Generazione di anticorpi: produzione di anticorpi monoclonali attraverso l'utilizzo di ibridomi

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Programma di laurea in microbiologia, immunologia e biologia del cancro, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Gli anticorpi policlonali sono definiti come una raccolta di anticorpi diretti contro diversi determinanti antigenici di un antigene o di più antigeni (1). Mentre gli anticorpi policlonali sono potenti strumenti per identificare le molecole biologiche, c'è una limitazione importante: non sono in grado di distinguere tra antigeni che condividono determinanti antigenici. Ad esempio, quando l'albumina sierica bovina viene utilizzata per immunizzare un animale, le cellule B con Ig di superficie diversa risponderanno a diversi determinanti antigenici sull'albumina sierica bovina. Il risultato è una miscela di anticorpi nell'antiserum. Poiché l'albumina sierica bovina condivide alcuni epitopi con l'albumina sierica umana in regioni evolutivamente conservate della proteina, questo antisiero dell'albumina sierica anti-bovina reagirà anche con l'albumina sierica umana. Pertanto, questo antiserum non sarà utile per distinguere tra albumine sieriche bovine e umane.

Sono stati adottati diversi approcci per superare il problema della specificità degli antisieri policlonali. Uno è assorbendo gli anticorpi indesiderati facendo passare l'antiserum attraverso una colonna cromatografica di antigeni immobilizzati (2). Questo metodo è noioso e spesso incapace di rimuovere completamente gli anticorpi indesiderati. Un altro approccio è quello di isolare le singole cellule B produttrici di anticorpi ed espanderle in coltura. Tuttavia, come la maggior parte delle normali cellule non trasformate, le cellule B non sopravvivono in coltura a lungo termine.

Per superare l'incapacità delle cellule B di sopravvivere in coltura, un approccio è quello di preparare un ibridoma a cellule mieloma-B. Nel 1847, Henry Bence-Jones scoprì che i pazienti con mieloma multiplo, un tumore linfoide, producevano una grande quantità di anticorpi (3). Le cellule B in questi pazienti sono diventate maligne e crescono in modo incontrollabile. Poiché le cellule B maligne sono derivate da un singolo clone, sono identiche e producono solo un singolo tipo di anticorpo(cioèun anticorpo monoclonale o mAb). Tuttavia, la maggior parte di queste cellule del mieloma producono anticorpi di specificità sconosciute. Nel 1975, fondendo una cellula di mieloma con una cellula B, Cesar Milstein e Georges Kohler sono riusciti a produrre un ibridoma che può essere coltivato indefinitamente in vitro e produce un numero illimitato di anticorpi monoclonali di nota specificità antigenica (4). Il razionale alla base del loro approccio è quello di combinare le proprietà immortali della cellula mieloma e le proprietà di produzione di anticorpi della cellula B. La loro tecnica ha rivoluzionato la produzione di anticorpi e fornisce un potente mezzo per l'identificazione e la purificazione di molecole biologiche utilizzando anticorpi monoclonali.

Generalmente, la preparazione di un anticorpo monoclonale richiede diversi mesi. La procedura generale include i seguenti passaggi:

1. Immunizzazione e screening del titolo anticorpale
2. Fusione di cellule B produttrici di anticorpi e cellule di mieloma
3. Crescita selettiva dell'ibridoma
4. Screening degli ibridomi per la produzione dell'anticorpo monoclonale desiderato
5. Clonazione limitando la diluizione - un processo in cui le cellule vengono diluite a una concentrazione per consentire statisticamente di aggiungere meno di 1 cellula ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Alcuni pozzedi finiranno con 0 cellule e alcuni avranno 1 cella. I pozzeggi con seme con 1 cellula alla fine cresceranno in una popolazione monoclonale di cellule.
6. Crescita dell'ibridoma e preparazione dell'anticorpo monoclonale

Questo protocollo si concentra sull'ultimo passo: la crescita dell'ibridoma e la preparazione dell'anticorpo monoclonale. L'anticorpo viene purificato dal surnatante di coltura mediante precipitazione del solfato di ammonio (spesso indicato come salatura) - un metodo comunemente usato per rimuovere le proteine da una soluzione. Le proteine in soluzione formano legami idrogeno, insieme ad altre interazioni idrofile, con l'acqua attraverso i loro gruppi polari e ionici esposti. Quando vengono aggiunte concentrazioni di ioni piccoli e altamente carichi (come ammonio o solfato), questi gruppi competono con le proteine per legarsi all'acqua. Questo rimuove le molecole d'acqua dalla proteina e diminuisce la sua solubilità, con conseguente precipitazione della proteina.

Nota: La tecnica di coltura cellulare sterile deve essere mantenuta quando si maneggiano le cellule di ibridoma e il mezzo in modo sterile (ad esempio, in un armadio di biosicurezza) fino alle fasi di purificazione degli anticorpi.

1. Scongelamento delle cellule di ibridoma congelato

1. Incubare il flaconcino contenente le cellule di ibridoma congelate in un bagno d'acqua a 37°C fino a quando non si è appena scongelato (circa 2 minuti).
2. Aggiungere le cellule scongelate in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di RPMI completo (RPMI integrato con 10% di siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 1mM di piruvato di sodio, 1x aminoacidi non essenziali, 50 μM di 2-Mercaptoetanolo, 10 mM HEPES).
3. Centrifugare per 5 minuti a 1200 RPM per lavare via eventuali congelanti contaminanti.
4. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante liquido e risusciere il pellet cellulare in 5 ml di RPMI fresco completo. Quindi, aggiungere le cellule a un pallone di coltura tissutale T75 contenente 15 ml di RPMI completo (il volume finale di RPMI è di 20 ml).
5. Far crescere le cellule in un incubatore standard a 37°C con il 5% di CO_2. Le cellule non sono aderenti mentre sono in coltura.

2. Espansione dell'ibridoma

1. Lasciare che le cellule si espandano per circa 3 giorni fino a quando il pallone è confluente all'80%.
   Nota: Questa quantità di tempo può variare in base al numero iniziale di cellule, nonché alle differenze intrinseche nei tassi di crescita delle diverse cellule. È importante che le cellule siano nella fase di crescita esponenziale.
2. Una volta che il pallone iniziale raggiunge una confluenza di ~ 80%, rimuovere le celle da questo pallone T75 iniziale, metterle in un tubo conico della centrifuga e girare (1200 RPM per 5 min) per pellettizzare le celle.
3. Riaspensionare le celle in 6 mL di RPMI completo, quindi distribuire la sospensione cellulare in tre nuovi palloni T75 (2 mL/pallone contenente 18 mL RPMI). Incubare questi tre palloni T75 a 37 ° C con il 5% di CO₂ fino a quando non sono confluenti ~ 80% (questo dovrebbe richiedere circa 3 giorni).

3. Produzione di anticorpi in mezzo privo di siero

Nota: A questo punto, le cellule sono pronte a continuare la loro crescita in un mezzo privo di siero progettato per la crescita di linee cellulari di ibridomi. In questo protocollo, utilizziamo il mezzo liquido basale HB pronto all'uso, disponibile in commercio, contenente il prodotto di supplemento HB101.

1. Le celle di ciascuno dei tre palloni T75 (a ~ 80% di confluenza) vengono raccolte e centrifugate (1200 RPM per 5 min).
2. Il pellet cellulare di ciascun matraccio T75 viene riconsosciato in un mezzo privo di siero HB101 integrato da 10 mL e quindi aggiunto a due palloni T225 integrati con mezzo privo di siero HB101 (cioè 5 mL di sospensione cellulare in ciascuno dei 6 palloni contenenti ~ 220-240 mL HB101 in ciascun pallone).
3. Continuare a far crescere le cellule in palloni T225 e hb101 a 37 ° C con il 5% di CO₂ per tre settimane o fino a quando le cellule iniziano a morire. Le cellule producono mAb durante queste 3 settimane e lo secernono nel terreno di coltura. Una volta che le cellule stanno iniziando a morire, non producono più alcun mAb.

4. Purificazione degli anticorpi - Giorno 1

Nota: A questo punto, la sterilità non ha bisogno di essere mantenuta, quindi non è necessario maneggiare il supporto in modo sterile (ad esempio, in un armadio di biosicurezza). Inoltre, gli ibridomi non sono considerati un agente di "livello BSL2".

1. Versare i mezzi dai palloni in tubi per un rotore ad angolo fisso. Ruotare i tubi in una centrifuga con un rotore ad angolo fisso a 10.000 giri / min per 8 minuti. Questo passaggio è progettato per rimuovere i detriti cellulari dal surnatante di coltura.
   Nota: Le dimensioni dei tubi possono variare a seconda del rotore utilizzato. La cosa importante da ricordare è avere lo stesso volume nei tubi per garantire che il rotore sia correttamente bilanciato prima della centrifugazione. È probabile che l'intero volume del supporto non si adatti alla centrifuga in una sola volta. I mezzi rimanenti saranno centrifugati in seguito (fase 4.5) utilizzando gli stessi tubi.
2. Preparare un becher di plastica da 2 L con una barra di agitazione in un secchio circondato da ghiaccio. Mettere su un piatto di agitazione.
3. Fissare una parte superiore del filtro da 500 ml su una bottiglia da 1 L. Collegare l'unità filtrante superiore della bottiglia al vuoto della casa tramite un tubo appropriato.
4. Versare il surnatante dal punto 4.1 (che contiene ancora il mAb prodotto dalle cellule dell'ibridoma) nella parte superiore del filtro.
5. Continuare a utilizzare lo stesso set di tubi per i detriti delle celle di pellet dal supporto (il pellet continuerà a costruire). Attendere di eseguire il vuoto fino a quando la parte superiore del filtro è piena e un altro lotto di surnatante è pronto per essere versato. Non lasciare asciugare il filtro o il filtraggio diventerà molto lento.
6. Quando il flacone da 1 L è vicino al pieno, rimuovere la parte superiore del filtro e versare il surnatante nel becher da 2 L preparato al punto 4.2. Ricollegare la parte superiore del filtro. Tieni traccia del volume.
7. Ripetere le fasi di centrifugazione e filtrazione fino a quando tutto il mezzo viene elaborato.
8. Misurare 295g di solfato di ammonio per 1L di surnatante filtrato raccolto. Mentre si mescola, aggiungere lentamente il solfato di ammonio al surnatante nelle prossime due ore (~ 25 g ogni 15 minuti) per evitare un'alta concentrazione localizzata di sale di solfato di ammonio che potrebbe causare la precipitazione di proteine indesiderate.
9. Una volta aggiunto tutto il solfato di ammonio, coprire il becher con un foglio e spostarsi con la piastra di agitazione a 4 ° C (ad esempio, frigorifero walk-in o cella frigorifera). Mescolare durante la notte. Per solubilizzare il sale è necessaria una costante agitazione della soluzione, ma un'agitazione prolungata può portare alla denaturazione delle proteine nella soluzione all'interfaccia superficie/aria.
10. Lavare i tubi utilizzando il rotore ad angolo fisso.

5. Purificazione degli anticorpi - Giorno 2

1. Versare il solfato di ammonio contenente surnatante dal becher da 2L in tubi per un rotore ad angolo fisso. Centrifuga con rotore ad angolo fisso a 6500 RPM per 20 minuti senza freno.
2. Aspirare sottovuoto il surnatante, facendo attenzione a non aspirare il pellet in quanto sarà morbido. Continuare a utilizzare lo stesso set di tubi per raccogliere il pellet dal solfato di ammonio contenente surnatante.
3. Dopo l'ultima aspirazione, risospenare ogni pellet (che contiene anticorpi) in ~ 1 ml pbS.
4. Rimuovere il solfato di ammonio dalla soluzione precipitata di mAb mediante dialisi contro grandi volumi di PBS. Per fare ciò, tagliare prima circa 1 pollice di tubo di dialisi (ad esempio, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12.000-14.000 Tubi di dialisi di cellulosa cut-off Dalton) per ogni mL di soluzione mAb. Bagnare il tubo con dH₂O. Legare un nodo in un'estremità del tubo e riempire con dH₂O per verificare che il nodo non perda. Svuotare dH₂O dal tubo.
5. Pipetta PBS/soluzione anticorpale nel tubo. Risciacquare i tubi con un PBS aggiuntivo di 0,25 ml e trasferirle nel tubo.
6. Fissare la parte superiore del tubo il più vicino possibile alla soluzione con una clip per dialisi arancione.
7. Fissare la parte superiore del tubo sulla parte superiore esterna di un becher da 4 L. Lasciare che la parte riempita del tubo penda nel becher. Riempire il becher con PBS e aggiungere una barra di agitazione.
8. Mescolare durante la notte per ~ 8 ore a 4 ° C.
9. Sostituire il PBS nel becher con PBS fresco e mescolare per ~ 8 ore altre due volte.
10. Trasferire l'anticorpo dal tubo a tubi conici da 15 o 50 ml. Centrifugare per 5 minuti a 1200 RPM per rimuovere qualsiasi precipitato che potrebbe essersi formato. Trasferire il surnatante in un tubo fresco.
11. Diluire un'aliquota di anticorpo 1:20 con PBS (anticorpo 5 μl + 95 μl PBS). Quantitare la concentrazione anticorpale con uno spettrofotometro (in bianco con PBS) a 280 nm. Utilizzare un coefficiente di estinzione (ε) di 1,43. La concentrazione è calcolata come
    
    
12. Aliquotare l'anticorpo in flaconcini a vite e conservare a -80°C.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo ottenuto i seguenti risultati con diversi ibridomi:

Ibridoma: RB6-BC5 (ratto anti-topo Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ - 1,103
(1.103/1.43) (20) = 15,42 mg/ml

Ibridoma: GK1.5 (ratto anti-mouse CD4 IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ - 0,485
(0.485/1.43) (20) = 6,78 mg/ml

Ibridoma: 2.43 (ratto anti-mouse CD8 IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ - 0,209
(0.209/1.43) (20) = 2,92 mg/ml

Questi sono tutti risultati di esempio, ed è importante notare che ogni ciclo di produzione con lo stesso ibridoma può essere leggermente diverso nella quantità di mAb disponibile alla fine.

La procedura sopra descritta è un modo semplice e diretto per purificare gli anticorpi monoclonali dal surnatante della coltura dell'ibridoma. È importante ricordare, tuttavia, che il solfato di ammonio precipiterà altre proteine che potrebbero essere nel surnatante di coltura. Di conseguenza, le concentrazioni di anticorpi determinate dalle misurazioni dell'assorbanza sono stime. L'utente potrebbe voler valutare la purezza del campione dializzato eseguendo una piccola quantità su un gel di poliacrilammide SDS. Il mAb prodotto da un ibridoma, una volta purificato utilizzando questa metodologia, può essere utilizzato in vari modi. I sopra descritti RB6-BC5, GK1.5 e 2.43 mAb sono comunemente usati per l'esaurimento in vivo di neutrofili, cellule T CD4 e cellule T CD8, rispettivamente, nei topi. Altri mAb prodotti e purificati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per la citometria a flusso (quando coniugato a un fluoroforo o in combinazione con un Ab secondario), ELISA o Western blotting.

1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).