Vorremmo ringraziare Giacobbe Solis per la sua assistenza nel montaggio video. Questo lavoro è stato finanziato in parte da un premio alla carriera NSF DBI-0953902 a MJ Levene.

1. Animal perfusione 5 e tutto Clearing cervello di topo <ol><li> L&#39;intera lunghezza della procedura può variare a seconda della lunghezza del tempo utilizzato per fase di disidratazione, ma in totale l&#39;intero processo può essere condotto in due giorni. </li><li> Pesare topi YFP quindi profondamente anestetizzare con una iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). </li><li> Conferma un piano chirurgico di anestesia profonda prima di procedere alla chirurgia. Controllare l&#39;animale ogni 5 minuti per vedere se reagisce a un dito del piede ditta o pizzico coda. Se l&#39;animale reagisce, una dose supplementare (1/3 della dose originale) di ketamina / xilazina è necessaria. </li><li> Una volta anestetizzato profondamente, trattenere il mouse aderendo ogni arto in un letto con del nastro chirurgico di laboratorio in modo che il mouse si trova in una posizione supina (recumbancy dorsale), esponendo il petto per un intervento chirurgico. Letto chirurgico è generalmente costituito da un metallo o rete di plastica e posta in un lavandino o su un pan-lipped modo che il sangue e fissativorifiuti possono essere facilmente raccolti. </li><li> Per iniziare, fare un&#39;incisione al di sotto del processo xifoideo. Tagliare lungo la base della gabbia toracica con le forbici e pinzette e tirare indietro la pelle, come il taglio è fatto. Fare due tagli lungo entrambi i lati dello sterno topo (attraverso le nervature) per creare un lembo di tessuto che si svolge dalla cavità toracica utilizzando una pinza emostatica lasciare esposto il cuore. </li><li> Inserire un ago di 23 g nel ventricolo sinistro del cuore e fare una piccola incisione nella parete muscolare dell&#39;atrio destro per permettere al sangue di scappare. Si prega di fare riferimento a Giove 2497 per un video di questa procedura 5. </li><li> Subito dopo l&#39;atrio destro è tagliato, iniziare una perfusione con 4 ° C tampone fosfato salino, PBS, (pH 7,2) fino a quando il sangue non viene più osservato drenante dall&#39;atrio destro del cuore (30 - 40 ml ad una velocità di circa 5 ml / min). </li><li> Una volta che tutto il sangue sia stato scaricato (fluido in uscita l&#39;atrio destro è chiaro), cambia il supporto di perfusione ad una refrigerata 4%PFA soluzione. Perfondere fino corpo del mouse diventa notevolmente rigida e fredda al tatto (circa 30 - 40 ml ad una velocità di circa 5 ml / min). (Soluzione concentrata 16% PFA viene diluito secondo le istruzioni del produttore e NaOH si aggiunge fino a pH 7.2 è raggiunto. Indossare guanti e un camice da laboratorio e maneggiare e mescolare sostanze chimiche all&#39;interno di una cappa aspirante.) </li><li> Dopo la perfusione, togliere il mouse dal letto chirurgico e decapitare per iniziare l&#39;asportazione del cervello. </li><li> Con pinze e forbici iris, rimuovere il cranio in piccole sezioni a partire dalla parte posteriore del cranio e andare avanti. Fai piccoli tagli ogni 2 - 4 mm con le forbici in tutto il cranio durante l&#39;utilizzo della pinza per tirare con attenzione l&#39;osso dal cervello in piccole sezioni. Farlo finché l&#39;intera superficie superiore del cervello è esposto. </li><li> Accise il cervello dal cranio con un 5 mm di larghezza, spatola piatta e posto in un flaconcino di vetro. Immergere nel 4% PFA per 6 ore a 4 ° C per il fissaggio post. </li><li> Dopo il messaggiofissaggio, lavare il cervello due volte in PBS temperatura ambiente versando la PFA dalla fiala di vetro e sostituendolo con PBS. Agitare il cervello in soluzione PBS prima di versare e la sua sostituzione con PBS per un secondo lavaggio. </li><li> Disidratare il cervello a temperatura ambiente da una serie graduata di etanolo incubazioni (una volta in 50%, 70%, 95%, e due volte in 100%) a 2 ore per incubazione, e poi 12 ore per la seconda incubazione etanolo 100%, a estrarre l&#39;acqua dal tessuto fissato. Per ciascuna incubazione, versare la soluzione precedente etanolo dall&#39;ampolla e sostituirlo con la soluzione successiva finché il cervello è completamente sommerso. </li><li> Dopo la seconda incubazione in 100% etanolo, versare la soluzione e sostituire con parti uguali di etanolo e la soluzione di compensazione contenente alcool benzilico e benzil benzoato (1:2 vol: rapporto vol). Dopo 2 ore di incubazione, far decantare la soluzione e sostituire con una soluzione 100% di alcool benzilico e benzile benzoato (1:2 vol: vol rapporto). Il Refraindice ctive della soluzione di compensazione è n = 1.54. </li><li> Una volta in BABB, il cervello diventa notevolmente trasparente, entro 4 - 5 ore. Per ottenere i migliori risultati di compensazione, lasciare il cervello per eliminare per 6 giorni a temperatura ambiente, mentre al riparo dalla luce. </li></ol> 2. Microscopio di installazione <ol><li> Una volta che il cervello è azzerato e pronto per l&#39;imaging, applicarla sul fondo di una piastra di Petri con cianoacrilato. Lasciare che la colla si asciughi prima di procedere. </li><li> Dopo l&#39;asciugatura, immergere il cervello in BABB e posizionare la piastra di Petri nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo microscopio per l&#39;imaging. </li><li> Usiamo un microscopio multifotone che incorpora un Mai Tai laser titanio zaffiro regolabile tra un nm 710-990 nm di eccitazione. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione che utilizziamo per generare segnali YFP è 886 nm. Potenza laser varia da 30 - 100 mW a seconda della profondità delle immagini. </li><li> Catturare il segnale riflesso fluorescenza utilizzando un obiettivo 5X Nikon (NA, 0,5) che permette grandecampo di vista di imaging (2 x 2 mm). </li><li> Filtrare il segnale riflesso fluorescente utilizzando un filtro 535/50 passa-banda e raccoglierlo con un PMT GaAsP (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey). </li><li> Le immagini del processo utilizzando il software scanimage 6 ad una risoluzione di 2048 x 2048 pixel con una velocità di scansione di 2 ms per linea per generare ad alta risoluzione, immagini YFP. </li><li> Una volta che l&#39;imaging, rimuovere il cervello dalla scatola di Petri con pinze e conservare in BABB schermati dalla luce per l&#39;imaging futuro. Per campioni incollati, rimuovere il tessuto eseguendo una lama di rasoio tra la colla e la piastra di Petri con un angolo non superiore a 30 gradi. Abbiamo conservato i campioni in BABB fino a 1 anno senza degrado visibile. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Le immagini rappresentative ei video qui riportati dimostrano l&#39;alta risoluzione multifotone capacità di imaging resa possibile dalla compensazione ottica. Brain imaging intera consenteper YFP-etichettato neuroni nei diversi strati della ippocampo e la corteccia di essere chiaramente visibile come profondo come 2 mm sotto la superficie del tessuto. Figura 1 mostra un&#39;immagine rappresentativa di una vista coronale corrispondente alle caratteristiche anatomiche dell&#39;ippocampo a 2,92 millimetri caudale al bregma 7. La profondità di imaging nel campione era 1,94 millimetri. Parte di questa differenza è dovuta alla rimozione del cervelletto alla fine caudale del cervello e l&#39;equilibrio era dovute al ritiro dal processo di disidratazione. Un&#39;altra immagine della pila mostra strato V / VI neuroni piramidali della neocorteccia esprimere YFP 2 millimetri sotto la superficie del tessuto (Figura 2). Tutte le immagini sono state acquisite con l&#39;obiettivo Nikon 5X e l&#39;ingrandimento è stato fatto utilizzando la funzione di zoom digitale per l&#39;acquisizione delle immagini nel software scanimage. Con ingrandimento di neocorteccia, gli assoni individuali e corpi cellulari dei neuroni piramidali neurone nello strato V della neocorteccia sono chiarely distinguibili fino a 1.02 mm sotto la superficie del tessuto (Figura 3). Utilizzando lo stack immagine da figura 3, una ricostruzione 3D della regione neurone è stata effettuata utilizzando il software ImageJ 8 (figura 4). La capacità ad alta risoluzione di MPM ci permette anche di presentare immagini di intere, singoli neuroni. Qui mostriamo una ricostruzione di un neurone piramidale strato V della neocorteccia in cui i singoli processi dendritiche sono chiaramente visibili (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> Figura 1 immagine rappresentativa di una serie di immagini 1,2 millimetri (0,8 - 2 mm sotto la superficie del tessuto). Cervello di topo intero neocorteccia e mostra i diversi strati nell&#39;ippocampo. Caratteristiche dell&#39;ippocampo sono visibili 1,1 millimetri sotto la superficie del tessuto e sono stati denominati usando il followING codice:. DG = giro dentato, GrDG strato granulare = della DG, Lmol = lacunosum moleculare strato, Mol = strato molecolare DG, o = strato Oriens, PoDG = polimorfo livello DG, Py = strato di cellule piramidali, Rad = strato radiatum 7 L&#39;immagine è 1,8 x 1,8 mm di dimensioni, scala bar = 200 micron. L&#39;estremità rostrale del cervello è stato fissato ad una piastra di Petri con l&#39;estremità caudale rivolto verso l&#39;obiettivo. Questo facilitato immagini sul piano coronale. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> Figura 2 cornice rappresentativa dalla pila 1,2 millimetri immagine (0,8 - 2 mm sotto la superficie del tessuto). Del cervello di topo che evidenzi la neocorteccia. Cellule piramidali e processi che esprimono YFP nello strato V / VI della corteccia sono visibili 2 mm sotto la superficie del tessuto. Il grado di etichettatura è in linea con le precedenti relazioni delle etichette sparse nella neocorteccia. 9 Inset (a destra) viene ingrandita da b<html> zona oxed a sinistra. L&#39;immagine è 1,8 x 1,8 mm di grandezza, barra di scala = 200 micron (50 micron riquadro). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> Figura 3. Cornice rappresentativa presa 774 micron sotto la superficie del tessuto dalla pila immagine di strato neuroni piramidali V nella neocorteccia del cervello. Pila va da 700 micron a 1020 micron sotto la superficie del tessuto. Uno zoom digitale 8X è stata utilizzata per catturare dettagli come i processi sottili. Immagine è di 225 x 225 micron di dimensione, scala bar = 20 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> Figura 4. Immagine rappresentativa di ricostruzione 3D (225 x 225 x 320 um) della pila di immagini in Figura 3. Immagine è di 225 x 225 micron di dimensione, scala bar = 28 micron. s &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> Figura 5. Ad alta risoluzione immagine ricostruita di un neurone piramidale strato V della neocorteccia utilizzando uno zoom digitale 10x. Neuron misura 485 micron di lunghezza, barra della scala = 25 micron. Il campo di vista per ogni piastrella immagine è 180 um x 180 micron. Ogni piastrella è a una diversa profondità (z-livello). I dendriti apicali corticali non, in generale, espressa YFP e il soma. Per avere entrambi nello stesso campo di vista, come illustrato di seguito, il potere è stato abbassato per ridurre al minimo la saturazione del soma, il che fa la multa dimmer aspetto del processo. La nostra enfasi qui era di dimostrare campo di vista, piuttosto che piccoli dettagli. Per rivelare i dettagli più fini, utilizzare uno zoom digitale, concentrarsi su una regione senza soma, e di aumentare la potenza del laser.

<ol>
	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali Istituzionale della Yale University e Comitato di Utilizzo.

Mentre standard di coloranti organici sono compatibili con una gamma di solventi organici, e quindi non pongono una sfida particolare per la compensazione protocolli, proteine ​​fluorescenti sono spesso meno tollerante di cambiamenti nel solvente. 4 Lo scopo del presente lavoro era di superare una grave limitazione precedenti protocolli di compensazione ottica in cui è stato perso di fluorescenza di XFP o gravemente degradato. Le immagini che vengono qui presentati dimostrano che la fluorescenza di YFP è stata preservata. La tecnica di compensazione ottica descritta qui consente imaging ad alta risoluzione di neuroni YFP-marcati in topo cervello intero fino a 2 mm sotto la superficie del tessuto. Utilizzando disidratazione etanolo, come dimostrato in precedenza, anche conservare verde e rosso segnali proteina fluorescente. 4 Le immagini mostrate qui dimostrano come questa tecnica di compensazione ottica può essere applicato per studiare regioni organo, come l&#39;ippocampo o neocorteccia che esprimono proteine ​​fluorescenti. L&#39;alta-Capacità di risoluzione microscopia multifotone consente inoltre di ingrandimento chiara delle cellule specifiche o aree di interesse all&#39;interno della regione organo. I punti chiave per la conservazione fluorescenza proteine ​​sono per evitare un eccesso di fissazione, per fare in modo che il fissativo e tutte le soluzioni sono mantenuti a livelli prossimi alla pH neutro, per usare l&#39;etanolo invece di metanolo per la disidratazione, e di conservare i campioni al buio. Sebbene abbiamo dimostrato qui l&#39;utilizzo di compensazione ottica per l&#39;imaging del cervello di topo, la tecnica è generalmente applicabile alla maggior parte degli organi. In questo studio abbiamo dimostrato immagini ad alta risoluzione di intere regioni del cervello di topo (neocorteccia e l&#39;ippocampo) e neuroni specifici nel livello V della neocorteccia (Il Thy1-YFPH linea del mouse etichette cellule piramidali dell&#39;ippocampo e scarsamente nella neocorteccia, 9 altre regioni appaiono scure.). Utilizzando l&#39;immagine della pila strato V neuroni piramidali, un volume 3D ricostruito dei neuroni è stato creato. La facilità con which queste immagini sono state catturate in profondità all&#39;interno del cervello di topo in alta risoluzione dopo compensazione ottica lo rende un potente strumento per studiare neuroanatomia. Tuttavia, mentre la materia grigia cancella molto bene, la profondità di immagini nel cervello è stata alla fine limitata dalla compensazione incompleta dei densi tratti di sostanza bianca vicino al centro del cervello. Questo non è un problema in altri organi. Uno svantaggio di utilizzare BABB di compensazione è che non è compatibile con i convenzionali obiettivi immersione. L&#39;indice di rifrazione del solvente che permette risultati compensazione delle aberrazioni ottiche, e il solvente può sciogliere la colla che tiene le lenti in atto nel obiettivo. Abbiamo quindi utilizzato un obiettivo macro, la Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, che combina un ~ 2 mm campo di vista con una risoluzione laterale di ~ 400 nm (1 / e raggio) e la risoluzione assiale di ~ 4.9 um (1 / raggio e). La lente ha anche un collare di correzione per compensare le aberrazioni sferiche. Tuttavia, questo obiettivoha un 22 mm di apertura posteriore e quindi non può essere facilmente adattato a sistemi standard commerciali. Una macchina potrebbe un adattatore personalizzato filo per consentire il montaggio della lente su un microscopio standard, ma si deve prestare attenzione a garantire che il profilo di fascio di eccitazione riempie l&#39;apertura posteriore il più possibile per sfruttare al massimo l&#39;apertura numerica disponibili. Anche se questo obiettivo è stato in grado di mettere a fuoco attraverso una profondità relativamente grande (circa 2 mm) senza immersione nella soluzione BABB, la sua 0.5 NA non prevede una risoluzione adeguata per spine dendritiche di imaging. Un obiettivo con una NA superiore di almeno 0,6 e ingrandimento 40X ~ è in grado di risolvere spine dendritiche. Tuttavia, si deve avere sufficiente distanza di lavoro per evitare l&#39;immersione nella soluzione BABB. Mantenendo questa distanza sarà probabilmente limitare la profondità di z-pila di immagini ben al di sotto del 2-mm profondità disponibili tramite compensazione. Va notato che la fissazione e la compensazione può aumentare il segnale di finefonti ogenous di fluorescenza. Questo è meglio evitare scegliendo più lunghezze d&#39;onda di eccitazione (&gt; 800 nm) e la selezione dei filtri di emissione per abbinare bene lo spettro di fluorescenza del colorante indicatore. Recentemente, un nuovo urea-base agente di compensazione denominata SCALE è stato dimostrato per preservare il segnale da proteine ​​fluorescenti 10, tuttavia, ci vogliono 2 settimane - 6 mesi per cancellare un campione, rispetto a qualche ora per BABB. SCALA lascia anche il tessuto molto fragile, con grandi quantità di espansione del tessuto, e l&#39;utilizzo di urea, che denatura molte proteine, è probabile che sia un problema per gli studi di follow-up con immunoistochimica. Al contrario, sebbene processo di compensazione può provocare un certo restringimento del tessuto uniforme (~ 20%), con compensazione BABB ha dimostrato di essere compatibile con lo standard 1,2 trasformazione istologica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> D8537 </td><td> 500 ml, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td> 10 x 10 ml, 16% paraformaldeide </td></tr><tr><td> Alcool etilico </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 ml, 200 prova </td></tr><tr><td> Alcool etilico </td><td> Pharmco Products, Inc. </td><td> 111000190 </td><td> 1 gallone., 190 prova </td></tr><tr><td> Alcool benzilico </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> 402834 </td><td> 500 ml, 99 +% </td></tr><tr><td> Benzoato di benzile </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> B6630-IL </td><td> 500 ml, ≥ 99% </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA obiettivo </td><td> Nikon </td><td> AZ Farina Piano 5X </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

Microscopio multifotone di fluorescenza intrinseca generazione e seconda armonica (SHG) di organi topo intero è reso possibile dal otticamente deselezionando l&#39;organo prima di imaging. 1,2 Tuttavia, per gli organi che contengono proteine ​​fluorescenti come la GFP e YFP, protocolli di compensazione ottica che utilizzano metanolo disidratazione e chiaro con alcool benzilico: benzil benzoato (BABB), mentre non protetto dalla luce 3 non preservare il segnale fluorescente. Il protocollo qui presentato è un nuovo modo in cui effettuare la compensazione intero organo ottico sul cervello di topo preservando il segnale di fluorescenza di YFP espresso nei neuroni. La modifica del protocollo ottico di compensazione in modo tale che l&#39;organo è disidratato utilizzando una serie graduata di etanolo è stato trovato per ridurre i danni alle proteine ​​fluorescenti e preservare il loro segnale fluorescente per l&#39;imaging multifotone. 4 Utilizzo di un metodo ottimizzato dei sistemi di compensazione ottica con etanolo a base di disidratazione e compensazione da BABBmentre al riparo dalla luce, si mostrano immagini ad alta risoluzione multiphoton di giallo proteina fluorescente (YFP) espressione nei neuroni di un cervello di topo superiore a 2 mm sotto la superficie del tessuto.

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Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Microscopio multifotone di organi topo intero è possibile otticamente deselezionando l&#39;organo prima di imaging, ma non tutti i protocolli di preservare il segnale fluorescente di proteine ​​fluorescenti. L&#39;utilizzo di un metodo ottico di compensazione con etanolo a base di disidratazione e alcol benzilico: benzil benzoato di compensazione, mostriamo immagini ad alta risoluzione multiphoton di cervello di topo che esprime tutta la YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Views.  Yale University. Microscopio multifotone di organi topo intero è possibile otticamente deselezionando l'organo prima di imaging, ma non tutti i protocolli di preservare il segnale fluorescente di proteine ​​fluorescenti. L'utilizzo di un metodo ottico di compensazione con etanolo a base di disidratazione e alcol benzilico: benzil benzoato di compensazione, mostriamo immagini ad alta risoluzione multiphoton di cervello di topo che esprime tutta la YFP.

Video: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Ricerca

Neuroscienze

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell&#39;orecchio interno del mouse in citometria a flusso

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...