الكتاب أود أن أشكر الدكتور أليستير Garratt (دلبروك مركز برلين) للحصول على تعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل مركز البحوث التعاونية (SFB665) التابع لمجلس البحوث الألمانية (DFG).

1. التشريح الداخلي ملاحظة : استخدام التجريبي من الفئران يجب أن تتبع مبادئ توجيهية وافق رسميا لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التحضير وإعداد مجهر تشريح الخاص ووضع الأدوات الجراحية اللازمة لتشريح بما مقص الكبيرة والصغيرة ، ملقط مسنن كبيرة ، ملقط المنحنية وأربع مجموعات من No.5 دومون تشريح ملقط (اثنان منها داخل مصقول نصائح) ( لمزيد من التفاصيل انظر جدول الكواشف محددة والمعدات). وضع ورقة تصفية في طبق بيتري 100 ملم Sylgard المغلفة. صب الباردة PBS في الآبار لوحة 12 - جيدا ، وطبق بتري 100 ملم وأنبوب 12 مل وترك على الجليد. ماصة 2ml العازلة من التثبيت (بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4) في كل جانب من لوحة ال 12 ثانية وكذلك مكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التخدير والتضحية السد حامل في توقيت E12.5 (عين الكشف عن المكونات المهبلية كما E0.5) ، ضع الماوسمع ما يصل به الجانب البطنية على ثلاث ورقات من المناشف الورقية ، ونقع في منطقة البطن مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح تجويف بطني حوضي ، عزل قرون الثنائية الرحم وتحويلها الى واحدة من الأطباق 100 ملم مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت رقابة مجهرية ، وجعل شق طولي لجدار الرحم مع مقص ، وقطع صغيرة على التوالي بعيدا كل كيس من المشيمة الذي يحيط بالجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعيدا الكيس السلوي من كل جنين وقطع الحبل السري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص صغير ، تقضي على الأجنة ووضع رؤساء أو جزء منها جانبا لعزل الحمض النووي الجيني إذا كان يجب أن تكون هناك حاجة التنميط الجيني. بعد ذلك ، نقل إلى torsi آبار منها في لوحة ال 12 جيدا مع PBS الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب ورقة الترشيح في صحن Sylgard مع بضع قطرات من برنامج تلفزيوني والجذع الجنينية ظل وضع مع الجانب الظهري حتى على الورق. من أجل تحسين الاستقرار ، وتصويب ذيله والأطراف بعيدا عن الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عاملتحت المجهر تشريح مع التكبير من 16X تقريبا ، قرصة بعناية جلد الجنين فوق الحبل الشوكي مع اثنين من أزواج من الغرامة ويميل ملقط المسيل للدموع وبصرف النظر برفق. بداية في الوسط ، والمضي قدما أولى نحو الذيل ومن ثم استئناف من الوسط باتجاه الجانب الأمامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب الجنين من وقت لآخر مع اثنين أو ثلاث قطرات من برنامج تلفزيوني لمنعها من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وteared لمنع ذلك DRG الخروج من النخاع الشوكي عند إزالته من الجنين فصل DRG والنخاع الشوكي من العمود الفقري الغضروفية المحيطة الحركات الأفقية التي تنزلق مع شفرة لملقط مع غرامة داخل مصقول النصائح. تبدأ في منتصف الجانب الأيمن للجنين ، والعمل طريقك نحو الذيل ثم إلى نهاية الأمامي. بعد ذلك ، كرر العملية على الجانب الآخر. يجب الحرص على عدم مزق قبالة DRG المرتبطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل تماما الحبل الشوكي خففت من الجنين ، والتقاط العنق والخمسينآل جزء مع ملقط الجميلة وتخلعها في قطعة واحدة نحو نهايته الذيلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغرق الحبل الشوكي معزولة مع DRG تعلق في بئر من لوحة ال 12 مليئة جيدا العازلة التثبيت والمضي قدما في إعداد النخاع الشوكي من الأجنة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الحبل الشوكي ما لا يقل عن ساعتين على الجليد. </li></ol> 2. الجاذبة وضع العلامات من الخلايا العصبية DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الحبل الشوكي التي يتم وسمها ، وإعداد الإبر الزجاج اثنين مع مجتذب micropipette. نحن نستخدم نموذج سوتر مجتذب P - 97 مسرى (إعداد البرنامج : 1 HEAT = 625 ، فيل = 35 ، TIME = 175 ؛ HEAT 2 = 600 ، فيل = 25 ، TIME = 175 ؛ 3 HEAT = 630 ، فيل =... 30 ، الوقت = 150). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت رقابة مجهرية تراجع غيض من كل إبرة الزجاج 3-5 مرات في الحل (ث / ت) 5 ٪ من الجاذبة في الإيثانول. تبخر الإيثانول يخلق طبقة رقيقة من بلورات الجاذبة على الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعمل تحت مجهر تشريح مع التكبير من 40X تقريبا ، وضع الحبل الشوكي مع v لهاentral الجانب حتى على شريحة. باستخدام مقص الربيع ، وفتح الحبل على الجانب البطنية على طوله كله من خلال قطع floorplate لتسمح في وقت لاحق من تزايد اعداد في وضع مقلوب كتاب مفتوح (انظر الفرع جيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف النخاع الشوكي مع الجانب الظهري حتى على شريحة. ثم سلك نهج يدويا مع طرف الجاذبة مغطاة من الزجاج تحت التصور إبرة مجهرية وبعناية يخترق كل DRG الثاني على أحد جانبي الحبل الشوكي. وينبغي أن ما يقرب من أي آثار للالجاذبة تكون مرئية في DRG مثقوبة لضمان وضع العلامات على عدد صغير فقط من الخلايا العصبية. أخذ إبرة الثاني لفي الجانب الآخر من السلك. تهدف فقط كل DRG second يتجنب تداخل إسقاطات محواري المسمى من DRG المجاورة التي قد تعقد في التفريق بين محاور فردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الحبل الشوكي إلى المخزن المؤقت التثبيت واحتضان في الظلام لمدة ست ساعات على الأقل عند درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لإعطاء الوقت للصبغة لديffuse على طول المحور العصبي داخل غشاء البلازما. السماح لفترة أطول الحضانة (ما يصل الى يومين في 4 درجات مئوية) وإذا كان المطلوب تحليل النمو الجانبية في الحبل الشوكي. </li></ol> 3. التركيب والتحليل المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد صبغ الموقف ، ونشر الحبل الشوكي واحد مع الجانب الظهري أسفل على ساترة في قطرة من برنامج تلفزيوني. تعتني أن DRG المرفقة الموجهة بشكل صحيح وأفقيا لا تختلط لا. نضح السوائل الزائدة وتتسطح بها الحبل في وضع مقلوب كتاب مفتوح باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل التحضير على شريحة المجهر باستخدام برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي لمنع زيادة غير مرغوب فيها تحليل الخلفية تلطيخ المجهري مضان من الإسقاطات محواري المسمى ستنفذ يوم المتزايدة. حتى تبقي ثم الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. ممثل النتائج : الحبل الشوكي من الفأرة يستقبل الأسبوعية واردojections من 8 أزواج من عنق الرحم ، و 13 زوجا من الصدر ، و 5 أزواج من أزواج القطنية والعجزية DRG 4 من مجموعها إلى 60 العقد الشوكي. ويمكن بعد بعض التدريب يمكن عزل الحبل الشوكي مع معظم DRG لا تزال تعلق من جنين في أقل من خمس دقائق. يناسب هذا الإجراء لعزل النخاع الشوكي مع DRG المرفق من E11.5 لأجنة الفئران E13.5. ومع ذلك ، يتم تحقيق أفضل النتائج من E12.5. وتظهر النتائج المثالية لإجراء التوسيم وصفها هنا في الشكل 3. ثم قد وسم DRG على طول الحبل الشوكي يمكن استخدامها لتحديد المحاور المتفرعة السلوك على مستويات مختلفة الفقري (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط تصور وضعي الرئيسية المتفرعة من المحاور. (أ) المتفرعة من أنشطة مخروط النمو الذي يمكن أن يؤدي إلى التشعب -- كما هو مبين هنا -- فضلا عن العرش محطة معقدة أو(ب) تشكيل الجانبي في العمود محوار (الخلالي المتفرعة). الوضع الأخير هو نوع من الهيمنة المتفرعة إسقاط المحاوير القشرية والمهادي 6،7. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> الشكل 2 إسقاطات وارد من الخلايا العصبية DRG في النخاع الشوكي الجنينية عرض كلا النوعين من المتفرعة المحاور : المحاور أول فرع في DREZ بواسطة التشعب (1) وشكل من ابنة الناتجة الضمانات فروع بعد فترة الانتظار التي المتفرعة الخلالي (2). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> الشكل 3. التصور مسارات محواري واحدة من الخلايا العصبية الجنينية DRG الماوس. (أ) مع الحبل الشوكي DRG المرفقة أعدت من جنين فأر E12.5. وترد (شريط المقياس ، 1 ملم.) دينار بحريني () آراء الظهرية من الجاذبة المسمى DRG البرية من نوع الفئران في زيادة التكبير. باء في كل DRG الثاني هو labeleد بواسطة الجاذبة. هي مقلوب الصور مضان ، عجزي هو في اليسار وجيم ودال ، الوحشي هو في القاع. C هو المسمى في عدد صغير من المحاور وعلى أعلى التكبير ويمكن تحديد وجود مثل T - فروع في DREZ من الحبل الشوكي. (أشرطة مقياس ، 250 ميكرون (B) ، و 100 ميكرومتر (C) و 50 ميكرون (D)). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> الشكل 4. الكمي لشكل T والفروع ، واحد يتحول منقاري أو الذيلية في نوع البرية ونوع C - الناتريوتريك الببتيد (CNP) الفئران التي تعاني من نقص في E13.5. ونظرا لعدد واحد يحسب المحاوير بين قوسين لمستويات مختلفة لكل الجذع الوراثي. C - R - أو يتحول -- النمو فقط في اتجاه والذيلية أو منقاري ، على التوالي. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> الشكل 5. مسار المركب والإشارات الحسية مشغلات محوار التشعب في DREZ من الحبل الشوكي. (أ) من نظاميشير المسار المركب يتكون من CNP يجند ، ومستقبلات غوانيليل Npr2 محلقة وسيرين / ثريونين cGKIα كيناز DRG في الخلايا العصبية الجنينية. Npr2 يولد المركب من GTP على التحفيز التي CNP. (ب) الجاذبة تتبع واحدة من محاور الخلايا العصبية في الفئران DRG من النوع البري وCNP ناقصة. (شريط قياس ، 25 ميكرون).

<ol>
	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

أنماط الإسقاط النمطية التي تضم كلا النوعين من تشكيل فرع محواري مع سهولة التحضير في تركيبة مع استخدام الأنسجة الثابتة لوصفها الجاذبة يجعل الحبل الشوكي الجنينية المرفقة مع نموذج DRG مواتية لدراسة المحاور المتفرعة. تطبيق كميات ضئيلة من الجاذبة باستخدام الإبر الزجاج المطلي يسمح -- على النقيض من معظم العلامات DRG -- التصور مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية وبالتالي DRG تحليل المحاور الفردية وأنماطها المتفرعة. ويمكن وصف طريقة تحسينها عن طريق الحقن iontophoretic من التتبع محبة للدهون مما يقلل زيادة عدد الخلايا العصبية المسماة 8. ومع ذلك ، فإن هذا سيكون أكثر استهلاكا للوقت. وكان صلاح الغيدان وسم مسارات محواري واحد في جبل الاستعدادات كاملة من النخاع الشوكي الجنينية دورا أساسيا في التعرف على المركب الذي يشتمل على إشارة تتالي CNP يجند ، ومستقبله Npr2 ، والمركب التي تعتمد على cGKIα كيناز -- الذي ينظم نوع واحد من المحاور المتفرعة : والتشعب من الخلايا العصبية في DRG DREZ 4،5،9-12. على النقيض من المحاور والبرية من نوع من الخلايا العصبية في المركب DRG المسوخ يشير بدوره إلا في اتجاه واحد ، بدلا من bifurcating في DREZ (الشكل 5). وكشفت هذه الدراسات أيضا أنه لا يتأثر تشكيل الجانبي المركب في المسوخ إشارات تشير إلى أن ينظم بشكل مختلف عن النوع الثاني من تشكيل فرع لوحظ في الخلايا العصبية DRG 4. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا السلوك المتفرعة من المحاور DRG واحد يكون درس في خطوط الماوس المعدلة وراثيا إما التعبير عن بروتين فلوري في مجموعة فرعية صغيرة فقط من DRG الخلايا العصبية (13) أو التي تحتوي على مزيج من علامات الفلورسنت الذي يسمح احد للتمييز بين الخلايا العصبية الفردية 14. ومع ذلك ، فإن الجهد لعبور تولد نموذج الفأر الطافر لتحليلها مع خطوط الماوس الفلورسنت لابد من النظر. وعلاوة على ذلك ، ونظرا لpromotor (Thy1) التعبير المستخدم من البروتينات الفلورية في خطوط الماوس المعدلة وراثيا لن تبدأ إلا في مراحل ما بعد الولادة مما يجعل من الصعب معرفة ما إذا كان النمط الظاهري لاحظ المتفرعة هو نتيجة لتشكيل فرع ضعاف أثناء التطور الجنيني أو انحطاط في وقت لاحق عملية بدلا من ذلك. في المقابل ، صلاح الغيدان توسيم DRG الجنينية تتمتع بميزة لدراسة عملية المتفرعة محواري والتعطيل في المسوخ الماوس المناسبة في الوقت الذي المتفرعة محواري يحدث. قد يكون من النخاع الشوكي الاستعدادات الجنينية مع DRG المرفقة المستخدمة لمزيد من الإجراءات الأخرى وضع العلامات (جبل بأكمله في الموقع التهجين ، أو LacZ AP - تلطيخ من الفئران المعدلة وراثيا) ، وجمع من النخاع الشوكي والأنسجة DRG عن الحمض النووي الريبي والعزل ، أو عندما تكيف لظروف معقمة للتجارب زراعة الأنسجة وتطبيقاتها المصب مثل الكالسيوم أو التصوير القياسات الكهربية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> Stereomicroscope Stemi جمهورية الكونغو الديمقراطية </td><td> زايس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة الحل (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182 - 50 </td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> ميرك </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> مقص جراحي القياسية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> معيار ملقط مسنن </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> غرامة اضافية مقص القزحية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> منحني ملقط </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> دومون No.5 غرامة ملقط نصائح </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> دومون No.5 مرآة الانتهاء ملقط </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas - توبنغن ربيع مقص </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> ورق الترشيح </td><td> فيشر العلمية </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> آلات العالم Precission </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 ملم أطباق بتري </td><td> غرينر </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 مل أنبوب البولي بروبلين </td><td> كارل روث محدودة </td><td> ECO3.1 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 لوحة جيدا ثقافة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> ميرك </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> المشتعلة / براون micropipette مجتذب P - 97 </td><td> شركة سوتر الصك </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> صلاح الغيدان (1،1 &#39;- Dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - ميثيل -- indocarbocyanine البركلورات) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر الشرائح SuperFrost بلس </td><td> كارل روث محدودة </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> زلات تغطية الزجاج </td><td> كارل روث محدودة </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

هنا نقدم تقنية لتسمية المسارات من مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية DRG في النخاع الشوكي الجنينية التي تلطيخ ناشر باستخدام التتبع محبة للدهون 1،1 &#39;- dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine بيركلورات (الجاذبة) 1 . المقارنة بين مسارات محواري من نوع تلك البرية مع خطوط الماوس في تحور الجينات التي تسمح للاختبار لدور وظيفي للبروتينات مرشح في السيطرة على المحاور المتفرعة وهو آلية أساسية في الأسلاك في الجهاز العصبي. المتفرعة محواري تمكن خلية عصبية الفردية للتواصل مع أهداف متعددة ، وبالتالي توفير الأساس المادي للالمعالجة المتوازية للمعلومات. ويمكن التمييز بين تشعبات في المناطق المستهدفة وسيطة من النمو محواري تشجر من المحطة. وعلاوة على ذلك ، يمكن تصنيف أنماط مختلفة من تشكيل فرع محواري اعتمادا على ما إذا كانت النتائج المتفرعة من أنشطة مخروط النمو (تقسيم أو تأخر الصدريةدعا nching) أو من الناشئين للضمانات من رمح محوار في عملية المتفرعة خلالي 2 (الشكل 1). وسط توقعات من الخلايا العصبية من DRG تقترح نظام التجريبية مفيدة لدراسة كلا النوعين من المحاور المتفرعة : عندما تصل إلى المحاور الخاصة بهم وارد دخول منطقة الجذر الظهري (DREZ) من النخاع الشوكي بين الجنينية أيام 10-13 (E10 -- E13) أنها عرض نمط من نمطي T - Y أو التشعب الشكل. وهما ابنة المحاوير الناتجة ثم المضي قدما في اتجاهات منقاري أو الذيلية ، على التوالي ، على هامش ظهراني من الحبل ، وفقط بعد فترة انتظار الضمانات برعم من هذه المحاور العصبية الجذعية لتخترق المادة الرمادية (المتفرعة خلالي) ومشروع لخلايا عصبية معينة في التتابع صفيحة من الحبل الشوكي حيث arborize أخرى (محطة المتفرعة) 3. وقد كشفت اقتفاء الجاذبة مخاريط النمو في منطقة الجذر الظهري دخول من الحبل الشوكي التي على ما يبدو في العلاقات العامةويتسبب ocess تقسيم مما يوحي بأن التشعب من خلال تقسيم للمخروط النمو ذاته 4 (الشكل 2) ، ومع ذلك ، فقد تمت مناقشة خيارات أخرى ك 5 أيضا. هذا الفيديو يوضح أولا كيف لتشريح النخاع الشوكي للفئران E12.5 ترك DRG المرفقة. يتم تطبيق التثبيت التالية من كميات صغيرة من عينات الجاذبة للDRG باستخدام الإبر الزجاج سحبها من الانابيب الشعرية. بعد خطوة الحضانة ، هي التي شنت على الحبل الشوكي المسمى باعتباره إعداد كتاب مفتوح مقلوب لتحليل المحاور الفردية باستخدام المجهر مضان.

Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

التوقعات النمطية للafferents الحسية في الحبل الشوكي القوارض توفر نظام يمكن الوصول إليها بسهولة تجريبية لدراسة المحاور المتفرعة من خلال تتبع محاور واحد.

الجاذبة - DRG وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. التوقعات النمطية للafferents الحسية في الحبل الشوكي القوارض توفر نظام يمكن الوصول إليها بسهولة تجريبية لدراسة المحاور المتفرعة من خلال تتبع محاور واحد.

Video: DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

كله من جبل إعداد الكبار ذبابة الفاكهة الحبل الاعصاب الاماميه للحقن صبغ الألياف العملاق

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

الزرد<em&gt; في الموقع</em&gt; الحبل الشوكي التحضير للتسجيلات الكهربية من العمود الفقري الحسية والحركية العصبية

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...