Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sugli enzimi fosfotransferi, tra cui la specificità del substrato enzimatico e la cinetica di reazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una rapida raccolta di più set di dati che sono molto coerenti, consentendo una quantificazione statisticamente robusta dell'attività enzimatica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché individuare le reazioni sulle placche TLC e quantificare le specie radioattive nelle reazioni è molto più facile da dimostrare che da spiegare.
Oltre ad Astha, a dimostrare la procedura ci sarà Asia Poudel, un'altra studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare questo protocollo con un'iperespressione induttibile di una proteina con tag istidina come descritto nel protocollo di testo. Preparare un millilitro di resina di acido nitriloacetico di nichel in una colonna di gravità per purificare la proteina.
Il giorno prima dell'uso, equilibrare la colonna durante la notte a quattro gradi Celsius con due millilitri di buffer di equilibrazione. Il giorno seguente portare la colonna da quattro gradi Celsius a temperatura ambiente prima di caricare il lisato chiarificato e lasciarlo riposare per circa due o tre ore. Quindi rimescolare il pellet nel tampone di lisi.
Sonicare le cellule sul ghiaccio per intervalli di 10 volte 10 secondi, fermandosi 30 secondi tra gli impulsi. Chiarire il lisato mediante centrifugazione a 3.080 volte g per 30 minuti a quattro gradi Celsius utilizzando un microcentrifugo. Preparare il lisato chiarificato con volumi uguali di buffer di lisi, quindi applicare il lisato preparato e chiarificato alla colonna e raccogliere il flusso-through.
Riapplicare il flusso di liscimi chiarificato alla colonna e raccogliere il flusso secondario. Quindi lavare la colonna con cinque millilitri di tampone di lavaggio uno e raccogliere il flusso-through. Lavare di nuovo la colonna con cinque millilitri di tampone di lavaggio due e raccogliere il flusso.
Ora applicare due millilitri di tampone di eluizione. Raccogli il flusso in due frazioni di un millilitro ciascuna. Durante la purificazione delle proteine, l'inclusione del cloruro di magnesio nei tamponi di purificazione, una modifica al protocollo del produttore, è essenziale per l'attività enzimatica.
Per valutare qualitativamente la purificazione delle proteine mediante SDS-PAGE, eseguire 20 aliquote microliter di tutte le frazioni di colonna su un impilamento del 4%, utilizzando al 10% gel di poliacrilammide per 60 minuti a 170 volt. Macchiare il gel con 0,1%Coomassie blu a temperatura ambiente per cinque ore, dondolando delicatamente su un rocker da banco. Quindi denominare il gel nel 40%metanolo-10% di acido acetico glaciale durante la notte a temperatura ambiente, dondolando sul rocker da banco.
Dializzare la frazione eluita due contro il tampone di dialisi con un rapporto 200:1 utilizzando un dispositivo di dialisi da un millilitro con un taglio del peso molecolare di 20 kilodalton durante la notte a quattro gradi Celsius. Determinare la concentrazione del campione proteico dializzato misurando l'assorbanza a 280 nanometri e utilizzando il coefficiente di estinzione molare calcolato. Conservare le aliquote di 100 microliter del campione proteico dializzato a meno 80 gradi Celsius fino all'uso.
Prima di eseguire la reazione, preparare le lastre di cromatografia a strato sottile di cellulosa PEI lavandole in acqua deionizzata. Posizionare le piastre in una camera di vetro con acqua doppia distillata a una profondità di circa 0,5 centimetri. Dopo aver permesso all'acqua di migrare verso la parte superiore della piastra, portare le piastre fuori dalla camera di vetro e lasciare asciugare durante la notte su un rack da banco.
Contrassegnare le piastre essiccate a due centimetri da un bordo con una matita morbida per indicare dove verranno applicati i campioni per il TLC. Per i campioni a due microliter, applicare campioni distanti non meno di un centimetro. Quando si pianificano esperimenti, lasciare sempre un punto su ogni piastra inutilizzata per fungere da corsia vuota per la quantificazione del campione.
Per eseguire il test dell'attività enzimatica, preparare le singole reazioni utilizzando gamma P32 ATP come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere la RSH dopo che gli altri componenti sono stati mescolati, poiché l'aggiunta di RSH alla miscela contenente nucleotidi avvia il saggio di attività enzimatica. Per controllare l'idrolisi dell'ATP dall'attività contaminante della nucleasi, assemblare una reazione di 10 microliter senza proteine e incubarla in parallelo.
Individuare campioni a due microliter a T uguale a zero e alla fine dell'esperimento per garantire che l'ATP non fosse idrolizzato in assenza di proteine. Immediatamente dopo l'aggiunta di RSH, rimuovere due microlitri e individuarlo sulla piastra di cellulosa PEI etichettata poiché la T equivale al campione di zero minuti. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius, rimuovendo le aliquote a due microliter nei punti di tempo desiderati.
Dopo aver raccolto tutte le aliquote, eseguire la cromatografia a strato sottile riempiendo la camera cromatografica con fosfato di potassio monobasico 1,5 molare a una profondità di 0,5 centimetri. Immergere il bordo inferiore della piastra in solvente e consentire al solvente di migrare verso la parte superiore della piastra per circa 90 minuti. Rimuovere la piastra dal serbatoio di cromatografia e posizionarla su un rack di asciugatura da banco per asciugare all'aria durante la notte.
Dopo che la piastra è asciutta, avvolgere la piastra in pellicola di plastica per evitare il trasferimento di materiale radioattivo alla cassetta di imaging e analizzare per autorazione. Esporre la piastra di cellulosa PEI contenente reazioni separate a una cassetta fosforimager per quattro ore a temperatura ambiente. Dopo l'esposizione, immagine della cassetta su un fosforimager.
Utilizzando un software di imaging con un'interfaccia utente grafica, disegnare regioni di interesse o ROM selezionando prima Disegna un rettangolo, quindi utilizzare il mouse per disegnare ROM rettangolari attorno a un'intera corsia e le macchie ATP e guanosina-tetrafosfato contenute all'interno di quella corsia. Utilizzare i comandi Seleziona, Copia e Incolla per disegnare ROM identiche all'interno delle altre corsie per assicurarsi che le ROM misurino il segnale all'interno di aree identiche in ogni corsia. Includi ROM da una corsia inutilizzata da utilizzare come spazi vuoti.
Utilizzando Analyze, Tools, ROI Manager, Add commands of the imaging software, selezionare tutte le ROI disegnate sulla piastra di cellulosa PEI. Ora usa i comandi Analizza, Imposta misure, Misura per quantificare l'intensità del segnale all'interno di ogni ROI ed esportare le misurazioni come diffusore. Nel foglio di calcolo sottrarre valori di ROI vuoti da segnali sperimentali.
La conversione dei dati nella percentuale di guanosina-tetrafosfato sintetizzata è fondamentale, perché garantisce che i set di dati raccolti in giorni diversi con diversi lotti di proteine o diversi gamma P32 ATP siano coerenti e possano essere raggruppati per il rigore statistico. Questo cartone animato dimostra come le regioni di interesse vengono utilizzate per definire una corsia che contiene il segnale radioattivo totale in un campione e il componente radioattivo ATP e guanosina tetrafosfato regioni di interesse. I segnali di ATP e guanosina tetrafosfato sono normalizzati al segnale totale piuttosto che riportare i valori assoluti perché l'errore di pipettazione o il decadimento del substrato radioattivo possono influenzare il segnale totale nel campione ma non influenzano l'attività enzimatica.
Qui è mostrata una vera e propria piastra TLC di una reazione effettuata utilizzando C.difficile RSH purificato. Una reazione di controllo che non contiene proteine consente la quantificazione dell'idrolisi ATP noncata, mentre una corsia vuota consente una quantificazione accurata del segnale. Nelle macchie di ATP e guanosina-tetrafosfato, l'enzima trasferisce il fosfato radioattivo dal substrato ATP al precursore del PIL, creando guanosina tetrafosfato radioattivo.
Ciò conferma che la guanosina putativa tetrafosfato sintetasi di C.difficile è un enzima attivo. Campionando la reazione ad intervalli regolari, si possono osservare i progressi. Qui il segnale grezzo viene osservato in ogni punto di tempo.
L'ATP sta diminuendo e la guanosina tetrafosfato è in aumento. Ecco i dati normalizzati. Le barre di errore sono molto più piccole perché la normalizzazione rappresenta eventuali errori di pipettazione.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante fare attenzione a non graffiare la resina sulla piastra TLC, in quanto ciò può interferire con la migrazione del solvente. Questa è una tecnica molto accessibile con un'analisi dei dati semplice in grado di fornire rapidamente una solida quantificazione dell'attività enzimatica. L'abbiamo usato per confermare che clostridium difficile sintetizza guanosina tetrafosfato, che non è mai stato segnalato in precedenza.
Non dimenticare che lavorare con la radioattività può essere estremamente pericoloso e devi seguire le regole della tua istituzione per lo stoccaggio e l'uso di materiali radioattivi durante l'esecuzione di questa procedura. Questo metodo può fornire informazioni sulla sintesi del tetrafosfato di guanosina, ma può anche essere applicato ad altre reazioni fosfotransfere, tra cui l'attività della protein chinasi e la sintesi ciclica del diguanilato.
