Gostaríamos de agradecer a Jacob Solis por sua assistência em edição de vídeo. Este trabalho foi financiado em parte por uma Prêmio CARREIRA NSF DBI-0953902 a MJ Levene.

1. Perfusão Animal 5 e Compensação cérebro inteiro Rato <ol><li> O comprimento total do procedimento podem variar, dependendo do período de tempo utilizado por passo de desidratação, no total, mas de todo o processo pode ser conduzido em dois dias. </li><li> Pesar ratos YFP e em seguida profundamente anestesiar com uma injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). </li><li> Confirmar um plano cirúrgico de anestesia profunda antes de prosseguir para a cirurgia. Verifique o animal a cada 5 minutos para ver se ele reage a um dedo do pé firme ou pitada cauda. Se o animal reage, uma dose suplementar (1/3 da dose original) de cetamina / xilazina é necessária. </li><li> Uma vez anestesiados profundamente, restringir o mouse aderindo cada membro a um leito cirúrgico com fita laboratório para que o mouse está em uma posição supina (recumbancy dorsal), expondo o peito para a cirurgia. O leito cirúrgico é normalmente feita de uma malha de metal ou de plástico e colocado numa pia ou em cima de uma lipped-pan de modo que o sangue e fixadorresíduos podem ser facilmente coletados. </li><li> Para começar, fazer uma incisão abaixo do processo xifóide. Corte ao longo da base da caixa torácica utilizando tesouras e pinças e puxar a pele como o corte é feito. Fazer dois cortes ao longo de ambos os lados do esterno rato (através das costelas), para criar uma aba de tecido, que é realizada fora da cavidade torácica, usando uma pinça hemostática para deixar o coração exposto. </li><li> Inserir uma agulha de 23 g para o ventrículo esquerdo do coração e fazer uma pequena incisão na parede do músculo do átrio direito para permitir que o sangue escape. Por favor, consulte a Jove artigo 2497 para um vídeo deste procedimento. 5 </li><li> Imediatamente após o átrio direito é cortado, iniciar uma perfusão de 4 ° C com solução salina tamponada com fosfato, PBS, (pH 7,2) até que o sangue não é mais observada drenagem a partir do átrio direito do coração (30 - 40 ml a uma taxa de cerca de 5 ml / min). </li><li> Uma vez que todo o sangue foi drenado (líquido que sai do átrio direito é claro), mudar o meio de perfusão a 4% refrigeradosSolução de PFA. Perfundir até que o corpo do rato torna-se visivelmente rígido e frio ao toque (aprox. 30 - 40 ml a uma taxa de cerca de 5 ml / min). (Concentrado de 16% solução de PFA é diluída de acordo com as instruções do fabricante e é adicionado NaOH até pH 7,2 é atingida. Usar luvas e uma bata de laboratório e manipular e misturar produtos químicos dentro de um extractor de fumo.) </li><li> Após a perfusão, remover o mouse do leito cirúrgico e decapitar para começar a excisão do cérebro. </li><li> Utilizando uma pinça e tesouras da íris, remover o crânio em pequenos troços, a partir da parte de trás do crânio e avançar. Faça pequenos cortes a cada 2 - 4 mm com a tesoura em todo o crânio ao usar a pinça para retirar cuidadosamente o osso longe do cérebro em pequenos troços. Faça isso até que toda a superfície superior do cérebro está exposto. </li><li> O cérebro Excise do crânio utilizando um 5 mm de largura, e uma espátula plana lugar para um frasco de vidro. Submerge em PFA a 4% durante 6 horas a 4 ° C para a fixação de pós. </li><li> Depois de pósfixação, lavar o cérebro por duas vezes em PBS em temperatura ambiente por vazamento da PFA para fora do frasco de vidro e substituindo-o com PBS. Roda o cérebro em solução de PBS antes de derramar e substituindo com PBS para uma segunda lavagem. </li><li> Desidratar o cérebro, à temperatura ambiente por uma série graduada de etanol incubações (em vez de 50%, 70%, 95%, e duas vezes em 100%) a 2 horas, por incubação, e depois de 12 horas de incubação para o segundo o etanol a 100%, a extrair a água do tecido fixado. Para cada incubação, derramar a solução de etanol anterior a partir do frasco de vidro e substitui-lo com a solução seguinte até ao cérebro está completamente submergido. </li><li> Após a segunda incubação em etanol a 100%, derramar a solução e substitua por partes iguais de etanol e a solução de limpeza contendo álcool benzílico e benzoato de benzilo (1:2 vol: vol proporção). Após 2 h de solução de incubação, este decantar e substituir com uma solução 100% de álcool benzílico e de benzoato de benzilo (1:2 vol: vol proporção). O refraíndice ctive da solução de limpeza é n = 1,54. </li><li> Uma vez em Babb, o cérebro vai tornar-se visivelmente transparente, dentro de 4 - 5 horas. Para melhores resultados de compensação, deixe o cérebro para limpar durante 6 dias à temperatura ambiente ao mesmo tempo protegidos da luz intensa. </li></ol> 2. Configuração microscópio <ol><li> Uma vez que o cérebro é limpa e pronta para a imagiologia, apor-lo para o fundo de uma placa de Petri utilizando cianoacrilato. Permitir que o adesivo seque antes de prosseguir. </li><li> Após a secagem, submergir o cérebro em BABB e colocar a placa de Petri com o objetivo microscópio para imagens. </li><li> Usamos um microscópio multifotônica que incorpora um laser de titânio Mai Tai safira ajustável entre um nm de comprimento de onda 710-990 nm de excitação. O comprimento de onda de excitação que usamos para gerar sinais YFP é 886 nm. Laser de alimentação varia de 30-100 mW, dependendo da profundidade de imagem. </li><li> Capturar o sinal reflectido fluorescente utilizando uma objectiva Nikon 5X (NA, 0.5) que permite a amplafield-of-view de imagem (2 x 2 mm). </li><li> Filtrar o sinal reflectido fluorescente utilizando um filtro 535/50 passa-banda e recolhê-la utilizando um PMT GaAsP (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey). </li><li> Processar imagens usando software scanimage 6 em uma resolução de 2048 x 2048 pixels, usando uma taxa de varredura de 2 ms por linha para gerar imagens de alta resolução, YFP. </li><li> Uma vez que imagens estiver concluída, remova o cérebro de uma placa de Petri com pinça e armazenar em BABB protegidos da luz para imagens de futuro. Para amostras coladas, remover o tecido através da execução de uma lâmina de barbear entre a cola e a placa de Petri com um ângulo não superior a 30 graus. Temos armazenado amostras em BABB por até um ano sem degradação visível. </li></ol> 3. Resultados representativos As imagens representativas e vídeos mostrados aqui demonstram a alta resolução multifotônica capacidade de imagem possível graças compensação óptica. Imagiologia cerebral permite todopara YFP-rotulado neurônios nas diferentes camadas do hipocampo e do córtex que seja claramente visível na profundidade de 2 mm abaixo da superfície do tecido. Figura 1 mostra uma imagem representativa de uma vista coronal correspondente às características anatómicas do hipocampo a 2,92 milímetros caudal ao bregma 7. A profundidade da imagem na amostra foi 1,94 mm. Alguma desta diferença é devido à remoção do cerebelo na extremidade caudal do cérebro e o balanço foi devido ao encolhimento do processo de desidratação. Uma outra imagem da pilha mostra a camada de V / VI neurónios piramidais do neocórtex expressando YFP 2 mm abaixo da superfície do tecido (Figura 2). Todas as imagens foram obtidas usando o objetivo Nikon 5X e ampliação foi feito usando o recurso de zoom digital de aquisição de imagem em software scanimage. Por zoom sobre o neocórtex, os axônios individuais e neurônios de neurônios piramidais da camada V do neocórtex são clarasly distinguíveis-se a 1,02 mm abaixo da superfície do tecido (Figura 3). Utilizando a pilha de imagens a partir da Figura 3, uma reconstrução 3D da região neurónio foi feito utilizando o software ImageJ 8 (Figura 4). A capacidade de alta resolução do MPM também nos permite apresentar imagens de todo, os neurônios individuais. Aqui, mostramos uma reconstrução de uma camada de neurónios piramidais do neocórtex V em que os processos individuais dendríticas são claramente visíveis (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> Figura 1 Imagem representativa de uma pilha de imagens 1,2 milímetros (0,8 - 2 mm abaixo da superfície do tecido). De cérebro de rato inteiro mostrando neocórtex e as diferentes camadas do hipocampo. Características do hipocampo são visíveis 1,1 milímetros abaixo da superfície do tecido e têm sido identificadas com as seguintesing código:. DG giro = dentada, GrDG = camada granular do DG, Lmol = lacunosum moleculare camada, Mol = camada molecular DG, ou = camada oriens, PoDG = polimorfo camada DG, Py = camada de células piramidais, Rad = estrato radiatum 7 Imagem é de 1,8 x 1,8 mm de tamanho, barra de escala = 200 m. A extremidade rostral do cérebro foi fixado a uma placa de Petri com a extremidade caudal para cima para o objectivo. Isso facilitou imagens no plano coronal. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> Figura 2 moldura Representante da pilha imagem 1,2 milímetros (0,8 - 2 mm abaixo da superfície do tecido). De cérebro de rato inteiro destacando o neocórtex. Células piramidais e processos expressando YFP em camada V / VI de córtex são visíveis 2 mm abaixo da superfície do tecido. O grau de rotulagem é consistente com relatórios anteriores da rotulagem escassa no neocórtex. 9 Inset (à direita) é ampliada a partir de b<html> oxed área à esquerda. Imagem é de 1,8 x 1,8 mm de tamanho, barra de escala = 200 mM (50 mm de inserção). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> Figura 3. Moldura Representante tomadas 774 uM por baixo da superfície do tecido a partir da pilha de imagens de neurónios da camada V piramidais no neocórtex do cérebro. Stack vai de 700 mm a 1020 uM abaixo da superfície do tecido. Um zoom digital 8X foi usado para capturar detalhes como processos de multa. Imagem é de 225 x 225 M em tamanho, barra de escala = 20 um. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem representativa de reconstrução 3D (225 x 225 x 320 mm) da pilha de imagem da Figura 3. Imagem é de 225 x 225 M em tamanho, barra de escala = 28 uM. s &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> Figura 5. De alta resolução de imagem reconstruído de uma camada de neurónios piramidais do neocórtex V utilizando um zoom digital de 10x. Neurônio mede 485 mM de comprimento, barra de escala = 25 um. O campo de visão de cada telha imagem é 180 um x 180 jam. Cada telha é, a uma profundidade diferente (z-nível). As dendrites apicais corticais não, de um modo geral, YFP express, bem como a soma. Para ter os dois no mesmo campo de visão, como mostrado aqui, o poder foi reduzido para minimizar a saturação da soma, o que torna o dimmer olhar fino processo. Nossa ênfase aqui foi em demonstrar campo de visão, ao invés de detalhes. Para revelar detalhes mais finos, usar um zoom digital, foco em uma região sem soma, e aumentar a potência do laser.

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	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Care da Universidade de Yale animal Institucional e Comitê de uso.

Enquanto padrão corantes orgânicos são compatíveis com uma variedade de solventes orgânicos, e, portanto, não representam um desafio especial para limpar os protocolos, as proteínas fluorescentes são menos tolerantes a mudanças em solvente. 4 O objetivo do presente trabalho foi o de superar uma séria limitação ópticos anteriores protocolos de compensação onde fluorescência de XFPs foi perdida ou seriamente prejudicado. As imagens que são aqui apresentados demonstram que a fluorescência de YFP foi preservada. A técnica de limpeza óptico descrito aqui permite imagens de alta resolução de neurônios YFP-rotulados em cérebro de camundongo inteiro até 2 mm abaixo da superfície do tecido. Usando a desidratação de etanol, como demonstrado anteriormente, também irá preservar verde e vermelho sinais de proteínas fluorescentes. 4 As imagens mostradas aqui demonstrar como esta técnica de compensação óptica pode ser aplicada ao estudo de regiões inteiras de órgãos, tais como o hipocampo e neocórtex que expressam proteínas fluorescentes. O elevado-Resolution capacidade de microscopia multifotônica também permite a ampliação clara de células específicas ou áreas de interesse dentro da região de órgãos. Os pontos-chave para a preservação da fluorescência de proteínas são para evitar o excesso de fixação, para cuidar que o fixador e todas as soluções são mantidas a cerca de pH neutro, para usar etanol em vez de metanol para a desidratação, e para armazenar as amostras no escuro. Embora nós demonstramos aqui a utilização de compensação óptica para imagiologia do cérebro de rato, a técnica é geralmente aplicável para a maioria dos órgãos. Neste estudo, mostrou imagens de alta resolução de regiões cerebrais inteiras do mouse (neocórtex e hipocampo) e neurônios específicos dentro da camada V do neocórtex (a linha do mouse Thy1-YFPH rótulos células piramidais no hipocampo e pouco no neocórtex, 9 de outras regiões aparecem escuras.). Utilizando a pilha de imagens de neurónios da camada V piramidais, um volume 3D reconstruídas dos neurónios foi criado. A facilidade com which essas imagens foram captadas no interior do cérebro do rato em alta resolução, após compensação óptica torna esta uma ferramenta poderosa para o estudo de neuroanatomia. No entanto, ao passo que a matéria cinzenta extremamente bem limpa, a profundidade de imagem no cérebro foi finalmente limitado pela limpeza incompleta de densas tratos de substância branca, perto do centro do cérebro. Este não é um problema em outros órgãos. Uma desvantagem do uso de BABB para compensação é que não é compatível com os objectivos de imersão convencionais. O elevado índice de refracção do solvente, que permite a compensação de resultados em aberrações ópticas, e o solvente pode dissolver a cola que mantém as lentes em lugar do objectivo. Por conseguinte, utilizada uma lente macro, a Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, que combina um ~ 2 mm de campo de visão com uma resolução lateral de ~ 400 nm (1 / e raio) e resolução axial de ~ 4,9 uM (1 raio / e). A lente também possui um anel de correcção para compensar a aberração esférica. No entanto, esta lentetem uma abertura traseira de 22 mm e, por conseguinte, não pode ser facilmente adaptado a sistemas comerciais padrão. Uma máquina poderia um adaptador de rosca personalizado para permitir a montagem da lente, a um microscópio padrão, mas deve ser tomado cuidado para assegurar que o perfil do feixe de excitação enche a abertura para trás o mais possível de fazer o uso máximo da abertura numérica disponível. Embora esta lente foi capaz de focar a uma profundidade relativamente grande (~ 2 mm) sem imersão na solução BABB, sua 0,5 NA não fornece resolução suficiente para espinhas dendríticas de imagem. Uma lente com uma maior NA de pelo menos 0,6 e uma ampliação de 40X ~ é capaz de resolver as espinhas dendríticas. No entanto, deve ter a distância de trabalho suficiente para evitar a imersão na solução BABB. Mantendo esta distância será provavelmente limitar a profundidade da imagem z-stack bem abaixo da profundidade de 2 mm disponível através de compensação. Deve notar-se que a fixação e de compensação pode aumentar o sinal de términoogenous fontes de fluorescência. Isto deve ser evitado escolhendo comprimento de onda de excitação-(&gt; 800 nm) e uma selecção cuidadosa de filtros de emissão de bem corresponder o espectro de fluorescência do corante indicador. Recentemente, um novo agente de limpeza de ureia-base referida como escala tem sido demonstrado para preservar o sinal a partir de proteínas fluorescentes 10, no entanto, leva 2 semanas - 6 meses para limpar uma amostra, em comparação com algumas horas para BABB. ESCALA também deixa o tecido muito frágil, com uma grande quantidade de expansão do tecido, bem como a utilização de ureia, o que desnatura muitas proteínas, é susceptível de ser problemática para os estudos de imuno-histoquímica utilizando. Em contraste, o processo de limpeza, embora possa levar a um certo encolhimento do tecido uniforme (~ 20%), limpando com BABB tem sido mostrado para ser compatível com 1,2 processamento histológico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Solução salina tamponada com fosfato </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> D8537 </td><td> 500 ml, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> 10 x 10 ml de paraformaldeído, 16% </td></tr><tr><td> Álcool etílico </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 ml, 200 proof </td></tr><tr><td> Álcool etílico </td><td> Pharmco Products, Inc. </td><td> 111000190 </td><td> 1 gal., 190 provas </td></tr><tr><td> O álcool benzílico </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> 402834 </td><td> 500 ml, 99% + </td></tr><tr><td> Benzoato de benzilo </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> B6630-IL </td><td> 500 ml, 99% ≥ </td></tr><tr><td> 5X/0.5 objetivo NA </td><td> Nikon </td><td> AZ Farinha Plano de 5X </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

Microscopia Multiphoton de geração de fluorescência intrínseca e segunda harmónica (SHG) de órgãos inteiros de rato é possível graças opticamente limpeza do órgão, antes de imagem. 1,2 No entanto, para os órgãos que contêm proteínas fluorescentes, tais como GFP e YFP, protocolos de compensação ópticos que usam metanol desidratação e clara usando álcool benzílico: benzoato de benzila (BABB) enquanto desprotegido de 3 luz não preservam o sinal fluorescente. O protocolo aqui apresentado é uma nova forma em que para realizar compensação órgão inteiro óptico no cérebro do rato, preservando o sinal de fluorescência de YFP expressa em neurónios. A modificação do protocolo de compensação óptica de tal modo que o órgão é desidratado usando uma série graduada de etanol foi encontrada para reduzir os danos para as proteínas fluorescentes e preservar o seu sinal fluorescente para imagiologia multifotônica. 4 Utilizando um método optimizado de compensação óptica com base de etanol e de desidratação desmatamento por BABBenquanto protegida da luz, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de proteína fluorescente amarela expressão (YFP), nos neurónios do cérebro de um rato mais de 2 mm abaixo da superfície do tecido.

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Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K visualizações.  Yale University. Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

Vídeo: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Neurociência

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

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