Incroci sessuali con il Mucoromicete Phycomyces blakesleeanus

Qui presentiamo un protocollo di base per l'induzione dell'accoppiamento di P. blakesleeanus .

Il Phycomyces blakesleeanus, un fungo filamentoso all'interno del phylum Mucoromycota, si distingue per la sua notevole capacità di percezione ambientale e risposte adattative. Mentre il lavoro passato ha dimostrato che gli stimoli ambientali, tra cui la gravità, la luce, l'umidità e la disponibilità di nutrienti, influenzano le dinamiche di crescita e le strategie riproduttive, i meccanismi sottostanti rimangono un'area focale della ricerca. I segnali ambientali innescano la riproduzione sessuale o asessuata. La riproduzione sessuale inizia con la segnalazione dei feromoni, che innesca la chemioattrazione ifale, portando infine a transizioni morfologiche seriali che culminano nella formazione di una zigospora.

In un ambiente di laboratorio, gli incroci di P. blakesleeanus provocano miceli complementari che subiscono il ciclo sessuale in diverse fasi. Il nostro lavoro mira a verificare se i segnali ambientali possono innescare l'accoppiamento attraverso i miceli di P. blakesleeanus. Gli incroci di P. blakesleeanucoltivati su terreni con nutrienti limitati saranno sottoposti ad agar con nutrienti limitati per innescare una risposta sessuale in conformità con la privazione di nutrienti. L'innesco riuscito dell'accoppiamento in P. blakesleeanus faciliterà gli studi futuri che richiedono una grande quantità di miceli che si riproducono sessualmente in fasi specifiche. Il risultato di questa ricerca migliorerà ulteriormente la nostra comprensione di come i meccanismi riproduttivi di P. blakesleeanus siano influenzati da fattori ambientali, contribuendo alla più ampia base di conoscenze sulla riproduzione sessuale dei funghi filamentosi.

L'induzione dell'accoppiamento nei sistemi fungini in condizioni di laboratorio ha fatto progredire la comprensione della genetica eucariotica, della biologia cellulare, della biologia evolutiva e della biotecnologia. I funghi dikarya, in particolare gli Ascomycota, presentano le più ampie conoscenze sull'induzione dell'accoppiamento in un ambiente di laboratorio¹. È interessante notare che il primo fungo in cui è stata proposta la riproduzione sessuale, Syzygites megalocarpus, non è un membro di Ascomycota, ma piuttosto un membro del phylum Mucoromycota². Il phylum Mucoromycota è un gruppo divergente precoce precedentemente classificato come "Zygomycota" ma ora considerato fratello dei lignaggi Dikarya ^3,4. I Mucoromycota, insieme a Zoopagomycota, sono evolutivamente significativi in quanto questi phyla rappresentano la transizione dei funghi agli ecosistemi terrestri ^4,5. Come altri funghi, i mucoromiceti usano strategie riproduttive asessuate e sessuali in risposta al loro ambiente ^3,6. In condizioni di nutrienti limitati, i mucoromiceti inizieranno il ciclo sessuale⁶. I mucoromiceti mostrano meccanismi di accoppiamento sia omotallici che eterotallici, in cui la compatibilità è determinata dai geni di tipo accoppiato sexM e sexP, designati rispettivamente come (-) e (+) ^7,8,9.

Blakeslee¹⁰ ha sottolineato la sensibilità del ciclo sessuale del mucoromicete alle condizioni esterne, osservando che l'umidità è fondamentale per la loro formazione e che la disponibilità di nutrienti nel substrato gioca un ruolo significativo. I tipi di accoppiamento complementari iniziano il ciclo sessuale attraverso la sintesi cooperativa di acidi trisporici (TA) utilizzando il beta-carotene come precursore 11,12,13. In seguito alla rilevazione di TA, le ife vegetative che rispondono si ispessiscono e diventano zigofori altamente ramificati 14,15,16. Gli zigofori continuano la produzione di TA e si attraggono. In P. blakesleeanus, gli zigofori si differenziano all'interno del substrato e non sono facilmente visibili su terreni solidi di agar¹⁷. Al momento del contatto, gli zigofori si intrecciano e diventano zigofori aerei.

Mentre il ciclo sessuale continua, le punte degli zigofori si attaccano e il centro delle cellule si spinge verso l'esterno per formare una struttura ad anello con rigonfiamento coralloide alla base, completando la transizione al progametangio. Le punte delle cellule che formano il progametangio iniziano a fondersi e a svilupparsi nel gametangio. Nella fase di gametangia, gli zigofori mostrano ornamenti simili a spine. La parete cellulare alle punte si dissolve e compaiono setti avventizi, delimitando l'area in cui si formerà la zigospora, e gli zigofori agiscono come sospensori simili a pinze¹⁸. La zigospora diventerà pigmentata man mano che la sua parete cellulare si ispessisce e acquisisce ulteriori ornamenti simili a spine^17,18. Una volta formata, la zigospora entrerà in un periodo di dormienza prima di ricominciare il ciclo di crescita.

Phycomyces blakesleeanus è un mucoromicete eterotalico noto per le sue grandi cellule e gli sporangiofori sensibili all'ambiente ^6,8,18. Questo organismo è facilmente coltivabile in laboratorio e le porzioni del ciclo sessuale che portano alla formazione di zigospore possono essere osservate nell'arco di 8-10 giorni. Come modello, P. blakesleeanus è stato esaminato per la sua capacità di percepire la luce nel suo ambiente^17,19. La facilità di coltivazione e la capacità di indurre l'accoppiamento lo hanno reso anche un modello ideale per studiare il meccanismo alla base della sua capacità di percepire la luce²⁰; Questi risultati hanno anche evidenziato la conservazione evolutiva dei meccanismi di rilevamento della luce nei funghi. In P. blakesleeanus, è stato dimostrato che la luce inibisce la riproduzione sessuale attraverso queste proteine sensibili alla luce conservate²¹. Recenti studi evolutivi sullo sviluppo hanno cercato di capire quali geni contribuiscono alla differenziazione cellulare durante il ciclo sessuale di P. blakesleeanus ⁶. La correlazione della morfogenesi con geni specifici richiederebbe l'isolamento di una quantità sufficiente di tessuto degli stessi tipi di cellule per eseguire studi di espressione genica.

Sebbene siano stati precedentemente descritti protocolli per indurre l'accoppiamento di P. blakesleeanus in un ambiente di laboratorio, alcuni menzionano solo il tipo di terreno da utilizzare e i ceppi pertinenti¹⁸. Alcune descrizioni del protocollo non includono una formulazione specifica dei terreni, ma descrivono dove posizionare i presunti tipi di accoppiamento complementari su una piastra¹⁰. Protocolli più recenti consentono di aumentare la produzione di zigospore mescolando spore di ciascun tipo di accoppiamento e inoculandole con la sospensione di spore miste²¹ o posizionando i tipi di accoppiamento a una certa distanza l'uno dall'altro e lasciando incubare la coltura per 20 giorni²². Questi approcci sono utili per generare ampie cellule differenziate, in particolare zigospore, ma potrebbero non essere adatti per osservare un andamento temporale dello sviluppo o selezionare strutture sessuali che si formano prima delle zigospore per la trascrittomica a singola cellula. Altri lavori hanno affrontato questo problema posizionando tipi di accoppiamento complementari a distanza l'uno dall'altro su mezzi solidi per consentire l'osservazione delle transizioni morfologiche seriali all'inizio del ciclo sessuale ^6,22,23. Come nel caso di altri funghi, il micelio di P. blakesleeanus si espande radialmente^24,25. Pertanto, quando i tipi di accoppiamento complementari vengono coltivati sulla stessa piastra, diverse porzioni dei loro miceli entreranno in contatto in momenti diversi. Poiché il contatto tra i miceli è uno dei primi passi nel ciclo sessuale di P. blakesleeanus, ciò significa che diverse porzioni di miceli interagenti si troveranno in fasi diverse del ciclo sessuale. Questa asincronia potrebbe influire sull'esito di uno studio sull'espressione genica, in modo tale che se i tipi di cellule differenziate sono mescolati e se hanno programmi di espressione genica distinti, allora sarebbe difficile attribuire il ruolo di un gene a una particolare struttura.

Oltre al valore di P. blakesleeanus come modello per l'esame dei geni coinvolti nella morfogenesi durante il ciclo sessuale, la sua crescita vigorosa e la capacità di differenziarsi nell'arco di pochi giorni lo rendono un fungo ideale per la formazione di studenti interessati a funghi filamentosi divergenti precocemente e per l'uso in una classe universitaria per conoscere la diversità dei funghi e i loro processi di sviluppo. Il protocollo qui presentato utilizza tre concentrazioni di due diversi tipi di terreni per dimostrare l'effetto della disponibilità di nutrienti sull'aspetto del micelio, l'induzione dell'accoppiamento e l'arricchimento per particolari strutture sessuali, sia per la quantificazione, l'osservazione o la potenziale trascrittomica di singole cellule.

1. Preparazione dei terreni

1. Sospendere l'agar di farina di mais in polvere (CMA) o l'agar destrosio di patate (PDA) in acqua deionizzata. Per CMA o PDA al 100%, seguire le istruzioni del produttore e sospendere 17 g di CMA in 1 L di acqua deionizzata o 39 g di PDA in 1 L di acqua deionizzata. Per N% CMA o PDA, sospendere 1/N della quantità raccomandata dal produttore e integrare con agar aggiuntivo per ottenere una concentrazione di agar del 7,5% (p/v).
   NOTA: Passaggio facoltativo: prima della sterilizzazione in autoclave, aggiungere 25 μg/mL di cloramfenicolo se la contaminazione batterica è un problema.
2. Sterilizzare il terreno in autoclave, a 121 °C per 15 minuti.
3. Raffreddare il fluido a ~60 °C mettendolo per 30 minuti in un bagnomaria impostato a 60 °C.
   NOTA: Se il flacone caldo di terreno può essere tenuto per 6 secondi con poco o nessun disagio, è pronto per essere versato.
4. Versare le piastre in condizioni asettiche in una cappa a flusso laminare o in una cappa di sicurezza biologica. Inclinare la bottiglia di terreno su una capsula di Petri aperta e vuota e versare quanto basta per coprire completamente il fondo.
   1. In alternativa, utilizzare una pipetta sierologica di vetro e pipettare 20 mL di terreno in ciascuna piastra.
      NOTA: Questo approccio aumenta il tempo in cui il flacone del terreno si trova a una temperatura più bassa e aumenta il rischio di solidificare prematuramente l'agar.
5. Lasciare che il supporto si risolidifichi. Conservare le piastre a 4 °C se non vengono utilizzate immediatamente.

2. Preparazione di spore fungine o tessuti

1. Ottenere colture di ogni tipo di accoppiamento di P. blakesleeanus (ad esempio, NRRL 1555 (-), NRRL 1554 (+), NRRL 1464 (-) e NRRL 1465 (+)). Per inoculare gli incroci con le spore, prima coltiva ogni tipo di accoppiamento in coltura pura su CMA o PDA al 100%
2. Tagliare una porzione di micelio all'avanguardia da colture esistenti e posizionare il micelio asportato su una piastra CMA/PDA al 100%. Incubare colture pure per 1 settimana a 27 °C con un ciclo di luce di 12 ore.
3. Una volta presenti gli sporangiofori, inondare una coltura pura sporulante con lo 0,01% di Tween 20 in acqua sterilizzata e deionizzata utilizzando una tecnica asettica. Con una micropipetta P1000, aspirare 1,0 mL della miscela di 20 spore Tween dalla piastra e in una provetta per microcentrifuga.
4. Centrifugare in una mini centrifuga per 30 s, quindi decantare il surnatante.
   1. Se sono necessarie più spore, continuare ad aggiungere 1,0 ml della miscela di spore Tween 20 nella stessa provetta da microcentrifuga e ripetere il passaggio 2.4. Dopo aver ottenuto una quantità adeguata di spore, decantare il surnatante e sostituirlo con 500 μL di acqua deionizzata sterile.
   2. Opzionale: utilizzare un ematocitometro per stimare la concentrazione di spore, che indicherà se è necessario aggiungere più acqua o se le spore devono essere ricentrifugate.
5. In alternativa, inoculare gli incroci con miceli all'avanguardia provenienti da colture pure.
   1. Utilizzare una lama di rasoio sterilizzata o una trivella per asportare il tessuto e piastrare immediatamente l'inoculo.
6. Impostare le croci come croci a 2 vie, croci a 4 vie o croci a 8 vie (Figura 1).
   NOTA: Se le croci vengono impostate per il lavoro trascrittomico, si consiglia di installare 1-2 piastre aggiuntive per condizione/supporto che fungano da piastre indicatrici. Le piastre indicatrici consentono agli investigatori di limitare l'esposizione alla luce alle piastre sperimentali, poiché la luce inibisce la riproduzione sessuale in P. blakesleeanus.
   1. Per un incrocio a 2 vie, posizionare i tipi di accoppiamento complementari uno di fronte all'altro (Figura 1A).
      1. Posizionare i miceli del tipo (-) di accoppiamento, NRRL 1555 o NRRL 1464, ad almeno 1 cm di distanza dal bordo di una capsula di Petri su PDA o CMA.
      2. Sulla stessa piastra, di fronte a dove è stato posizionato il tipo di accoppiamento (-) e a 1 cm di distanza dal bordo della piastra di Petri, posizionare il tipo di accoppiamento (+), NRRL 1554 o NRRL1465 (Figura 1A).
         NOTA: La distanza tra i tipi di accoppiamento complementari influenzerà le dimensioni del tessuto che partecipa al ciclo sessuale. I tipi di accoppiamento più distanti consentono ai miceli di espandersi di più, il che aumenterà il numero di interazioni sessuali tra i due partner.
   2. Per un incrocio a 4 vie, posizionare i tipi di accoppiamento simili uno di fronte all'altro ma vicini a un tipo di accoppiamento complementare (Figura 1B).
      1. Posizionare le spore o i miceli dei tipi di accoppiamento (-), NRRL 1555 e NRRL 1464, uno di fronte all'altro ad almeno 1 cm di distanza dal bordo di una capsula di Petri su PDA o CMA.
      2. Sulla stessa piastra, scegliere una posizione tra i due tipi di accoppiamento (-) e ad almeno 1 cm di distanza dal bordo della piastra e inoculare il sito con spore o miceli del tipo di accoppiamento (+), NRRL 1554 o 1465.
      3. Sulla stessa piastra, di fronte a quella in cui è stato inoculato il primo tipo di accoppiamento (+) e ad almeno 1 cm di distanza dalla piastra, posizionare l'altro tipo di accoppiamento (+).
   3. Per un incrocio a 8 vie, alternare i tipi di accoppiamento lungo la periferia della capsula di Petri, con quattro di ogni tipo di accoppiamento (Figura 1C).
7. Dopo l'inoculazione, sigillare le piastre con parafilm o (lasciarle non sigillate) e metterle in un contenitore secondario prima di incubarle a 22 °C al buio. Osserva le piastre ogni giorno per trovare prove di accoppiamento, durante il quale scatta fotografie da sotto la piastra e traccia i miceli man mano che le colture crescono.
   NOTA: Dopo 24 ore dall'inoculazione, aspettatevi di vedere i miceli espandersi su tutti i tipi di terreno, ma è improbabile che gli individui siano in contatto in questa fase.
8. A seconda del tipo di terreno (PDA o CMA) e della formulazione (25%, 50%, 100%), se i miceli iniziano a entrare in contatto, ispezionare i miceli dei tipi di accoppiamento complementari che sono in contatto sotto un cannocchiale di dissezione per prove di accoppiamento. Scatta foto di miceli interagenti con una fotocamera o uno smartphone montato sul cannocchiale da dissezione.
   1. Acquisire immagini di miceli e unirle (ad esempio, utilizzando l'applicazione Panorama Stitcher). Utilizzare ImageJ per stimare l'area dei miceli (vedere le esercitazioni online).

A seguito di un incrocio a 4 vie, ogni ceppo variava leggermente nel suo tasso di crescita come determinato dal cambiamento di area del micelio (Figura 2). Sebbene non sia statisticamente significativo, NRRL 1555 ha avuto un cambiamento più rapido nell'area quando è stato placcato su 25% CMA, 25% PDA o 100% PDA. Allo stesso modo, NRRL 1465 ha avuto una variazione di area più elevata quando è stato coltivato con il 50% di PDA o CMA. NRRL 1464 ha avuto l'aumento più rapido dell'area quando è stato coltivato al 100% CMA. Dopo 24 ore (1 DPI), i ceppi che crescono sul PDA appaiono più gialli rispetto ai ceppi cresciuti sul CMA (Figura 3) - Il PDA ha precedentemente dimostrato di aumentare la produzione di pigmenti²⁶. I ceppi con PDA al 100% avevano, in media, una misura di area più elevata dopo 24 ore (Tabella 1). Ciò è in contrasto con il 25% di CMA, che aveva l'area media più piccola a 1 DPI (Tabella 1).

Il contatto tra ceppi vicini non è stato osservato fino a 2 DPI e solo tra ceppi cresciuti con PDA, in particolare PDA al 100% (Figura 4). L'accoppiamento è stato osservato su PDA al 100% a 2 DPI. I ceppi cresciuti con CMA non sono entrati in contatto a 2 DPI, sebbene il 100% CMA presentasse ceppi che crescevano molto vicini l'uno all'altro (Figura 4). Dopo 3 giorni di incubazione (3 DPI), i ceppi cresciuti su tutte le formulazioni di PDA hanno mostrato accoppiamento, sebbene la densità dei tipi cellulari differenziati differisse (Tabella 2 e Figura 5). Anche una replica di CMA al 25% e una replica di CMA al 50% hanno mostrato accoppiamenti (Tabella 2); le restanti placche CMA non hanno mostrato alcun accoppiamento (Tabella 2). È interessante notare che i ceppi cresciuti con PDA sembravano avere miceli gialli più densi e ife aeree, che potrebbero essersi sviluppate in sporangiofori (Figura 5). A 4 DPI, le piastre PDA mostravano reazioni di accoppiamento insieme a sporangiofori asessuati (Figura 6). Le piastre CMA presentavano ceppi con miceli più diffusi e meno sporangiofori (Figura 6). L'accoppiamento non è stato osservato con CMA al 100% (Tabella 2).

Piastre rappresentative sono state osservate in un cannocchiale di dissezione a 4 DPI per valutare se i tipi di cellule associati all'inizio del ciclo sessuale potessero essere facilmente osservati. In generale, una concentrazione decrescente di nutrienti era correlata a miceli sessuali qualitativamente meno densi e differenziati (Figura 7 e Figura 8). Quando coltivati con PDA al 100%, i singoli zigofori aerei o progametangia non potevano essere visualizzati e apparivano come una massa di cellule (Figura 7A). Mentre il 50% e il 25% di PDA sembravano avere una densità cellulare inferiore nel sito di accoppiamento, le piastre di PDA al 25% presentavano cellule che potevano essere facilmente distinte (Figura 7B, C). Confrontando i tipi di cellule osservate nel 50% di PDA con il 25% di PDA, quelle alla concentrazione più bassa sembravano essere prevalentemente dello stesso tipo, mentre alla concentrazione più alta c'era un mix di cellule in stadi diversi (Figura 7D, E). In particolare, con il 50% di PDA, le cellule osservate a 4 DPI includevano zigofori aerei che erano appena emersi (Figura 7D, asterisco) e alcune che stavano passando alla progametangia (Figura 7D, freccia). Con il 25% di PDA, la maggior parte delle cellule sembrava essere in stadi di sviluppo molto simili (Figura 7E).

Le piastre delle varie concentrazioni di CMA sono state valutate insieme alle piastre PDA a 4 DPI (Figura 8). Come accennato in precedenza, l'accoppiamento non è stato osservato quando è stato utilizzato il 100% di CMA (Figura 8A). Al 50% di CMA o al 25% di CMA, è stato osservato un accoppiamento e il numero complessivo di tipi di cellule associati alla riproduzione sessuale era inferiore (Figura 8B, C). Gli zigofori aerei osservati a 4 DPI sembravano avere le stesse dimensioni e altezza in tutta la zona di interazione (Figura 8B, C). Dato il minor numero complessivo di cellule che partecipano al ciclo sessuale, queste potrebbero ipoteticamente essere asportate con lame di rasoio sterilizzate o aghi da dissezione e immediatamente congelate in azoto liquido per l'isolamento dell'RNA a valle. Essere in grado di selezionare strutture specifiche nello stesso momento di sviluppo può aumentare la robustezza degli studi sull'espressione genica che cercano di collegare i cambiamenti morfologici ai geni.

Figura 1: Schema di tre formati di incroci. (A) Un incrocio a 2 vie con due siti di inoculazione (cerchi gialli) con tipi di accoppiamento complementari (+) e (-). (B) un incrocio a 4 vie con due siti di inoculazione di (+) tipo di accoppiamento (cerchi gialli con +) e due siti di inoculazione di tipo (-) di accoppiamento (cerchi gialli con -). (C) Un incrocio a 8 vie con siti di inoculazione alternati (cerchi gialli) di tipi di accoppiamento complementari (+) e (-). Le linee tratteggiate rappresentano il sito previsto per le interazioni di accoppiamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Variazione dell'area nel tempo per ciascun ceppo su CMA e PDA a diverse concentrazioni. L'area media delle colonie di P. blakesleeanus è stata tracciata 3 giorni dopo l'inoculazione. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dell'area media. Vedere anche la Tabella 1. I grafici sono stati generati con ggplot2²⁷. Abbreviazione: DPI = giorni dopo l'inoculazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative di croci a 4 vie a 1 giorno dall'inoculazione. Il confronto delle colonie mostra differenze tra il tipo di terreno e la formulazione, evidenziando che le colonie con PDA al 100% appaiono più gialle del CMA e che la crescita appare più veloce con PDA al 100%. Le immagini sono state scattate dal fondo della capsula di Petri. Sono state tracciate linee nere con un pennarello per delineare i miceli. Abbreviazioni: CMA = agar di farina di mais; PDA = agar destrosio di patata; DPI = giorni dopo l'inoculazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini rappresentative di croci a 4 vie a 2 giorni dall'inoculazione. Il confronto delle colonie evidenzia l'apparente densità della crescita miceliale, dove le colonie su PDA sembrano avere un micelio più denso rispetto a quelle su CMA. Inoltre, le colonie sul PDA appaiono più gialle e la maggior parte ha stabilito un contatto o si sta avvicinando al punto di contatto. Le punte rosse evidenziano le aree in cui sono iniziate le interazioni di accoppiamento, come indicato da un aumento della densità dei tessuti. Ciò è in contrasto con le colonie su CMA in cui solo quelle su CMA al 100% sono vicine al contatto, e tutte le formulazioni CMA presentano colonie che sono relativamente meno gialle rispetto a quelle su PDA e nessuna ha iniziato ad accoppiarsi. Le immagini sono state scattate dal fondo della capsula di Petri. Sono state tracciate linee nere con un pennarello per delineare i miceli. Abbreviazioni: CMA = agar di farina di mais; PDA = agar destrosio di patata; DPI = giorni dopo l'inoculazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative di croci a 4 vie a 3 giorni dall'inoculazione. Il confronto delle colonie tra i due tipi di terreno evidenzia che la densità miceliale è più alta quando viene coltivata su PDA rispetto alla CMA. Le punte delle frecce rosse evidenziano che tutte le piastre PDA ospitano almeno un sito di interazioni di accoppiamento. Le colonie al 100% di CMA e al 50% di CMA non hanno avuto contatti, ma due colonie al 25% di CMA (freccia blu) sono entrate in contatto. Le immagini sono state scattate dall'alto della capsula di Petri. Abbreviazioni: CMA = agar di farina di mais; PDA = agar destrosio di patata; DPI = giorni dopo l'inoculazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Immagini rappresentative di croci a 4 vie a 4 giorni dall'inoculazione. Tutte le colonie su PDA ospitano almeno un'interazione di accoppiamento (frecce rosse) e mostrano un micelio giallo. Inoltre, le colonie sul PDA mostrano un'ampia crescita di ife aeree (cioè sporangi asessuati) che possono impedire l'osservazione delle interazioni di accoppiamento. Le colonie su CMA al 50% e al 25% mostrano anche evidenza di interazioni di accoppiamento (punte di freccia rosse) e hanno una minore crescita ifali aerea rispetto a quelle su PDA. Le immagini sono state scattate dall'alto della capsula di Petri. Abbreviazioni: CMA = agar di farina di mais; PDA = agar destrosio di patata; DPI = giorni dopo l'inoculazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Immagini di croci su PDA. (A) 100% PDA, (B) 50% PDA e (C) 25% PDA. Le regioni di interesse sono state ingrandite (rettangoli rossi). Tutte le immagini sono state acquisite a 4 DPI. Un'ulteriore visualizzazione del (D) 50% PDA evidenzia la presenza di cellule che si riproducono sessualmente a diversi stadi: giovani zigofori aerei: asterischi; Zigofori aerei più vecchi: frecce rosse. (E) Il 25% dei PDA esibisce cellule che si riproducono sessualmente in diversi stadi, sebbene questa visione rappresentativa mostri un minore affollamento di queste strutture rispetto al 50% dei PDA. Barre della scala = 1 mm (A-C), 0,5 mm (D,E). Abbreviazioni: PDA = agar destrosio di patata; DPI = giorni dopo l'inoculazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagini di croci su CMA. (A) 100% CMA, (B) 50% CMA e (C) 25% CMA con ingrandimento delle regioni di interesse. Strutture sessuali distinte sono facilmente osservabili per il 50% (B) e il 25% (C) di CMA, e l'affollamento è minimo. In questo momento non si osservano strutture sessuali al 100% di CMA. Tutte le immagini sono state acquisite a 4 DPI. Le immagini della capsula di Petri e le immagini del cannocchiale di dissezione sono state ottenute dall'alto della capsula di Petri. Le linee scure sullo sfondo delle immagini del cannocchiale da dissezione sono disegnate con un pennarello nero che è stato utilizzato per tracciare l'espansione del micelio. Barre della scala = 1 mm. Abbreviazioni: CMA = agar di farina di mais; DPI = giorni dopo l'inoculazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Area di miceli per ogni ceppo nell'arco di 4 giorni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Valutazione a coppie del contatto e dell'accoppiamento per ciascuna deformazione su mezzi diversi. 0 = No, 1 = Sì. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Qui viene presentato un semplice protocollo per indurre la riproduzione sessuale in P. blakesleeanus in un ambiente di laboratorio. Una delle considerazioni più critiche per questo protocollo è la limitazione dei nutrienti. Si ipotizza che i funghi abbiano cooptato la riproduzione sessuale in risposta a condizioni ambientali difficili come la limitazione dei nutrienti 6,28,29,30,31,32. La variazione del livello di nutrienti può informare la progettazione sperimentale. Ad esempio, se un ricercatore è interessato a confrontare i geni espressi negli zigofori aerei rispetto alla gametangia, allora si raccomanda una limitazione più estrema dei nutrienti (come il 25% di CMA) poiché la densità delle strutture sessuali sarà inferiore rispetto alle formulazioni più elevate di CMA o PDA. Una minore densità di strutture sessuali, come quella osservata con il 50% o il 25% di CMA, significa che l'isolamento di uno specifico tipo di cellula differenziata non solo sarebbe più facile (in quanto le cellule sarebbero facilmente identificabili ed asportate), ma garantirebbe anche che venga campionato solo il tipo di cellula di interesse.

Anche i tirocinanti o gli studenti trarrebbero vantaggio da questo protocollo in quanto consente a questo gruppo di monitorare la differenziazione cellulare e distinguere in modo affidabile tra i vari tipi di cellule che si sviluppano durante il ciclo sessuale di P. blakesleeanus. L'uso di CMA e PDA riflette il lavoro precedente sull'induzione dell'accoppiamento dei mucoromiceti 18,22,23 e le forme in polvere sono disponibili per l'acquisto, rendendole tra le scelte di terreni più accessibili in un contesto formativo o educativo rispetto ad altri mezzi sintetici.

Poiché l'obiettivo di questo protocollo è in ultima analisi quello di dimostrare lo sviluppo e la differenziazione, ed è stato sottolineato che la concentrazione di nutrienti influisce sulla facilità di osservare tipi di cellule distinte, un passo fondamentale in questo protocollo è garantire l'appropriata composizione dei terreni (sezione 1 del protocollo). Se non viene aggiunta ulteriore polvere di agar al PDA o al CMA diluito, il terreno potrebbe non solidificarsi correttamente e le successive interazioni di accoppiamento potrebbero non essere facilmente osservabili. Inoltre, si dovrebbe prestare molta attenzione al posizionamento di tipi di accoppiamento complementari e simili (sezione 2 del protocollo). Poiché P. blakesleeanus è eterotallo, richiede un partner di accoppiamento complementare, e se quel partner è inaccessibile o viene utilizzato un tipo di accoppiamento simile, allora l'accoppiamento non avverrà 10,33,34.

Un limite di questo protocollo è lo sviluppo asincrono delle strutture sessuali. P. blakesleeanus, come altri funghi cresciuti su terreni solidi, si espande radialmente in tutte le direzioni. Ciò significa che porzioni del micelio si troveranno in fasi più avanzate del ciclo sessuale rispetto ad altre. Esistono protocolli per sincronizzare lo sviluppo sessuale negli Ascomiceti³⁵, ma questi non sono stati adattati con successo ai Mucoromiceti. Ciò significa che il lavoro che studia l'espressione genica durante il ciclo sessuale sarà soggetto a rumore se troppe cellule si trovano in diversi stadi di sviluppo. Date le osservazioni di questo studio, sembrerebbe che, mentre la limitazione della disponibilità di nutrienti porta a un minor numero di cellule che si riproducono sessualmente, le cellule osservate sembrano essere in stadi di sviluppo simili. Pertanto, la limitazione dei nutrienti può aiutare a limitare la densità delle strutture sessuali differenziate, garantendo a un ricercatore l'accesso a tessuti per lo più sincroni a scapito di rese inferiori.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Vorremmo ringraziare il Comitato Esecutivo di Scienze Naturali del Colorado College, il Dipartimento di Biologia ed Ecologia degli Organismi e l'Hevey Family Fund for Student Research per aver finanziato questo lavoro. Estendiamo anche la nostra gratitudine ad Alice Keller e Tia Hutchens per il loro supporto tecnico.