ברצוננו להודות למתחנחן מעבדות באדיבות מתן תמונות של חדר אנאירובי. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DK087763 (SMM) ותכנית לימודים STEP / HHMI פיתוח מלגה (Ane).

<ol>
	<li>Hall, I. C., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+flora+in+new-borin+infants+-+With+a+description+of+a+new+pathogenic+anaerobe,+Bacillus+difficilis.">Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis.</a> Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).</li><li>Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clindamycin-Associated+Colitis+-+Prospective+Study.">Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study.</a> Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).</li><li>Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+30+years+on:+what+has,+or+has+not,+changed+and+why.">Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).</li><li>Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Clostridium+difficile+infection.">Treatment of Clostridium difficile infection.</a> Clin. Infect. Dis. 46, 32-42 (2008).</li><li>Dubberke, E. R., Olsen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+Clostridium+difficile+on+the+healthcare+system.">Burden of Clostridium difficile on the healthcare system.</a> Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).</li><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+Clostridium+difficile+infection:+understanding+the+healthcare+burden.">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).</li><li>Peery, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+gastrointestinal+disease+in+the+United+States:+2012+update.">Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update.</a> Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).</li><li>Deakin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clostridium+difficile+spo0A+gene+is+a+persistence+and+transmission+factor.">The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor.</a> Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).</li><li>Drasar, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+anaerobic+intestinal+bacteria.">Cultivation of anaerobic intestinal bacteria.</a> J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).</li><li>Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+CO+2+cabinet+for+the+cultivation+of+strict+anerobes.">Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes.</a> Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).</li><li>Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene, ., Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+anaerobic+systems+for+the+isolation+of+anaerobic+bacteria+from+clinical+specimens.">Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens.</a> Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).</li><li>Bacic, M. K., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+and+cultivation+of+bacteroides+species.">Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).</li><li>Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proficiencies+of+three+anaerobic+culture+systems+for+recovering+periodontal+pathogenic+bacteria.">Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).</li><li>Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+Treponema+microdentium+as+surface+colonies.">The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies.</a> Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).</li><li>George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+differential+medium+for+isolation+of+Clostridium+difficile.">Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).</li><li>Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Clostridium+difficile+by+normal+hamster+cecal+flora+and+prevention+of+antibiotic-associated+cecitis.">Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis.</a> Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).</li><li>Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sodium+taurocholate+to+enhance+spore+recovery+on+a+medium+selective+for+Clostridium+difficile.">Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).</li><li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+(CCFA)+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients.">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li><li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools.">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li><li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile.">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).</li><li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile.">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).</li><li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile.">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li><li>Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+study+of+gram-stained+stool+smears+in+diagnosis+of+Clostridium+difficile+colitis.">Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis.</a> J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).</li><li>Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferable+tetracycline+resistance+in+Clostridium+difficile.">Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).</li><li>Permpoonpattana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+layers+of+Clostridium+difficile+endospores.">Surface layers of Clostridium difficile endospores.</a> J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).</li><li>Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpoIVA+and+SipL+are+Clostridium+difficile+spore+morphogenetic+proteins.">SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins.</a> J. Bacteriol. , (2013).</li><li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile.">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li><li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clospore:+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile.">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).</li><li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid,+a+bile+acid.">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li><li>O'Connor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+chromosomal+Clostridium+difficile+mutants.">Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants.</a> Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).</li><li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface.">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li><li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes.">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li><li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile.">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li><li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+cell+culture.">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).</li><li>Lyras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin+B+is+essential+for+virulence+of+Clostridium+difficile.">Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.</a> Nature. 458, 1176-1179 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטות שתוארו כאן לאפשר התאוששות פשוטה ומהירה של ג difficile ממגוון רחב של דגימות צואה, כולל בני אדם, עכברים ואוגרים, כמו גם האחסון לטווח הארוך של ג difficile כמו מניות גליצרול או נבג. ג difficile יכול להיות אורגניזם קשה לעיבוד, אך הקפדה על סביבת אנאירובי והיישום של טכניקות אספטיים יכולים לספק לצמיחה איתנה והפחתה בזיהום. תאים אנאירוביים: שיקולים ותחזוקה ישנם שני סוגים של תאים אנאירוביים: תאים נוקשה או תאים ויניל. תאים נוקשה בדרך כלל עשויים מאלומיניום או פולימר נוקשה (למשל פרספקס או חומרים אקריליים), המאפשרים שימוש בכימיקלים מאכל. ניתן להמיר תאים נוקשה לסגנון בלי כפפות ונוטים פחות דקירות, עם זאת, הדלפות הן קשה לזהות ולמצוא ותאים נוקשה דורשים כמה שיטהלפצות על עקירת גז במהלך שימוש. יחידות הפולימר לעתים קרובות מצוידות במנעל אוויר-טיהור בלבד, אשר עלול לעלות יותר לתפעול. לצורך התחזוקה של תנאים מחמירים באטמוספרה, עלות, גמישות, דרישות שטח מעבדה ותחזוקה קלה, תאים אנאירוביים ויניל מומלצים (מוצרים מתחנחנים מעבדה, איור 1 א). תא אנאירובי זו מורכב מתא הכפפות ויניל כי הוא נתמך על ידי מבנה אלומיניום צינורי והוא מחובר למנעל אוויר המתפקד כמחלף להעברת חומרים בתוך ומחוץ לתא (איור 1), תוך שימוש בכפפות לטקס או ניאופרן מצורף לשרוולים ויניל (תרשים 1C). חשוב לעקוב בדיוק הוראות יצרן ללהגדיר נכון של חדר אנאירובי. זה יכול להיות אחד עם טמפרטורה מבוקרת (או יותר, תלוי בגודל של החדר) יחידות תיבת דוד המספקות זרימת אוויר דרך זרז פלדיום. Ca פלדיוםtalyst משמש כדי להפחית את זיהום החמצן הציג דרך המחלף על ידי הפיכת מימן וחמצן למים. באופן אידיאלי, שתי רמות החמצן והמימן נמצאות תחת פיקוח באמצעות נתח גז (1D איור), בו מוצגות ריכוז חמצן בחלקים למיליון (ppm) וריכוז מימן באחוזים. תקשורת נוזלית ומוצקה צריכה להיות מראש מופחתת בתא אנאירובי לפני השימוש. צלחות פטרי (בקוטר 100 מ&quot;מ), ניתן להפחית רק שעות לפני השימוש ביום 31, עם זאת, צריכה להיות מופחתת תקשורת נוזלית לילה. חשוב מכך, צריכה להיות מקוררת תקשורת לפני ההעברה לתא כדי למנוע מהבהב נוזלים במהלך פינוי מנעל אוויר. מוצרים צריכים מפלסטיק, כגון צלחות 96 היטב, צריכים להיות מראש מופחתים לילה לפני השימוש, כמו הפלסטיק הוא נקבובי ויכולים לאחסן מולקולות חמצן 32. בהתאם ליישום, חלק הפלסטיק חייב להיות מראש מופחת לתקופה של עד 48 שעות לפני השימוש 33. פסולת Biohazard צריכה bדואר מסולק כראוי. שקית Biohazard קטנה עשויה להיות כל הזמן בתוך התא, אבל צריך להיות מוחלפת בתדירות גבוהה. ריכוז מימן של לפחות 3% חייב להישמר בתוך החדר, כמו זו תבטיח גם צמיחה טובה של ג הסרת חמצן difficile והיעילה. אם ריכוז המימן יורד מתחת ל -3%, או אם החדר לא היה בשימוש במשך כמה ימים, מחזור תא צריך להיות מוצא להורג כדי להחזיר את ריכוז המימן לרמות רצויות. כאן, כשליש מהגז בתא הוא שאב החוצה (תיבת יניל תהיה להוציא את האוויר באופן משמעותי) והוחלף בתערובת גז טרי. להבטיח כי מנעל האוויר הוא אנאירובי לפני תחילת. שאיבת גז יותר מדי לתוך התא יש להימנע, שכן זה לא רק מציב את הלחץ מיותר על התיק ויניל, אלא גם ימנע מהמשתמש להגיע לחלק האחורי של החדר. תמיד לבצע הליך זה באזור מאוורר היטב. לנקוט באמצעי זהירות נוספת, אם צ&#39;הmber נשמר בחדר קטן, לא מאוורר. לפתוח את כל דלתות לחדר כתוכן הגז בתוך החדר יכול להחניק את המשתמש. אחזקה נוספות כוללת התחדשות של זרז פלדיום על מנת להבטיח הסרה חמצן יעילה בתוך התא. כמו חמצן והמימן מופחתים על ידי הזרז, מים יכולים להצטבר על פני השטח של כדוריות האלומיניום מכוסה פלדיום, הפחתת יעילותם לאורך זמן. כדי להתגבר על זה, צריכים להיות מחדש זרזי פלאדיום לפחות פעם בשבוע על ידי אפייה לפחות 230 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בנוסף, כתוצאה משתי הפחתת החמצן ואידוי מים מצלחות ותקשורת, הצטברות מים היא בעיה משותפת בתוך תאים אנאירוביים. כדי להבטיח מניפולציה נוחה ולהגדיל את זמן מחצית החיים של הציוד בתוך החדר, ניתן להשתמש בחבילות יבוש, אבל צריך להיות יבשות בתדירות גבוהה בעקבות אותו ההליך המשמש לזרזי פלדיום. לחלופין, דהאדים עשויים לשמש אשר מפיץ אוויר דרך גוש מתכת שתרכיזי מים והוא נאסף במכל. המכשיר מונע הצפת מיכלי המים, אולם מסירי לחות חייב להיות במעקב ומכולות יש לרוקן כאשר קרובה לתעסוקה מלאה. כדי לנקות את החדר ויניל, השימוש במטלית רכה וכל מנקה זמינה מסחרי המומלצת לפוליוויניל כלוריד (PVC) מומלץ (מנקה פלסטיק קסם למשל, חלק לא. 1,600,480, מתחנחן מעבדות). כדי להימנע מסריטות או נזק לתא ויניל, אין להשתמש במגבות נייר, קים-מגבונים או מוצרים המכילים קטונים או תרכובות אחרות שתפגענה בPVC. לבסוף, ג difficile מייצר גז מימן גופרי (H 2 S), וזה מאוד תגובתי ומאכל. מימן גופרתי יכול להזיק למכשור, זרז פלדיום וכל מתכות שנחשפו. אם אפשר, לא להשאיר שום מכשור, כגון homogenizers והספקטרופוטומטרים, בchambאה לתקופות ארוכות, כדי למנוע קורוזיה נגרמת על ידי מימן גופרתי. בגלל הייצור של מימן גופרתי, פריטים כגון מנתח זרז פלדיום וגז יהיה צורך להחליף מעת לעת כחלק מתא תחזוקה השוטפת. חלופות להפחתת רמות מימן גופרתי בתוך התא, כגון שימוש בפחם פעיל, אצטט עופרת, כלוריד כסף או סולפט כסף לקלוט או כימי להסיר את המימן גופרתי, תוארו 34 ועשויות להיות מנוצלים כדי להאט את קורוזיה של ציוד. אמצעי זהירות נוסף לעולם אל תפתח דלת אחת למנעל האוויר מבלי להבטיח שהדלת אחרת סגורה ונעול כדי למנוע זיהום חמצן. בנוסף, יש להימנע משימוש בפריטים חדים בתוך התא כדי להפחית את הסיכון של ניקוב ויניל. חשוב לציין כי מימן הוא גז דליק בנוכחות החמצן. היזהר בעת החדרת פריטי in כדי קאמרי כי רמות גבוהות של זיהום חמצן לא יתרחשו (יותר מ 999 עמודים לדקה). חשוב להשתמש בתערובת גז אנאירובי רק מעורבב מראש דליקה ולעקוב מקרוב אחרת מנתח הגז בתוך החדר, במיוחד בעת השימוש במכל דלק חדש. אם שני ריכוזי המימן וחמצן מעל 4% להתרחש, להבטיח כי נהלי החירום המתאימים, שאמורה להיות מתואר בנהלים של המעבדה הפעלה הסטנדרטי (SOP), אחריו. ג פתרון בעיות צמיחת difficile אם צמיחה ירודה של ג תרבויות difficile הוא ציין במדיום עשיר, זה לרוב עקב זיהום חמצן בתוך התא. התוספת של סוכן הפחתה (L-ציסטאין למשל או thioglycolate) למדיום עשויה לשפר את הצמיחה, עם זאת, הבעיה של זיהום חמצן בתוך החדר היית צריכה להיות מטופל. ניטור רמות חמצן והמימן בתוך התא באמצעות נתח גז יכול במהירותlert למשתמש בעיות לפני שעיכוב בהתקדמות וירידה בפריון מתרחש. אם זיהום החמצן מתרחש, זיהוי המקור עם גלאי דליפת גז (זמינים ממעבדות מתחנחנים) במהירות מומלץ. כדי להגדיל את הסיכוי למצוא את המיקום של נזילה, סמרטוט הספוג באלכוהול עשוי להיות ממוקם בתוך התא מאז גלאי דליפת גז יכולים לזהות רמות גבוהות של פחמימנים, כמו גם רמות מוגברות של מימן. ברגע שמקור הדליפה נמצא, זה ניתן לתיקון באמצעות דבק או סיליקון הבא הוראות היצרן. מספר אורגניזמים לגדול בקלות בסביבות אנאירובי, בם מינים אחרים נפוצים קלוסטרידיאל (למשל Clostridium perfringens) וanaerobe פקולטטיבי, Escherichia coli. טכניקת aseptic ואסטרטגיות אחרות יכולים להפחית את הסיכון לזיהום. ארגון מתאים בתוך התא, כגון הצבת פריטים בהישג יד כדי להפחית את פוטנציאל fאו נשפך וההסרה מיידית של פסולת ביולוגית מסוכנת שנצברה, יכולים להפחית את סיכוני זיהום. בנוסף, מגבות נייר טבולות בתמיסת אקונומיקה מהולה יכולות להיות מובאות מעת לעת אל תוך החדר כדי לנגב את משטחים ואת הכפפות לטקס או ניאופרן. זה קריטי לא להשאיר פתרונות אקונומיקה או אלכוהול בתוך החדר לפרקי זמן ארוכים כמו אלה יכולים לחדור את האטמוספרה ותקשורת מוצקה ונוזלית, והרג את ג difficile, כמו גם פגיעה ביניל 34. בנוסף, החלפה סדירה של הכפפות לטקס או ניאופרן יכולה גם להפחית את הסיכון לזיהום. כאמור, אם לא בטוח אם האורגניזם הוא ג difficile או מזהם, בדיקה לנוכחות של גן tdcB באמצעות PCR יכול לקבוע במהירות אם האורגניזם הוא ג difficile 21. לבסוף, אם טיפוח אורגניזמים מרובים באותו התא אנאירובי, חשוב לציין כי ג difficile יכול לייצר תוצרי לוואי מטבולים (ה. גרם. מימן גופרתי) המעכבים את הצמיחה של אורגניזמים אנאירוביים אחרים ולהיפך.

difficile Clostridium הוא, חיידק יוצר נבג גראם חיובי שהוא anaerobe לחייב והפתוגן במערכת העיכול שעלול להיות קטלני לבני אדם ובעלי חיים. תאר בשנת 1935 תחילה כאורגניזם commensal נמצא בדגימות צואה מיילודים 1, ג difficile מאוחר יותר הוכיח להיות הסוכן סיבתי של קוליטיס pseudomembranous הקשורים לטיפול אנטיביוטי 2. ג זיהומי difficile (CDI) הם קדמו בדרך כלל על ידי טיפול אנטיביוטי שתוצאת שיבוש הפלורה הנורמלית במעי הגס, יצירת נישה לג difficile לשגשג 2. ג difficile מועבר כנבג רדום דרך מסלול הצואה, אוראלי ולאחר מכן נובט בתוך מערכת העיכול, בייצור תאים של צמח מסוגל לייצר כמה רעלים וגורמים למחלת קוליטיס 3 חמורות. CDI הוא לעתים קרובות עקשן לטיפולים קונבנציונליים והן באלהfections לעתים קרובות חוזרים על עצמם 4. כתוצאה מכך, CDI אחראי לעד 4.8 מליארד דולרים בעלויות טיפול רפואי בארצות הברית 5-7. ג difficile רגיש מאוד אפילו לרמות נמוכות של חמצן בסביבה. לג difficile להתמיד בסביבה ולהיות מועבר ביעילות ממארח ​​למארח, היווצרות נבג מטבולית פעיל היא 8 קריטיים. בגלל תחזוקת המעבדה ומניפולציה של ג difficile דורש סביבה מבוקרת, אנאירובי, טכניקות אלה מחייבות שימוש בתא אנאירובי. שימוש בתאים אנאירוביים הביאה התאוששות ובידוד של אנאירוביים לחייב 9-11 מוגבר, ואפשר מספר הטכניקות מולקולריות שיש לבצע באווירה אנאירובית. בנוסף לג difficile, שימוש אנאירובי קאמרי והתחזוקה המתוארת כאן חליםלאנאירוביים לחייב אחרים, כגון מינים אחרים קלוסטרידיאל (למשל perfringens ג), מינים אחרים במערכת העיכול (מינים למשל Bacteroides 12) ופתוגנים חניכיים (למשל מיני Peptostreptococcus 13).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone no. 2</td>
			<td>BD</td>
			<td>212120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#7429;-Fructose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurocholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#7429;-cycloserine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefoxitin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>C4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion medium</td>
			<td>BD</td>
			<td>237300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoPeptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbian sheep blood agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L21928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile swabs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories</td>
			<td>Coy Laboratory Products, Inc</td>
			<td>Customer Specified</td>
			<td>These items are custom ordered per laboratory needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCCFA agar 
			 
			Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g 
			Na2HPO4 5 g 
			KH2PO4 1 g 
			NaCl 2 g 
			MgSO4 (anhydrous) 0.1 g 
			Fructose 6 g 
			Agar 20 g 
			 
			Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. 
			 
			After autoclaving, add: 
			10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 
			25 ml of 10 mg/ml &#7429;-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 &#956;g/ml) 
			1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 &#956;g/ml) 
			 
			BHIS Medium 
			 
			Brain heart infusion 37 g 
			Yeast extract 5 g 
			 
			For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. 
			 
			Optional (add after autoclaving): 
			 
			3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 
			10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 
			 
			SMC Sporulation Medium 
			 
			BactoPeptone 90 g 
			Protease peptone 5 g 
			(NH4)2SO4 1 g 
			Tris base 1.5 g 
			Agar 15 g 
			 
			Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. 
			 
			Optional (add after autoclaving): 
			3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 
			 
			70:30 Medium 
			 
			BactoPeptone 63 g 
			Protease peptone 3.5 g 
			Brain heart infusion 11.1 g 
			Yeast extract 1.5 g 
			(NH4)2SO4 0.7 g 
			Tris base 1.06 g 
			 
			For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 &#176;C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). 
			 
			Blood agar 
			 
			The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 
			 
			1X Phosphate buffered saline (PBS) 
			 
			NaCl 8.01 g 
			KCl 0.2 g 
			Na2HPO4 1.44 g 
			KH2PO4 0.27 g 
			 
			Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and maintaining clostridium difficile in an anaerobic environment

difficile Clostridium הוא אנאירובי, חיידק גראם חיובי, sporogenic שאחראי בעיקר לשלשולי אנטיביוטיקה משויכים (AAD), והוא הפתוגן nosocomial משמעותי. ג difficile קשה לשמצה לבודד ולטפח והוא מאוד רגיש אפילו רמות נמוכות של חמצן בסביבה. כאן, שיטות לבידוד ג difficile מדגימות צואה ולאחר מכן culturing ג difficile להכנה של מניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך מוצגים. טכניקות להכנה וספירת מניות נבג במעבדה עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים מחקרי מיקרוסקופיה ובעלי החיים גם מתוארות. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר שומר על סביבת אנאירובי עקבית על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי צמיחת difficile. אנו מספקים פרוטוקולים להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר בלי caבאמצעות זיהום חמצן משמעותי יחד עם הצעות לתחזוקה שוטפת הנדרשת כדי לקיים את סביבת אנאירובי המתאימה לג יעיל ועקבי טיפוח difficile.

דוגמא של ג difficile גדל על BHIS ותקשורת כבשים אנאירובי קולומביה אגר דם שניתן לראות באיור 2. ג difficile יוצר מושבות סדירות שהם שטוחים ובעלי מראה קרקע זכוכית אשר באו לידי ביטוי בשני אמצעי התקשורת. הנה, לבודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, הוא גדל על BHIS אגר, מדיום מועשר, הלא סלקטיבי, ל24 שעות על 37 ° C (איור 2 א). מושבות על אגר דם קולומביה אנאירובי כבשים נראות דומות לאלה שגדלו על BHIS תחת אור הלבן (איור 2), עם זאת, השימוש במדיום זה גם מספק לגילוי של הקרינה ירקרקה או ירקרקה הוצגה על ידי ג difficile תחת אולטרה סגול ארוך גל (UV) אור 15 (איור 2 ג). ג מושבות difficile על אגר TCCFA נראות דומות לגידול על אגר BHIS. בגלל הנוכחות של שני סוגי אנטיביוטיקה במדיום TCCFA, timתקופת דואר של 48 צמיחת hr היא הכרחית לפני ספירת מושבות. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50787/50787fig1.jpg" /> איור 1. קאמרי מתחנחן מעבדות סוג C ויניל ומרכיביו. () קאמרי ויניל מתחנחן מעבדות סוג C אשר מספקת סביבת עבודה עבור אדם אחד בזמן אחד (42 פנימה x 32 פנימה). הוא מכיל תיבת זרז אוהד (בפינה שמאלית אחורי) אשר מפיצה ומחמם את האוויר, ומחזיק Stak-Pak המכיל זרז פלדיום הנדרש כדי להפחית את זיהום כלשהו חמצן. (ב) מנעל האוויר משמש כמחלף ומספק מנגנון להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר תוך מניעת זיהום חמצן משמעותי בסביבה אנאירובית. יש מנעל האוויר שתי דלתות: אחת המספק גישה לצד החיצוני של מנעל האוויר והגישה אחרת למתן הפנים של ה<html> דואר קאמרי אנאירובי. מנעל האוויר הוא לתכנות ומאפשר למחזורים מותאמים אישית לכניסה לחדר. זה מפורמט במצבים אוטומטיים, חצי ידניים וידניים. (C) מצורף, כפפות לטקס גמישות מסופקים המאפשרים טווח תנועה מלא ולהגיע בתוך התא. הכפפות מובטחות לשרוול מיוחד שצורף לשרוולים ויניל עם דבק ויניל, המאפשרות החלפה של כפפות מבלי לשבש את האווירה אנאירובי של קאמרי. כפפות Neoprene זמינות אף הם. (ד) דגם 10 הגז Analyzer כל זמן עוקב אחר שניהם חמצן ורמות מימן מתן readout מיידי של האווירה בתוך החדר. יחידה זו מאפשרת התראות מיידיות במקרה של דליפה, תערובת גז שגויה משמשת או בעיות נוספות מתעוררות באמצעות אזעקות נשמעו וLED אור מהבהב. &quot;/&gt; Ig2.jpg איור 2. הופעתו של ג מושבות difficile באמצעי תקשורת שונות. המראה האופייני השטוח, לא סדיר, קרקע הזכוכית ניכר עם בודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, גדל על אגר BHIS ל24 שעות () ואגרת קולומביה אנאירובי כבשים דם ל48 שעות תחת אור הלבן (ב &#39;) ואור אולטרה סגול ארוך גל (C).

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment at JoVE.com

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.

Culturing ושמירה<em&gt; Difficile Clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

38.4K Views.  Emory University School of Medicine.  difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנא...

Video: Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

This protocol outlines the cefoperazone mouse model of Clostridium difficile infection (CDI) using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Emphasis on clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol.

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 הזנים

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Culturing ושמירה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

פלואורסצנציה

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור