Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center di Berlino) per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal centro di ricerca collaborativa (SFB665) del Consiglio di ricerca tedesco (DFG).

1. Dissezione procedura Nota: l&#39;uso sperimentale di topi dovrebbe seguire ufficialmente approvato le linee guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. <ol><li> Prima della preparazione, impostare il microscopio da dissezione e disporre gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione tra cui forbici grandi e piccole, grandi pinza dentata, pinze curve e quattro set di Dumont n.5 dissezione pinze (di cui due con dentro-lucido punte) ( Per i dettagli si veda la tabella di reagenti e attrezzature specifiche). Mettere un foglio di carta da filtro in un 100-mm Sylgard rivestite piastra di Petri. Versare PBS freddo nei pozzetti di una piastra ben 12, un 100-mm Petri e un tubo di 12 ml e lasciare sul ghiaccio. Pipettare 2 ml di tampone di fissaggio (4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4) in ciascun pozzetto di secondo a 12 pozzetti e posto sul ghiaccio. </li><li> Dopo anestesia, il sacrificio della diga a tempo incinta E12.5 (rilevamento di plug vaginale è stato designato come E0.5), posizionare il mousecon il suo lato ventrale fino a tre fogli di carta assorbente e bagnare la zona addominale con etanolo al 70%. </li><li> Aprire la cavità addomino, isolare le corna bilaterale uterina e trasferirli in uno dei piatti da 100 mm con gelida PBS. </li><li> Sotto il controllo microscopico, fare una incisione longitudinale della parete uterina con le piccole, le forbici e tagliare subito via ogni sacco amniotico della placenta. </li><li> Sbucciare via il sacco amniotico da ciascun embrione e tagliare il cordone ombelicale. </li><li> Utilizzando piccole forbici, decapitare gli embrioni e mettere la testa o una parte di essi da parte per l&#39;isolamento di DNA genomico se la genotipizzazione dovrebbe essere richiesto. Successivamente, il trasferimento Torsi nei pozzetti rispettivi del 12-pozzetti con PBS freddo. </li><li> Bagnare la carta da filtro nel piatto Sylgard con qualche goccia di PBS e posizione di un torso embrionale con il suo lato dorsale fino sulla carta. Per una migliore stabilità, raddrizzare la coda e le estremità lontano dal corpo. </li><li> Lavorosotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 16x, con attenzione pizzicare la pelle di un embrione al di sopra del midollo spinale con due paia di pinze a punta sottile e delicatamente a pezzi. A partire dalla metà, procedere in primo luogo verso la coda e poi ripresa dalla metà verso il lato anteriore. </li><li> Bagnato l&#39;embrione di volta in volta con due o tre gocce di PBS per evitare che si secchi. </li><li> Per evitare che DRG sono strappato fuori dal midollo spinale, quando viene rimosso dall&#39;embrione staccare il DRG e il midollo spinale dalla colonna circostante cartilagineo vertebrale del movimento a scorrimento orizzontale con la lama di una pinza sottile con dentro-lucido punte. A partire dalla metà del lato destro dell&#39;embrione, il lavoro la strada verso la coda e poi alla fine anteriore. In seguito, ripetere la procedura sul lato opposto. Fare attenzione a non strappare il DRG associati. </li><li> Per staccare completamente il midollo spinale allentato dall&#39;embrione, sollevare la sua cervicoAl parte con una pinza sottile ed estrarlo in un unico pezzo verso il suo fine caudale. </li><li> Immergere il midollo spinale isolato con DRG attaccato in un pozzo di 12-pozzetti riempiti con tampone di fissaggio e procedere con la preparazione del midollo spinale da embrioni restanti. </li><li> Fissare midollo spinale almeno due ore sul ghiaccio. </li></ol> 2. DII-etichettatura dei neuroni DRG <ol><li> Per ogni midollo spinale di essere etichettati, preparare due aghi di vetro con un estrattore micropipetta. Noi utilizziamo un modello di Sutter P-97 elettrodo estrattore (impostazione di programma: 1 CALORE = 625, VEL = 35, TEMPO = 175, 2 CALORE = 600, VEL = 25, TEMPO = 175, 3 CALORE = 630, VEL =... 30, TEMPO = 150). </li><li> Sotto il controllo microscopico intingere nell&#39;acqua la punta di ogni ago di vetro tre a cinque volte in un (w / v) di soluzione al 5% del DII in etanolo. Evaporazione dell&#39;etanolo crea un sottile strato di cristalli Dii sul ferro. </li><li> Lavorando sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 40x, mettere un midollo spinale con la sua vlato entral su una diapositiva. Utilizzando forbici primavera, aprire il cordone sul lato ventrale in tutta la sua lunghezza, tagliando attraverso il fondello per consentire il successivo montaggio della preparazione di un libro aperto rovesciato modalità (vedi sezione C). </li><li> Posizionare il midollo spinale con la parte dorsale su una diapositiva. Poi manualmente il cavo di approccio con il DII coperte punta dell&#39;ago di vetro sotto la visualizzazione microscopica e con attenzione perforare ogni DRG secondo su un lato del midollo spinale. Quasi nessuna traccia di Dii dovrebbe essere visibile nella DRG trafitto per assicurare l&#39;etichettatura di solo un piccolo numero di neuroni. Prendete un secondo ago per l&#39;altro lato del cavo. Mirando solo ogni DRG secondo evita una sovrapposizione di proiezioni etichettati assonale da DRG vicini che potrebbero complicare la differenziazione dei singoli assoni. </li><li> Ritorno il midollo spinale al buffer fissazione e incubare al buio per almeno sei ore a temperatura ambiente o notte a 4 ° C per dare tempo per la tintura di diffuse lungo l&#39;assone all&#39;interno della membrana plasmatica. Lasciare per un periodo di incubazione più lungo (fino a due giorni a 4 ° C) se l&#39;analisi della crescita collaterali nel midollo spinale è voluta. </li></ol> 3. Analisi di montaggio e microscopiche <ol><li> A seguito di tintura diffusione, la posizione di una sola corda spinale con il suo lato dorsale verso il basso su un vetrino in una goccia di PBS. Fare attenzione che i DRG collegati siano correttamente orientati lateralmente e non si mescolano. Aspirare il liquido in eccesso e appiattire il cavo in un libro aperto rovesciato modalità con pinze. </li><li> Montare la preparazione su un vetrino da microscopio utilizzando PBS. </li><li> Per evitare l&#39;aumento della colorazione di fondo indesiderati analisi microscopica di fluorescenza etichettati proiezioni assonale deve essere effettuata il giorno del montaggio. Fino ad allora tenere le diapositive al buio a 4 ° C. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Il midollo spinale del mouse riceve afferente projections da 8 coppie di cervicale, 13 paia di toracici, 5 paia di paia lombare e 4 del DRG sacrale per un totale di 60 gangli spinali. Dopo un po &#39;la formazione di un midollo spinale con la maggior parte DRG ancora attaccato può essere isolato da un embrione in meno di cinque minuti. Questa procedura è adatta per l&#39;isolamento di midollo spinale con DRG attaccato da E11.5 E13.5 a embrioni di topo. Tuttavia, i risultati migliori sono ottenuti da E12.5. Risultati esemplare della procedura di etichettatura descritti qui sono mostrati in Figura 3. L&#39;etichettatura dei DRG su tutta la lunghezza del midollo spinale può quindi essere utilizzato per quantificare il comportamento ramificazione degli assoni a diversi livelli vertebrali (Fig. 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> Figura 1. Schema raffigurante le due principali modalità di diramazione assonale. (A) Branching dalle attività del cono di crescita che potrebbe portare a una biforcazione - come indicato qui - così come pergole terminale complessi o(B) formazione collaterale all&#39;albero assone (interstiziale ramificazione). Quest&#39;ultima modalità è il tipo dominante ramificazione di proiettare assoni corticali e talamocorticale 6,7. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> Figura 2 proiezioni afferenti di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale visualizzare entrambi i tipi di ramificazione assonale:. Ramo assoni prima volta al DREZ di biforcazione (1) e dalla risultante figlia forma rami collaterali dopo un periodo di attesa di interstiziale ramificazione (2). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> Figura 3. Visualizzazione di singole traiettorie degli assoni dei neuroni embrionali DRG del mouse. (A) del midollo spinale con DRG allegato preparato da un embrione E12.5 mouse. (Bar Scala, 1 mm.) (BD) viste dorsali di DII marcato DRG di topi wild-type con un ingrandimento maggiore sono mostrati. In B ogni DRG secondo è labeled di DII. Immagini di fluorescenza sono invertite, caudale è a sinistra e in C e D, laterale è in fondo. In C un piccolo numero di assoni è etichettato e ad un maggiore ingrandimento la presenza di T-come i rami possono essere identificati nel DREZ del midollo spinale. (Bar Scala, 250 micron (B), 100 micron (C) e 50 micron (D).) <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificazione dei rami a forma di T, singolo turno rostrale o caudale nel wild-type e C-peptide natriuretico di tipo (CNP) topi con deficit a E13.5. Il numero di assoni singolo contati sono riportati tra parentesi per i livelli di tronco diverso per ogni genotipo. C-o-R si trasforma - la crescita solo in direzione caudale e rostrale, rispettivamente. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> Figura 5. Un cGMP segnalazione innesca biforcazione sensoriale assone al DREZ del midollo spinale. (A) Schema divia di segnalazione cGMP composto da CNP ligando, il recettore guanylyl ciclasi Npr2 e la serina / treonina chinasi cGKIα nei neuroni DRG embrionale. Npr2 genera cGMP dal GTP su stimolazione da parte di CNP. (B) DII tracciamento degli assoni dei singoli DRG neuroni nei topi wild-type e CNP-carenti. (Bar Scala, 25 micron).

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	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Modelli stereotipati di proiezione che comprende entrambi i tipi di formazione ramo assonale insieme a facilità di preparazione, in combinazione con l&#39;uso di tessuto fissato per Dii etichette rende il midollo spinale embrionale con allegato un modello DRG favorevole per lo studio assonale ramificazione. L&#39;applicazione di piccole quantità di Dii con aghi di vetro rivestito permette - in contrasto con l&#39;etichettatura maggior parte dei DRG - la visualizzazione di piccoli gruppi di neuroni DRG e quindi l&#39;analisi dei singoli assoni e dei loro modelli di diramazione. Il metodo descritto potrebbe essere ulteriormente migliorata mediante iniezione iontoforetica del tracciante lipofilo che riduce ulteriormente il numero di neuroni etichettati 8. Tuttavia, questo sarebbe più tempo. Etichettatura Dii di singole traiettorie assonale nella preparazione montare tutto il midollo spinale embrionale è stato fondamentale per l&#39;identificazione di un cGMP segnalazione cascata comprende il CNP ligando, il suo recettore Npr2, e lachinasi cGMP-dipendente cGKIα - che regola un tipo di ramificazione assonale: la biforcazione del DRG neuroni al DREZ 4,5,9-12. In contrasto con il wild-type, gli assoni dei neuroni DRG in cGMP mutanti di segnalazione svolta in una sola direzione, invece di biforcano al DREZ (Fig. 5). Questi studi hanno anche rivelato che la formazione di garanzia non è stata influenzata in cGMP mutanti di segnalazione che indicano che questo secondo tipo di formazione ramo osservato nei neuroni DRG è diversamente regolata 4. In alternativa, il comportamento ramificazione dei singoli assoni DRG può anche essere studiato nelle linee di topo transgenico che ha espresso una proteina fluorescente solo in un piccolo sottogruppo di neuroni DRG 13 o contenenti una combinazione di marcatori fluorescenti che permette di distinguere tra i singoli neuroni 14. Tuttavia, lo sforzo per incrociarsi il modello di topo mutante da analizzare con le linee del mouse fluorescente deve essere considerato. Inoltre, grazie al promotore (Thy1) espressione usata delle proteine ​​fluorescenti nelle linee di topo transgenico inizia solo in una fase post-natale che rende difficile sapere se un fenotipo osservato ramificazione è il risultato della formazione di ramo di compromissione durante lo sviluppo embrionale o una degenerazione più tardi processo, invece. Al contrario, Dii etichettatura dei DRG embrionale ha il vantaggio di studiare il processo di ramificazione degli assoni e la sua interruzione in mutanti di topo appropriate al momento in cui si verifica assonale ramificazione. Preparazioni a base di midollo spinale embrionale con DRG allegato potrebbe essere ulteriormente utilizzati per le procedure di etichettatura altri (montaggio intero ibridazione in situ, o LacZ-AP-colorazione di topi transgenici), raccolta di midollo spinale e del tessuto DRG per la RNA-isolamento, o con gli opportuni adeguamenti alle condizioni sterili per gli esperimenti di colture di tessuti e applicazioni a valle, come immagini di calcio o le misurazioni elettrofisiologiche.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio Stemi RDC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standard di forbici chirurgiche </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dentata pinze di serie </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra forbici iris multa </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 multa suggerimenti pinze </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 finitura a specchio forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs-Tübingen primavera forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro di carta </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Mondo precission Instruments </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm Petri </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml di tubo in polipropilene </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12-lastra e cultura </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipetta estrattore P-97 </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive SuperFrost Plus. </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro di copertura scivola </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870,2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Qui vi presentiamo una tecnica per etichettare le traiettorie di piccoli gruppi di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale dalla colorazione diffusivo utilizzando il tracciante lipofilo 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . Il confronto di percorsi assonale di wild-type con quelli di topi in cui sono mutati i geni consente di testare per un ruolo funzionale delle proteine ​​candidato nel controllo della ramificazione degli assoni che è un meccanismo essenziale per il cablaggio del sistema nervoso. Assonale ramificazione permette ad un singolo neurone per connettersi con bersagli multipli, fornendo così le basi fisiche per l&#39;elaborazione parallela di informazioni. Ramificazioni in regioni obiettivo intermedio di crescita assonale può essere distinto da arborizzazione terminale. Inoltre, diverse modalità di formazione ramo assonale possono essere classificati a seconda che i risultati ramificazione delle attività del cono di crescita (splitting o reggiseno in ritardonching) o lo sbocciare di collaterali dal pozzo assone in un processo chiamato interstiziale ramificazione 2 (Fig. 1). Le proiezioni centrali dei neuroni dal DRG offrire un utile sistema sperimentale per studiare entrambi i tipi di ramificazione assonale: quando i loro assoni afferenti raggiungere la dorsale zona di ingresso principale (DREZ) del midollo spinale embrionale tra i giorni 10-13 (E10 - E13) che visualizzare un modello stereotipato di T-o Y biforcazione. I due assoni figlia risultante quindi procedere in direzione rostrale o caudale, rispettivamente, al margine dorsolaterale del midollo e solo dopo un periodo di attesa collaterali germogliano da queste assoni staminali di penetrare la materia grigia (interstiziale ramificazione) e il progetto di neuroni in specifiche relè lamine del midollo spinale, dove ulteriori arborize (ramificazione terminale) 3. Tracciati DII hanno rivelato coni di crescita nella zona dorsale voce principale del midollo spinale che sembrava essere in process della scissione suggerendo che biforcazione è causata dalla scissione del cono di crescita in sé 4 (Fig. 2), tuttavia, altre opzioni sono state discusse anche 5. Questo video dimostra come prima di sezionare il midollo spinale dei topi E12.5 lasciare il DRG allegato. A seguito di fissazione degli importi piccolo campione di DII vengono applicati a DRG con aghi di vetro tirato da tubi capillari. Dopo una fase di incubazione, il midollo spinale è montato etichettato come un libro aperto rovesciato preparazione di analizzare i singoli assoni usando la microscopia a fluorescenza.

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DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.

DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.

Video: DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

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Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...