Vorremmo ringraziare Coy Laboratori per fornire gentilmente le immagini della camera anaerobica. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione DK087763 (SMM) e un Curriculum STEP / HHMI Sviluppo Fellowship (ANE).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi qui descritti consentono il recupero semplice e veloce di C. difficile da una varietà di campioni fecali, compresi gli esseri umani, topi e criceti, nonché la conservazione a lungo termine di C. difficile come scorte glicerolo o spore. C. difficile può essere un organismo difficile da coltivare, ma accurata manutenzione di un ambiente anaerobico e l&#39;applicazione di tecniche asettiche può provvedere robusta crescita e una riduzione della contaminazione. Le camere anaerobiche: Considerazioni e manutenzione Ci sono due tipi di camere anaerobiche: camere di rigidi o camere in vinile. Camere rigidi sono fatti tipicamente di alluminio o un polimero rigido (ad esempio plexiglas o materiali acrilici), permettendo l&#39;uso di sostanze chimiche corrosive. Camere rigidi possono essere convertiti in uno stile senza guanti e sono meno soggette a forature, tuttavia, le perdite sono difficili da individuare e trovare e camere rigidi richiedono qualche metodo percompensare spostamento gas durante l&#39;uso. Le unità polimeriche spesso sono dotate di camera di compensazione solo spurgo, che potrebbe essere più costoso per funzionare. Per la manutenzione delle rigide condizioni atmosferiche, il costo, la flessibilità, requisiti di spazio di laboratorio e di facile manutenzione, le camere vinile anaerobici sono raccomandati (Coy Laboratorio Prodotti, Figura 1A). Questa camera anaerobica è costituito da un vano portaoggetti vinile che è supportato da una struttura tubolare in alluminio ed è collegato a una camera di compensazione che funziona come uno scambio per il trasferimento di materiali dentro e fuori della camera (Figura 1B), utilizzando guanti in lattice o neoprene collegato a maniche in vinile (Figura 1C). È importante seguire esattamente le istruzioni del produttore per il corretto assetto della camera anaerobica. Può essere a temperatura controllata con una (o più, a seconda delle dimensioni della camera) unità di casella riscaldatore che prevedono la circolazione dell&#39;aria attraverso un catalizzatore di palladio. Il palladio catalyst serve per ridurre la contaminazione ossigeno introdotto attraverso l&#39;interscambio convertendo idrogeno e ossigeno in acqua. Idealmente, entrambi i livelli di ossigeno e idrogeno sono controllati mediante un analizzatore di gas (Figura 1D), visualizzando concentrazione di ossigeno in parti per milione (ppm) e la concentrazione di idrogeno in percentuale. Mezzi liquidi e solidi, sia pre-ridotto nella camera anaerobica prima dell&#39;uso. Piastre di Petri (100 mm di diametro) possono essere ridotti solo per due ore prima di utilizzare il 31, tuttavia, terreno liquido dovrebbero essere ridotte durante la notte. Soprattutto, i media devono essere raffreddati prima del trasferimento nella camera per evitare lampeggiante liquido durante l&#39;evacuazione camera di compensazione. Consumo di plastica, come piastre a 96 pozzetti, devono essere pre-ridotti notte prima dell&#39;utilizzo, la plastica è poroso e può memorizzare le molecole di ossigeno 32. A seconda dell&#39;applicazione, alcune plastiche devono essere pre-ridotto fino a 48 ore prima dell&#39;uso 33. Rifiuti Biohazard dovrebbe be smaltiti in modo appropriato. Una piccola borsa di rischio biologico può essere conservato all&#39;interno della camera, ma deve essere sostituito frequentemente. Una concentrazione di idrogeno di almeno il 3% deve essere mantenuto all&#39;interno della camera, in modo da garantire sia una buona crescita di C. rimozione dell&#39;ossigeno difficile ed efficiente. Se la concentrazione dell&#39;idrogeno è inferiore al 3% o se la cella non è stata utilizzata per diversi giorni, un ciclo camera deve essere eseguito per ripristinare la concentrazione di idrogeno a livelli desiderabili. Qui, circa un terzo del gas nella camera è aspirato (casella vinile sgonfi significativamente) e sostituito con miscela di gas fresco. Assicurarsi che la camera di compensazione è anaerobico prima di iniziare. Pompaggio troppo gas nella camera deve essere evitato, poiché pone non solo inutile stress sul sacchetto vinile, ma sarà anche impedire all&#39;utente di raggiungere nella parte posteriore della camera. Eseguire sempre questa procedura in una zona ben ventilata. Prendere precauzioni supplementari se il chamber è conservato in una piccola stanza scarsamente ventilato. Aprite le porte alla camera come il contenuto di gas all&#39;interno della camera può asfissiare l&#39;utente. Manutenzione addizionale comprende rigenerazione del catalizzatore palladio per garantire la rimozione efficiente di ossigeno all&#39;interno della camera. L&#39;ossigeno e l&#39;idrogeno sono ridotti dal catalizzatore, l&#39;acqua può accumularsi sulla superficie dei granuli di alluminio rivestito di palladio, riducendo la loro efficienza nel tempo. Per ovviare a questo, i catalizzatori di palladio dovrebbero essere rigenerate almeno una volta alla settimana dalla cottura di almeno 230 ° C per un&#39;ora. Inoltre, a causa sia della riduzione dell&#39;ossigeno ed evaporazione dell&#39;acqua di piatti e supporti, accumulo di acqua è un problema comune ai camere anaerobiche. Per garantire comodo manipolazione e aumentare l&#39;emivita delle apparecchiature all&#39;interno della camera, possono essere utilizzate confezioni di essiccante, ma devono essere asciugate frequentemente seguendo la stessa procedura utilizzata per i catalizzatori di palladio. In alternativa, un deumidificatore può essere utilizzato quale circola aria attraverso un blocco metallico che condensa acqua e vengono raccolte in un contenitore. Il dispositivo impedisce di troppo pieno dei contenitori d&#39;acqua, tuttavia, deumidificatori devono essere monitorati ed i contenitori devono essere svuotati quando quasi al massimo. Per pulire la camera di vinile, è consigliato l&#39;uso di un panno morbido e detergenti disponibili in commercio raccomandato per il cloruro di polivinile (PVC) (ad es Pulitore magico di plastica, parte no. 1.600.480, Coy Laboratories). Per evitare di graffiare o danneggiare la camera di vinile, non usare asciugamani di carta, Kim-salviette o prodotti contenenti chetoni o altri composti che danneggiano il PVC. Infine, C. difficile produce gas idrogeno solforato (H 2 S), che è estremamente reattivo e corrosivo. L&#39;idrogeno solforato può essere dannoso per la strumentazione, il catalizzatore palladio e alcuni metalli esposti. Se possibile, non lasciare alcuna strumentazione, come omogeneizzatori e spettrofotometri, in chamber per lunghi periodi di tempo per evitare la corrosione da acido solfidrico. A causa della produzione di idrogeno solforato, elementi quali l&#39;analizzatore palladio catalizzatore e gas dovranno essere periodicamente sostituito come parte della regolare manutenzione camera. Alternative per ridurre i livelli di solfuro di idrogeno all&#39;interno della camera, come l&#39;utilizzo di carbone attivo, acetato di piombo, cloruro di argento o argento solfato di assorbire o chimicamente rimuovere il solfuro di idrogeno, sono stati descritti 34 e possono essere utilizzati per rallentare la corrosione delle apparecchiature. Precauzioni aggiuntive Non aprire mai una porta per la camera di compensazione senza garantire che l&#39;altra porta è chiusa e bloccata per evitare la contaminazione di ossigeno. Inoltre, evitare l&#39;uso di elementi taglienti all&#39;interno della camera per ridurre il rischio di puntura del vinile. È importante notare che l&#39;idrogeno è un gas infiammabile in presenza di ossigeno. Fare attenzione quando si introduce elementi into la camera che gli elevati livelli di contaminazione ossigeno non si verificano (maggiore di 999 ppm). È importante utilizzare solo premiscelato miscela di gas non infiammabile anaerobica e monitorare attentamente l&#39;analizzatore di gas all&#39;interno della camera, soprattutto quando si utilizza un nuovo serbatoio di gas. Se si verificano entrambe le concentrazioni di idrogeno e ossigeno superiori al 4%, garantire che le procedure di emergenza appropriate, che devono essere descritte in procedure operative standard del laboratorio (SOP), sono seguiti. Risoluzione dei problemi C. la crescita difficile Se scarsa crescita di C. culture difficile è osservata in terreno ricco, questo è più spesso per contaminazione ossigeno all&#39;interno della camera. L&#39;aggiunta di un agente riducente (ad esempio L-cisteina o tioglicolato) al mezzo può migliorare la crescita, tuttavia, il problema della contaminazione di ossigeno all&#39;interno della camera avrebbe bisogno di essere affrontate. Monitoraggio dei livelli di ossigeno e idrogeno all&#39;interno della camera con un analizzatore di gas può rapidamente unalert all&#39;utente di problemi prima di un ritardo in corso e diminuzione della produttività si verifica. In caso di contaminazione di ossigeno, individuando rapidamente l&#39;origine con un rilevatore di fughe di gas (disponibile da Coy Laboratories) è consigliato. Per aumentare la probabilità di trovare la posizione di una perdita, uno straccio imbevuto di alcool può essere posizionato all&#39;interno della camera poiché il rivelatore può identificare aumento dei livelli di idrocarburi e aumento dei livelli di idrogeno. Una volta trovata la fonte della perdita, può essere riparato con colla o silicone seguendo le istruzioni del produttore. Un certo numero di organismi facilmente crescere in ambienti anaerobici, comprese altre specie comuni clostridi (Clostridium perfringens ad esempio) e la anaerobio facoltativo, Escherichia coli. Tecnica asettica e altre strategie possono ridurre il rischio di contaminazione. Organizzazione adeguata all&#39;interno della camera, come l&#39;immissione articoli a portata di mano per ridurre il potenziale di fo cadute e pronta rimozione dei rifiuti biologici accumulati, possono ridurre i rischi di contaminazione. Inoltre, asciugamani di carta inumidito con una soluzione diluita di candeggina possono essere portati periodicamente nella camera per pulire le superfici ed i guanti di lattice o neoprene. E &#39;fondamentale per non lasciare soluzioni di candeggina o alcool all&#39;interno della camera per lunghi periodi di tempo in quanto questi possono permeare l&#39;atmosfera e mezzi solidi e liquidi, uccidendo C. difficile, oltre a danneggiare il vinile 34. Inoltre, la sostituzione regolare dei guanti in lattice o neoprene può anche ridurre il rischio di contaminazione. Come accennato in precedenza, se non siete sicuri se un organismo è C. difficile o un contaminante, un test per la presenza del gene tdcB usando PCR possono determinare rapidamente se l&#39;organismo è C. Difficile 21. Infine, se coltivare organismi multipli all&#39;interno della stessa camera anaerobica, è importante notare che C. difficile può produrre sottoprodotti metabolici (e. G. Solfuro di idrogeno) che inibiscono la crescita di altri microrganismi anaerobi e viceversa.

Clostridium difficile è un batterio Gram-positivi, sporigeni batterio che è un anaerobio obbligato e un agente patogeno gastrointestinale potenzialmente fatale di uomini e animali. Inizialmente descritto nel 1935 come un organismo commensale trovato in campioni di feci da neonati 1, C. difficile è stato poi dimostrato di essere l&#39;agente eziologico della colite pseudomembranosa associata a trattamento antibiotico 2. C. infezioni difficile (CDI) sono in genere preceduti da un trattamento antibiotico che provoca l&#39;interruzione della normale flora del colon, creando una nicchia per C. difficile a prosperare 2. C. difficile è trasmesso come una spora dormiente via fecale-orale e successivamente germina all&#39;interno del tratto gastrointestinale, producendo cellule vegetative in grado di generare più tossine e causando gravi malattie e colite 3. CDI sono spesso refrattari ai trattamenti convenzionali e questi infezioni sono spesso ricorrenti 4. Come risultato, CDI sono responsabili per un massimo di 4,8 miliardi dollari in spese sanitarie negli Stati Uniti 5-7. C. difficile è molto sensibile anche bassi livelli di ossigeno nell&#39;ambiente. Per C. difficile a persistere nell&#39;ambiente e trasmettere in modo efficiente da un host all&#39;altro, la formazione di una spora metabolicamente attivo è fondamentale 8. Poiché la manutenzione laboratorio e manipolazione di C. difficile richiede un ambiente anaerobico controllato, queste tecniche richiedono l&#39;uso di una camera anaerobica. L&#39;uso di camere anaerobiche ha aggravato recupero e l&#39;isolamento di anaerobi obbligati 9-11, e ha permesso una serie di tecniche molecolari da eseguire in atmosfera anaerobica. Oltre a C. difficile, l&#39;uso della camera anaerobica e manutenzione qui descritti sono applicabiliad altri anaerobi obbligati come altre specie clostridi (ad esempio C. perfringens), altre specie gastrointestinali (ad esempio specie Bacteroides 12) e patogeni parodontali (ad esempio, specie Peptostreptococcus 13).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone no. 2</td>
			<td>BD</td>
			<td>212120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#7429;-Fructose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurocholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#7429;-cycloserine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefoxitin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>C4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion medium</td>
			<td>BD</td>
			<td>237300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoPeptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbian sheep blood agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L21928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile swabs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories</td>
			<td>Coy Laboratory Products, Inc</td>
			<td>Customer Specified</td>
			<td>These items are custom ordered per laboratory needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCCFA agar 
			 
			Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g 
			Na2HPO4 5 g 
			KH2PO4 1 g 
			NaCl 2 g 
			MgSO4 (anhydrous) 0.1 g 
			Fructose 6 g 
			Agar 20 g 
			 
			Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. 
			 
			After autoclaving, add: 
			10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 
			25 ml of 10 mg/ml &#7429;-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 &#956;g/ml) 
			1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 &#956;g/ml) 
			 
			BHIS Medium 
			 
			Brain heart infusion 37 g 
			Yeast extract 5 g 
			 
			For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. 
			 
			Optional (add after autoclaving): 
			 
			3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 
			10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 
			 
			SMC Sporulation Medium 
			 
			BactoPeptone 90 g 
			Protease peptone 5 g 
			(NH4)2SO4 1 g 
			Tris base 1.5 g 
			Agar 15 g 
			 
			Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. 
			 
			Optional (add after autoclaving): 
			3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 
			 
			70:30 Medium 
			 
			BactoPeptone 63 g 
			Protease peptone 3.5 g 
			Brain heart infusion 11.1 g 
			Yeast extract 1.5 g 
			(NH4)2SO4 0.7 g 
			Tris base 1.06 g 
			 
			For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). 
			 
			Blood agar 
			 
			The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 
			 
			1X Phosphate buffered saline (PBS) 
			 
			NaCl 8.01 g 
			KCl 0.2 g 
			Na2HPO4 1.44 g 
			KH2PO4 0.27 g 
			 
			Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and maintaining clostridium difficile in an anaerobic environment

Clostridium difficile è un anaerobico, batteri sporigeni Gram-positivo che è principalmente responsabile della diarrea associata agli antibiotici (AAD) ed è un importante patogeno nosocomiale. C. difficile è notoriamente difficili da isolare e coltivare ed è estremamente sensibile anche bassi livelli di ossigeno nell&#39;ambiente. Qui, metodi per isolare C. difficile da campioni fecali e successivamente coltura C. difficile per la preparazione degli stock di glicerolo per la conservazione a lungo termine sono presentati. Sono anche descritte tecniche di preparazione e l&#39;enumerazione scorte spore in laboratorio per una varietà di applicazioni a valle compresi studi di microscopia e animali. Queste tecniche richiedono una camera anaerobica, che mantiene un ambiente anaerobico coerente per garantire condizioni appropriate per ottimale C. la crescita difficile. Forniamo protocolli per il trasferimento di materiali e dalla camera senza cautilizzando una contaminazione significativa ossigeno insieme con suggerimenti per la manutenzione periodica necessaria per sostenere l&#39;ambiente anaerobico adeguato per un efficiente e coerente C. la coltivazione difficile.

Un esempio di C. difficile coltivate su bhis e Columbia anaerobica pecore agar sangue media può essere visto in Figura 2. C. difficile forma colonie irregolari che sono piatta e in possesso di un aspetto a vetro smerigliato che è evidente in entrambi i supporti. Qui, un isolato clinico eritromicina sensibile di C. difficile, 630E 30, è cresciuto su bhis agar, un arricchito, terreno non selettivo, per 24 ore a 37 ° C (Figura 2A). Colonie su Columbia anaerobica agar sangue di montone appaiono simili a quelle coltivate su bhis sotto luce bianca (Figura 2B), tuttavia, l&#39;uso di questo strumento prevede anche il rilevamento della fluorescenza verdastra o chartreuse esibita da C. difficile sotto-onda lunga ultravioletta (UV) 15 (figura 2C). C. colonie difficile del TCCFA su agar sono simili a crescita su bhis agar. A causa della presenza di due antibiotici in TCCFA mezzo, una TIMe periodo di 48 ore di crescita è necessario prima che l&#39;enumerazione delle colonie. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50787/50787fig1.jpg" /> Figura 1. La camera Coy Laboratories Tipo C vinile e dei suoi componenti. (A) A Coy Laboratories Tipo C camera di vinile che fornisce spazio di lavoro per un singolo individuo in una sola volta (42 pollici x 32 pollici). Esso contiene una ventola casella catalizzatore (angolo posteriore sinistro) che circola e riscalda l&#39;aria, e detiene il Stak-Pak contenente il catalizzatore di palladio necessario per ridurre qualsiasi contaminazione ossigeno. (B) La camera di compensazione serve come interscambio e fornisce un meccanismo per il trasferimento di materiali dentro e fuori della camera, evitando la contaminazione significativa ossigeno all&#39;interno dell&#39;ambiente anaerobico. La camera di compensazione ha due porte: una che forniscono accesso all&#39;esterno della camera di compensazione e l&#39;altra permette l&#39;accesso all&#39;interno del secolo<html> e da camera anaerobica. La camera di equilibrio è programmabile e permette di cicli personalizzati per l&#39;ingresso nella camera. L&#39;apparecchio funziona in modalità automatica, semi-manuali e manuali. (C) Attaccato, guanti in lattice flessibili sono forniti che consentono gamma completa di movimento e di raggiungere all&#39;interno della camera. I guanti sono fissati ad un bracciale specializzati presso le maniche vinile con adesivo vinile, permettendo la sostituzione dei guanti senza interrompere l&#39;atmosfera anaerobica della camera. Guanti in neoprene sono inoltre disponibili. (D) il modello 10 Gas Analyzer controlla continuamente ossigeno e livelli di idrogeno che forniscono una lettura istantanea della atmosfera all&#39;interno della camera. Questa unità consente di avvisi immediati in caso di perdita, una miscela di gas non corretto viene utilizzato o ulteriori problemi sorgono con allarmi acustici e una luce LED lampeggiante. ig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. L&#39;aspetto di C. colonie difficile del su vari supporti. La caratteristica, irregolare, aspetto a vetro smerigliato piano è evidente con un isolato clinico eritromicina sensibile di C. difficile, 630E 30, cresciuto su bhis agar per 24 ore (A) e Columbia anaerobica pecore agar sangue per 48 ore sotto luce bianca (B) e la luce ultravioletta a onde lunghe (C).

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Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile è un batterio patogeno che è un rigoroso anaerobio e provoca diarrea associata agli antibiotici (AAD). Qui, metodi per isolare, coltivare e mantenere C. cellule vegetative difficile e spore vengono descritti. Queste tecniche richiedono una camera anaerobico, che richiede una manutenzione regolare per assicurare adeguate condizioni di ottimale C. la coltivazione difficile.

Coltura e manutenzione<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In un ambiente anaerobico

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

38.4K Views.  Emory University School of Medicine.  Clostridium difficile è un batterio patogeno che è un rigoroso anaerobio e provoca diarrea associata agli antibiotici (AAD). Qui, metodi per isolare, coltivare e mantenere C. cellule vegetative difficile e spore vengono descritti. Queste tecniche richiedono una camera anaerobico, che richiede una manutenzione regolare per assicurare adeguate condizioni di ottimale C. la coltivazione difficile. 

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Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

This protocol outlines the cefoperazone mouse model of Clostridium difficile infection (CDI) using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Emphasis on clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol.

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Un'analisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...