten PFA aus dem Inkubator und legen Sie es auf dem Heizkissen. </li><li> Mit einer Hand das Medium von einem gut absaugen, und sofort nach der mit der anderen Hand sanft gleiten PFA 500 ul in die gut durch die Wannenkante. Zur leichteren Absaugen, kippen Sie die Kulturplatte bei etwa 45 °, lehnte sie gegen die Styropor-Stand, so dass es in diesem Winkel stabil. Dadurch wird das Absaugen und Zugabe von PFA Lösung der gut ohne die Zellen in Kultur zu stören erleichtern. Dies ist der wichtigste Schritt die ursprüngliche Zellstruktur Zellaktivitäten zu erhalten. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Vertiefungen mit einer Glasscheibe haben PFA erhalten. Hinweis: Alle Schritte, die zu bereits bestehenden Lösung aus der auch ändern müssen, ist selbe Streben Verfahren anzuwenden. </li><li> Die Platte wird in 37 ° C für 5 min. </li&gt; <li> Nehmen Sie die Platte zurück in die Kultur Kapuze und kippen gegen Styropor, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Mit einer Hand sanft überweisen Sie den PFA aus dem Brunnen in ein Sammelrohr; mit der anderen Hand, um gleich darauf legen mindestens 500 ul PBS Raumtemperatur in den Brunnen. Nachdem alle Brunnen gewaschen wurden, zurück und wiederholen den PBS-Wasch noch einmal in jeden gut. Leeren Sie die gesammelten PFA in eine gefährliche Abfallbehälter. </li><li> Vorbereitung ICC Blockierungspuffer durch Zugabe von 2% fötalem Rinderserum zu PBS. 0,04% Natriumazid (von 20% Stammlösung verdünnt) als Konservierungsmittel zugesetzt. ACHTUNG: Natriumazid ist eine giftige Verbindung. Der Puffer kann in 4 ° C für eine lange Zeitdauer ohne bakterielle Kontamination gespeichert werden. </li><li> Mit der Kulturplatte noch vor einem Stand durch jeden gut zu PBS Absaugen entfernen und sofort danach Zugabe von 500 ul von ICC-Blockierungspuffer gekippt, wieder Zyklus. Die Zellen sind nun bereit für Immunfluoreszenzfärbung. Falls erforderlich, diefixierten Zellen in einem 4 ° C Kühlraum für eine Woche ohne wesentlichen Verlust an Protein TM4SF1 gespeichert werden. </li></ol> 3. TM4SF1 Immunfluoreszenz-Färbung von Nanopodia <ol><li> In jede Vertiefung, ersetzen Sie das ICC 500 ul Blockierungspuffer mit einem neuen Blockierungspuffer mit 0,01% Triton X-100 und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 1 Stunde sitzen. Verwenden Sie nicht mehr als 0,03% Triton X-100, wie es TM4SF1 aus Zellmembranen zu entfernen. PBS gewaschenen Zellen aus Schritt 2.10 kann direkt auf die Blockierungspuffer Triton bewegt werden, wenn die Färbung bereit, sofort gestartet werden. </li><li> Verdünnte Primäranti TM4SF1 (oder Anti-CD9) Antikörper bis 0,5 ug / ml in Blockierungspuffer ICC. </li><li> In jede Vertiefung, entfernen Sie die ICC/0.01% Triton-Puffer und ersetzen Sie es mit 300 ul der Anti-TM4SF1-Antikörperlösung. Inkubation 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht verlassen bei 4 ° C </li><li> Waschen Sie jede Vertiefung mit nicht weniger als 500 ul PBS. 3x wiederholen; jedes Mal geben bei least 5 min Inkubationszeit. </li><li> Vorbereitung eines sekundären Antikörpers und Phalloidin-Lösung in ICC Blockierungspuffer unter Verwendung einer 1000-fachen Verdünnung von Alexa 488 markierten Esel-anti-Maus-Sekundär-Antikörper (2 &amp;mgr; g / ml Endkonzentration) und 1000 x Verdünnung Phalloidin (50 ng / ml Endkonzentration). </li><li> Entfernen PBS und 300 ul des sekundären Antikörpers und Phalloidin Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 2 Stunden oder lassen Sie es über Nacht bei 4 ° C </li><li> Wiederholen PBS Waschschritten mit mindestens 5 min Inkubation pro Waschgang. In der letzten Waschung, lassen jede Vertiefung in PBS für 1 Stunde. </li><li> Werfen Sie einen einzigen Tropfen (~ 10 ul) von Anti-Fade-Montagetechnik auf einem Glasträger. </li><li> Biegen Sie die Spitze einer 19 G 1 ½ Spritzennadel in 90 °, indem Sie sanft auf eine harte Oberfläche. Mit einer Hand gebogenen Nadel zu halten und heben eine Glasscheibe aus dem Brunnen, und mit der anderen Hand, um die Scheibe zu erfassen mit den scharfen Pinzette. </li><li> Drehen Sie die Glasscheibe &amp;# 160; Gesicht nach unten lassen die Seitenkontaktzelle die Montagetechnik auf dem Objektträger. Legen Sie vorsichtig die Glasscheibe und lassen Sie es über Nacht trocknen an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur. </li><li> Fahren Sie mit dem Bild Immunfluoreszenz gefärbt nanopodia oder die Folien in einer Dia-Box bei -20 ° C Die Bilder werden sichtbar für ein paar Monate in -20 ° C bleiben </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis.">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li><li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4SF1:+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration.">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li><li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Nanopodia sind dünne Zellmembran Kanäle, die fest an, um durch TMED Matrix und kann mehr als 100 um aus einer mobilen Zelle polarisiert, um die Umwelt zu erfassen und zu vermitteln interzellulären Wechselwirkungen 2,3 verlängern. Nanopodia haften so fest, dass die Rückstände hinter wie die Zelle bewegt sich nach links Matrix (Abbildungen 1 und 2). Nanopodia damit es uns ermöglichen, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt spüren und bestimmen den Weg der Zellbewegung, und wie Genexpression oder medikamentöse Behandlung Änderungen Bewegung. Aufgrund der Zerbrechlichkeit dieser dünne (100-300 um Breite) Membranstrukturen, ist Vorsicht jedoch, um sie zu bewahren genommen werden. Um treu Zellaktivitäten aufnehmen, ohne zu stören nanopodia, und zu untersuchen, wie Versuchsbedingungen beeinflussen nanopodia Aktivitäten und den Weg der Zellbewegung, sollte man zuerst überprüfen, ob Zellen effektiv wachsen in Vollmedium vor pursuing das Experiment. Normale gesunde primären Endothelzellen, wie HUVEC, in frischem EGM2-MV komplette Kulturmedium wird in der Regel etwa während ihrer logarithmischen Wachstumsphase teilen alle 18 Stunden innerhalb von sechs Passagen ihrer Kultur. Man sollte die Verwendung von HUVEC, die größer als Passage-6 die höheren Zahlen Durchgang zu einer erhöhten Zahl von seneszenten oder zweikernigen Zellen in Kultur 7 führen und Zellen die Fähigkeit zu polarisieren und produzieren nanopodia 2 beeinflussen zu vermeiden. PC3 Prostata-Tumorzellen sind stabiler Kulturen (unveröffentlichte Beobachtung), aber man sollte immer noch die Verwendung von Zellen über zehn Passagen aus der Entfernung aus dem gefrorenen Zustand zu vermeiden. Gesunde adhärenten Zellen werden in der Regel zu befestigen, um Kollagen-beschichteten Scheiben innerhalb der ersten 30 Minuten, nachdem sie ausgesät werden, folgten bald danach durch Zellpolarisation. Somit sollte man erwarten, dass die meisten Endothelzellen in einem polarisierten Zustand am Ende der ersten Stunde der Inkubation sehen. Wenn eineMehrheit der Endothel-Zellen nicht auf der Glasoberfläche zu befestigen, dann überprüfen Sie, ob (a)-Kollagen hat sein Verfallsdatum überschritten, (b) Trypsinierung während der Zellernte war zu streng, oder (c) Zellen, die ungesund sind. PC3 Zellen polarisieren langsamer als Endothelzellen, sondern einen polarisierten Morphologie innerhalb von 2 h nach dem Aussäen demonstrieren. Wenn Verunreinigungen in der Kultur auftritt, dann prüfen, ob Glasplatten oder Zange ordnungsgemäß sterilisiert wurden. Alternativ kann man prüfen, mit Kammer-Objektträgern; Das hier beschriebene Protokoll schlägt die Verwendung von Glasplatten in 24-Well-Kulturplatten, um Kosten zu sparen und um mehr problemlos eine große Anzahl von Proben. Herkömmliche Methoden Immunfärbung, die Verwendung von PBS, um Zellen zu waschen, bevor Raumtemperatur Fixiermittel, leicht stören feinen Zellstrukturen wie nanopodia und wird sie während der Färbung zu zerstören. Dies ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass körperliche Belastungen wie Temperaturschwankungen während der Zell fixatioder strengen PBS Waschen während der Färbung sind die wichtigsten Ursachen der Fragmentierung oder Entfernung von nanopodial Strukturen. Mit drei einfachen methodischen Änderungen - (i) nicht Zelle Polarisationszustand stören durch Waschen mit PBS vor der Fixierung, (ii) zu fixieren Zellen direkt in 37 ° C vorgewärmt und Inkubation PFA-Zellen bei 37 ° C während der Fixierung, und (ii) vorsichtig waschen Zellen in PBS Raumtemperatur - nanopodia sind weitgehend erhalten Abbildung 1 zeigt, wie PFA und PBS Temperaturen beeinflussen Erhaltung nanopodia in kultivierten Endothelzellen; 2A zeigt, dass TM4SF1 Ausdruck ist heterogen in PC3-Zellen und Zellen mit der stärksten TM4SF1 Färbung zeigt die längste. nanopodia. Temperatur ist bekannt, dass F-Actin-Aktivitäten und Tubulin 8,9 Integrität beeinflussen. Somit Fixierung von Zellen bei der gleichen Temperatur in dem Zellen gezüchtet wurden (dies ist 37 ° C in dem hier beschriebenen Protokoll) ist wahrscheinlich die polarisierten Zellzustand besser zu bewahren ( <sTrong&gt; Fig. 1A und 1B) und die interzellulären Verbindungen (Fig. 1C), wodurch treuer Aufzeichnungszellaktivitäten zu der Zeit, wenn die Zellen für experimentelle Untersuchungen entnommen. Anders als auf der Rückzugs Seite sind nanopodia Vorsprünge an Vorderfront der Zelle von kurzer Dauer, zum Teil, weil die Zellen sind ständig in Bewegung und überrollt Vorderkante nanopodia wie sie vorwärts 2,3 bewegen. So ist die beste Zeit, um nanopodia an der Vorderfront zu beobachten, ist nicht lange nach Zellen überzogen, idealerweise bei etwa 30 bis 60 Minuten nach der Aussaat, eine Zeit, in Zellen angebracht zu Matrix und sind erst am Anfang, um eine Bewegung zu initiieren. Live-Cell-Imaging ist ein alternativer Ansatz, der eine genaue Aufzeichnung der nanopodia Aktivitäten an der Vorderfront ermöglicht. PFA ist nicht das einzige Reagens Fixierung verwendet; organische Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol und Aceton werden ebenfalls häufig in Zellfixierung für die Immunfärbung 10 verwendet.Die beste Fixierungs wird oft durch die Lage Epitop eines spezifischen Antikörpers in der Färbung (unveröffentlichte Daten) bestimmt. Für die Maus-Anti-Human-Antikörper, der TM4SF1 extrazellulären Domänen des TM4SF1 (Millipore, die in dieser Studie verwendet wird) erkennt, ist die einzige PFA Fixativ die TMED Immunfärbung zeigt, was anzeigt, daß andere organische Lösungsmittel, die das Epitop zerstören. Im Gegensatz dazu arbeitet Kaninchen-Anti-Human-TM4SF1 polyklonalen Antikörpers aus Acris (Daten nicht gezeigt), dessen Epitop in achtzehn Aminosäuren nahe dem N-terminalen Bereich befindet, auch mit Ethanol fixierten Zellen. Allerdings ist die Acris Antikörper keine guten TM4SF1 Färbung, wahrscheinlich, weil die N-terminale Epitop durch TM4SF1 Interaktionen mit cytosolischen Molekül (en), die teilweise das Epitop decken beschäftigt. Triton X-100 ist ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel und wird häufig in der Immunfärbung mit dem Ziel der Permeabilisierung der Zellmembran und die Verringerung der Oberflächenspannung von wässrigen Lösungen verwendet 11,12. However, bringt diese Fähigkeit auch das Risiko der Solubilisierung von Membranproteinen. TM4SF1 vollständig von der Zelloberfläche durch Triton X-100-Konzentrationen von mehr als 0,05% 2,3 entfernt. Aus diesem Grund wird nur eine 1-Stunden-Behandlung mit 0,01% Triton X-100 vor der Zugabe des primären Antikörpers in dem hier beschriebenen Verfahren verwendet. Diese Behandlung permeabilisiert die Membran genug, um peri-Kern TM4SF1 ermöglichen, auch durch die Antikörper beurteilt werden, unter Wahrung meisten TM4SF1 auf der Zellmembran. Für Doppelfärbung von TM4SF1 mit Proteinen im Zellkern befindet, verwenden Sie 0,03% Triton X-100 in der Vorinkubation der Bühne, wenn 0,01% Triton funktioniert nicht. Dies wird Triton X-100 Stechen der Kernmembran zu erleichtern. TM4SF1 ist sehr spezifisch für Endothelzellen und Tumorzellen; die meisten anderen Zelltypen entweder nicht äußern TM4SF1 oder Express auf einem sehr niedrigen Niveau 2,3. Allerdings klassischen Tetraspaninen - eine Familie, die dreiunddreißig Mitglieder umfasst including CD9, CD81 und CD151 - ubiquitär exprimiert 6, und kann auch in Membrandomänen in nanopodia 2,3 (3A) gefunden werden. So Färbung klassischen Tetraspaninen durch die für TM4SF1 verwendet dieselbe Immunfärbung Methode kann die Studien nanopodia in Zelltypen, die nicht TM4SF1 exprimieren können. PC3 Tumorzellen, die TM4SF1 auszudrücken hoch neigen dazu, ständig in eine Richtung bewegen, während PC3-Zellen, die schwach auszudrücken TM4SF1 nicht eine klar definierte Bewegungsrichtung (2A und unveröffentlichte Daten) haben. TM4SF1 Expressionsniveau in Tumorzellen ist bekannt, mit ihren 13 metastatischen Potential korreliert werden, und Untersuchungen sind derzeit im Gange Verknüpfung Tumorzellen die Fähigkeit zu TM4SF1 exprimieren und nanopodia ihre metastatische Potential. Zusammenfassend Beherrschung der effektivsten Methoden zur Färbung nanopodia ermöglicht Ermittler, den Weg der Zellbewegung durch nanopodia Wieder verfolgensidues, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt wahr für Bewegung, wie Zellbewegung wird durch Veränderung der Expression von Genen (entweder Überexpression oder Knockdown von Genen von Interesse) modifiziert. Nanopodia stellen ein neues Werkzeug für die Untersuchung der Zellpolarisation und Zellbewegung.

Während Polarisation für Bewegung, Tierzellen erstrecken sich über eine Vielzahl von dynamischen, Membran Vorsprünge von ihren Oberflächen, einschließlich Filopodien, Lamellipodien, Rückzug Fasern und Rüschen ein. Kürzlich zu dieser Liste hinzugefügt nanopodia eine neu erkannte Art von dünnen (100-300 um Durchmesser), längliche (bis zu 50-100 um lang) Membran Projektion, die Membrankanäle für die Erweiterung der F-Aktin Strukturen wie Filopodien stellen waren und Zurückziehen Faser, und das Flecken positiv mit TM4SF1 (Transmembran-4-L-sechs-Familie-1) in kultivierten Endothelzellen und Tumorzellen 2,3. TM4SF1 ist ein Protein mit tetraspanin artige Topologie, das ursprünglich als ein Tumorzellantigen 4 vor der Entdeckung, dass das Molekül ein Endothelzellen-Biomarker, die eine wesentliche Rolle bei der Endothelzellenproliferation und-migration 2,3 spielt bekannt war. Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass TM4SF1 wird lokalisiert, um perinucLear Vesikel mit der Plasmamembran und in TM 4SF1 e nriched Mikro d omains (TMED) angereichert. TMED Anker nanopodia zu Matrix und in regelmäßigen Abständen von 1-3 gebändert Muster TMED / um Länge nanopodia vorhanden. Nanopodia erstrecken sich typischerweise von führenden vor einer Zelle und Nachlauf während der Zellpolarisation für Bewegung. Aufgrund der Natur der Firma haft TMED sind nanopodia nicht wieder in die Zelle zurückziehen, wie es sich bewegt; aufgegeben nanopodia Rückstände so verfolgen den Weg der Zellbewegung. Nanopodia Membrankanäle für die F-Aktin-und Ausfahren zu schaffen, und sind Websites der interzellulären Interaktion und Kommunikation 2,3. Diese Eigenschaften bedeuten, dass nanopodia eine einzigartige Gelegenheit, um die Mechanismen F-Actin-Montage während der Zellpolarisation, Zellerkundung der Umwelt, die Bestimmung der Weg und die Richtung der Zellbewegung und interzellulären Interaktionen zugrunde liegenden Studie liefern einnd-Kommunikation. Aufgrund der stark hydrophoben Natur TMED und der dünnen und zerbrechlichen Natur des häutigen nanopodia, braucht besondere Pflege, um TMED und nanopodia bewahren genommen werden. Die Zerstörung und Entfernung von nanopodia TMED durch gemeinsame Labormethoden ist ein möglicher Grund, warum nur dreiundsechzig Publikationen auf TM4SF1 seit seiner ersten Entdeckung im Jahr 1986 ein und für den kompletten Mangel an Wissen über TM4SF1 Bereicherung in 100-300 um auf Mikrodomänen erschienen der Zelloberfläche, bis der Bericht der TM4SF1 in Endothelzellen in 2009 2. Konventionelle Methoden verwenden Immunfärbung häufig organische Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol oder Aceton, um Zellen zu reparieren und zu verwenden 0,1% oder höher Triton X-100-Konzentration auf Zellen permeabilisieren 5. Hier beschriebenen Studien implementiert drei wichtige Änderungen der herkömmlichen Methode zu zeigen, TMED und nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA und fixieren Zellen in einer 3776, C-Inkubator, (ii) gelten sanfte Raumtemperatur PBS waschen, und (iii) weniger als 0,03% Triton X-100 nur kurz, um Zellen permeabilisieren vor der Zugabe des primären Antikörpers, wie Triton X-100 höher als 0,03% wird extrahiert TM4SF1. Alle Tetraspaninen bilden Mikrodomänen auf der Zellmembran 6 und einige kolokalisiert mit TMED in Endothelzellen und Tumorzellen 2,3. Wie Tetraspaninen wie CD9, CD81 und CD151 sind ubiquitär exprimiert, kann die hier beschriebenen Färbungsprotokoll zu vielen verschiedenen Zelltypen, die TM4SF1 fehlt für die Studien von nanopodia Funktion erweitert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass discs&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-545-82&#160;</td>
			<td style="width:983px;">12-mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-310</td>
			<td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-544-1</td>
			<td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50-ml falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:133px;">352070</td>
			<td>50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">15-ml falcon tube with Styrofoam rack</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:133px;">430790</td>
			<td>Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sharp forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">13-812-42</td>
			<td>Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353047</td>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">150-mm cell culture plate&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353025</td>
			<td>150-mm cell culture plate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">19G 1 &#189; syringe needle&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">309635</td>
			<td>19G 1 &#189;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td>Decon&#39;s Pure Ethanol 200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">collagen solution&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">354249</td>
			<td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:160px;">Cellgro</td>
			<td style="width:133px;">25-053-CI</td>
			<td><a name="RANGE!D15">0.25% Trypsin-EDTA 1X</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">75889 5 LT</td>
			<td style="width:983px;">PBS, 10X Solution, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">19943 1 LT</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td><a name="RANGE!D19">Fetal Bovine Serum</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EGM2-MV</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T8787</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">S2002-25G</td>
			<td>solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human TM4SF1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">MAB3127</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human CD9 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">555370</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">A-21202</td>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Chemicon</td>
			<td style="width:133px;">90324</td>
			<td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">anti-fade mounting media&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">P-36931</td>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Buffers and solutions</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">70% ethanol&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>17.5 ml of ethanol (200 proof) 
			7.5 ml of double deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS (make 200 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20 ml of 10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">180 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20% Triton X-100 (make 20 ml)&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">4 ml</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">16 ml double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4% NaN3 (make 25 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">1 g of NaN3</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Make stock soln. of 50 &#956;g/ml (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">830 &#956;l of Collage I (3 mg)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml PBS&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ICC Blocking Buffer (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">49 ml PBS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2% FBS (add 1 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">0.04% NaN3 (add 100 &#956;l of 4% NaN3)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml of ICC Blocking Buffer&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 &#956;l of 20% Triton X-100</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Cell</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">HUVEC&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Lonza&#160;</td>
			<td>C2517A</td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PC3</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-1435</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">cell culture hood</td>
			<td style="width:160px;">NuAIRE</td>
			<td style="width:133px;">Nu-425-600</td>
			<td>NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">37 &#176;C, 5% CO2 cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:160px;">CellStar</td>
			<td style="width:133px;">QWJ300DABA&#160;</td>
			<td>Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">heating pad&#160;</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td style="width:133px;">1020</td>
			<td style="width:983px;">K&#38;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">centrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorvall&#160;</td>
			<td style="width:133px;">T6000B&#160;</td>
			<td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopodia - thin, fragile membrane projections with roles in cell movement and intercellular interactions

Adhärenten Zellen in Kultur pflegen einen Polarisationszustand, um Bewegung und interzellulären Interaktionen unterstützen. Nanopodia sind dünne, längliche, weitgehend F-Actin-negative Membran Projektionen in Endothel-und Krebszellen, die durch TM4SF1 (Transmembrane-4-L-Sechsfamilien-1) Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden kann. TM4SF1 Cluster in 100-300 &amp;mgr; m Durchmesser TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro omains d), die 3 bis zu 14 einzelne TM4SF1 Molekülen. TMED intermittierend entlang nanopodia in einem regelmäßigen Abstand von 1 bis 3 μ m pro TMED und fest zu verankern, um nanopodia Matrix angeordnet sind. Dies ermöglicht nanopodia mehr als 100 μ m von der Vorderfront oder Nachlauf polarisierten Endothelzellen oder Tumorzellen erstrecken, und bewirkt Membranreste hinter auf matr überlassenix, wenn die Zelle sich bewegt. TMED nanopodia und wurden aufgrund ihrer extremen Zerbrechlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Temperaturübersehen worden. Routine Waschen und Fixierung stören die Struktur. Nanopodia durch direkte Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) bei 37 º C aufbewahrt, gefolgt durch kurze Exposition gegenüber 0,01% Triton X-100 vor der Färbung. Nanopodia neue Perspektiven zu öffnen in der Zellbiologie: sie versprechen, unser Verständnis, wie Zellen ihre Umwelt wahr neu zu gestalten, zu erkennen und zu identifizieren anderen Zellen in einem Abstand, initiieren interzellulären Wechselwirkungen an engen Kontakt, und der Signalmechanismen in Bewegung, Proliferation und Zell -Zell-Kommunikation. Die, die für das Studium TM4SF1 abgeleitete nanopodia entwickelt werden Verfahren kann für die Studien von nanopodia, die in anderen Zelltypen durch die Vermittlung von klassischen Tetraspaninen, insbesondere des ubiquitär exprimiert CD9, CD81 und CD151 zu bilden.

Für Schritt 1: Wenn Zellen (wie HUVEC und PC3 in dieser Studie verwendet) sind in der Lage, normal zu wachsen, werden Zellen, die mit Kollagen beschichteten Platte innerhalb von 30 min zu befestigen, nachdem sie ausgesät sind, zu polarisieren und zu mobilen bald danach, und erstrecken sich nanopodia vor ihrem Weg Bewegungs. Fig. 1A und 1B jeweils eine polarisierte oder proliferierende HUVEC. 2A zeigt polarisierten PC3-Zellen in einem mobilen Zustand. Für Schritt 2: Vorwärmung mit 4% PFA bis 37 ° C, Fixierung von Zellen bei 37 ° C für 20 min und vorsichtiges Waschen mit PBS, Raumtemperatur, zelluläre Zustände sollten gut konserviert werden. Generell isolierten Einzel HUVEC (Abbildung 1A, 1) oder PC3 (2A)-Zellen wird eine polarisierte Morphologie zeigen, es sei denn Zellen sind im Zustand der Zellteilung (1B, 1). Die interzelluläre Wechselwirkungenwas zu Zell Übergang Bildung (1C, 1) sind ebenfalls häufig beobachtet. Nanopodia sollte auf der Zellperipherie auftreten, und F-Actin oft in Abschnitten des nanopodia proximal der Zelle vorhanden sein. Kalte Temperaturen führen zu F-Actin, um wieder in Zellen hinter nanopodia Membrankanäle zurückzuziehen. Suboptimale Temperatur, wie in den Beispielen 4 ° C mit PFA-Fixierung und kaltem PBS Wasch gezeigt wird stören und zerstören nanopodia Struktur in polarisierten Zellen (Abbildung 1A, 2), wuchernden Zellen (Abbildung 1B, 2) und künstlich Lücken an interzellulären Verbindungen erzeugen (Fig. 1C, 2). Für Schritt 3: Viele Membran-gebundene Proteine, einschließlich TM4SF1 sehr empfindlich auf Triton X-100 und wird von der Zelloberfläche entfernt werden, wenn Konzentrationen von mehr als 0,03% verwendet werden 2,3. Um die meisten der Zelloberfläche TM4SF1, P bewahrenFA fixierten Zellen nur mit 0,01% Triton X-100 enthaltenden Blockierungspuffer für eine Stunde vor dem Wechsel zum Anti TM4SF1 primären Antikörper, der in einem regulären Blockierungspuffer, der Triton X-100 nicht enthält, verdünnt wurde, behandelt werden. Wie nanopodia sind dünn und lang Membran Projektionen und heften sich durch TMED Matrix wird TMED Intensität wahrscheinlich benötigen, um durch Helligkeit und Kontrast Funktionen in Bildbearbeitungssoftware wie Photoshop, um durch nanopodia Reste verraten und verfolgen den Weg der Zellbewegung (Abbildung verbessert werden 1, 2 Einschübe). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51320/51320fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51320/51320fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Nanopodia Projektionen während der endothelialen Zellbewegung, Zellteilung und Bildung Kreuzung. HUVEC wurden für 6 Stunden afte frisch kultiviertenr Plattieren bei 60% Konfluenz auf Kollagen-beschichteten Glasplatte. Zellen wurden unter Verwendung von (1) Verfahren, bei dem das modifizierte Zellen wurden in 37 ° C direkt ohne Vorwäsche PBS 4% PFA fixiert, und in einem 37 ° C-Inkubator während 20 min Fixierungszeit, oder (2) einem herkömmlichen Färbungsverfahren platziert fest wobei die Zellen mit PBS zweimal Raumtemperatur in 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur gewaschen und fixiert. Nanopodia, dünnen und langen Membran-Erweiterungen, die durch eine intermittierende, gebändert Muster der TMED (weiße Pfeile) markiert sind, und dass oft umschließen Phalloidin-gefärbten F-Aktin (rosa Pfeile) in Portionen proximal der Zelle wurden Immunfluoreszenz gefärbt mit Anti-TM4SF1 Ab. Drei repräsentative HUVEC Bilder wurden eingefangen, um das Aussehen nanopodia während (A) Polarisation, (B) Zellteilung, und (C) interzelluläre Verbindung Bildung zeigen. Insetboxen zeigen höhere Vergrößerungen von nanopodia. Während polarisiert (A) oder retracted zelluläre Zustände (B, C) ​​wurden die nanopodia Vorsprünge durch direktes Fixieren Zellen in 37 ° C PFA erhalten, während die Strukturen weitgehend durch Waschen entfernt und die Fixierung der Zellen in PBS, Raumtemperatur und PFA. (C) 37 ° C PFA Fixierung bewahrt interzellulären Verbindungen (blaue Pfeile), während Übergänge von kälteren Temperaturen, die Zellen veranlassen, sich zurückzuziehen gestört ist, dass eine Lücke zwischen Zellen durch nanopodia von denen die meisten F-Aktin (rosa Pfeile) überbrückt und einige nicht (weiße Pfeile) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51320/51320fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51320/51320fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51320/51320fig2.jpg" /> 2. Nanopodia die Richtung der PC3 Tumorzellbewegung demonstrieren. (A)PC3-Tumorzellen wurden frisch für 6 Stunden nach dem Ausstreichen bei 60% Konfluenz auf Kollagen-beschichtete Glasplatte kultiviert. Die Zellen wurden direkt in 37 ° C 4% PFA fixiert und in einem 37 ° C Inkubator für 20 min auf nanopodia erhalten platziert. Nanopodia (weiße Pfeile) und F-Aktin (rosa Pfeile) waren Immunfluoreszenz gefärbt mit Anti-TM4SF1 Ab und Phalloidin auf. Der Einschub Box zeigt nanopodia bei höherer Vergrößerung. Dieses Bild zeigt, dass Vertreter TM4SF1 Ausdruck in PC3-Zellen ist heterogen; ein PC3 Zelle mit starken TM4SF1 Färbung (gelber Pfeil) erzeugt lange nanopodia und wird durch zwei schwach TM4SF1-gefärbten PC3-Zellen (rote Pfeile) umgeben ist. Nanopodia Rückstände an der Hinterkante (ib) geben die Richtung der PC3 Zellbewegung während der 6 Stunden Zellkultur Zeitraum. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51320/51320fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51320/51320fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51320/51320fig3.jpg&quot; /&gt; 3. Visualisierung von nanopodia durch Tetraspanin CD9. (A) HUVEC wurden nach der Beschichtung bei 60% Konfluenz auf einem Kollagen-beschichtete Glasplatte für 6 Stunden frisch kultiviert. Zellen wurden fixiert in 37 ° C 4% PFA und nanopodia (weiße Pfeile) wurden durch anti-CD9 Ab ergab. F-Aktin (rosa Pfeile) wurde mit Phalloidin gefärbt. Diese repräsentative Bild zeigt, dass CD9 lokalisiert auch nanopodia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51320/51320fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Nanopodia sind dünn, aber empfindlichen Membrankanäle, die sich bis 100 um von führenden Vorder-oder Hinter Rückseite einer Zelle und spüren die zelluläre Umgebung. Direktbefestigung auf 37 ° C, sanftes Waschen und Vermeidung von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol oder Aceton und höherer Triton X-100-Konzentrationen sind erforderlich, um diese Zellstrukturen zu beobachten.

Nanopodia - Dünne, Zerbrechlich Membran Projektionen mit Rollen in der Zellbewegung und interzelluläre Wechselwirkungen

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Aufrufe.  Harvard Medical School.  Nanopodia sind dünn, aber empfindlichen Membrankanäle, die sich bis 100 um von führenden Vorder-oder Hinter Rückseite einer Zelle und spüren die zelluläre Umgebung. Direktbefestigung auf 37 ° C, sanftes Waschen und Vermeidung von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol oder Aceton und höherer Triton X-100-Konzentrationen sind erforderlich, um diese Zellstrukturen zu beobachten. 

Serie: Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Forschung

Biologie

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash-and-Freeze-: eine neuartige Technik Membrandynamik mit Elektronenmikroskopie zu erfassen

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

Isolierung und Bildgebung von live, intakten Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens der Maus durch Vibratom-Schnitte

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...