与粘霉菌 Phycomyces blakesleeanus 的性杂交

在这里，我们提出了一种诱导 P. blakesleeanus 交配的基本方案。

Phycomyces blakesleeanus 是毛霉菌门中的一种丝状真菌，以其非凡的环境感知和适应性反应能力而著称。虽然过去的工作表明，环境刺激，包括重力、光、水分和营养可用性，会影响其生长动态和繁殖策略，但潜在机制仍然是研究的重点领域。环境线索会触发有性或无性繁殖。有性生殖从信息素信号传导开始，它触发菌丝化学吸引，最终导致一系列形态转变，最终形成接合孢子。

在实验室环境中， P. blakesleeanus 的杂交导致互补菌丝体在不同阶段经历性周期。我们的工作旨在测试环境线索是否可以触发 P. blakesleeanus 菌丝体的交配。在营养限制培养基上生长的 P. blakesleeanus 杂交将受到营养限制的琼脂，以根据营养剥夺触发性反应。在 P. blakesleeanus 中成功触发交配将有助于未来需要在特定阶段进行大量有性繁殖菌丝体的研究。这项研究的结果将进一步增强我们对 P. blakesleeanus 生殖机制如何受环境因素影响的理解，从而有助于更广泛的丝状真菌有性繁殖知识库。

在实验室条件下真菌系统中交配的诱导促进了对真核遗传学、细胞生物学、进化生物学和生物技术的理解。dikaryan 真菌，特别是子囊菌门，具有关于实验室环境中交配诱导的最广泛知识¹。有趣的是，第一个提出有性繁殖的真菌 Syzygites megalocarpus 不是子囊菌门的成员，而是毛霉菌门² 的成员。毛霉菌门是一个早期分化的群体，以前被归类为“接合菌门”，但现在被认为是 Dikaryan 谱系的姐妹 ^3,4。毛霉菌门和毛霉菌门在进化上具有重要意义，因为这些门代表了真菌向陆地生态系统的过渡 ^4,5。与其他真菌一样，毛霉菌使用无性和有性生殖策略来响应其环境 ^3,6。在营养有限的条件下，粘液菌将开始性周期⁶。粘霉菌表现出同型和异型交配机制，其中相容性由交配型基因 sexM 和 sexP 决定，分别指定为 （-） 和 （+） ^7,8,9。

Blakeslee¹⁰ 强调了粘霉菌性周期对外部条件的敏感性，指出水分对其形成至关重要，并且基质中的营养可用性起着重要作用。互补交配类型通过使用 β-胡萝卜素作为前体协同合成三孢子酸 （TA） 开始有性周期 11,12,13。检测到 TA 后，响应的营养菌丝增厚并成为高度分枝的合子细胞 14,15,16。接合母细胞继续产生 TA 并相互趋化。在 P. blakesleeanus 中，合子细胞在底物内分化，在固体琼脂培养基上不易看到¹⁷。接触后，接合体交织在一起，成为空气接合体。

随着性周期的继续，受精卵的尖端附着，细胞的中间推出，形成一个环状结构，基部有珊瑚状肿胀，完成向前gametangium的过渡。形成前配子的细胞尖端开始融合并发育成配子。在配子阶段，合子细胞显示出荆棘状的装饰。尖端的细胞壁溶解并出现不定的隔膜，划定了颧子形成的区域，颧细胞充当钳状悬吊器¹⁸。随着细胞壁的增厚，接合孢子会变得有色，并获得额外的刺状装饰^17,18。一旦形成，接合孢子将进入休眠期，然后重新开始生长周期。

Phycomyces blakesleeanus 是一种异体粘液菌，以其大细胞和环境响应性孢子囊而闻名 ^6,8,18。这种生物体很容易在实验室中培养，并且在 8-10 天的时间内可以观察到导致接合孢子形成的性周期部分。作为一个模型，P. blakesleeanus 已经被检查了它在环境中感知光的能力^17,19。易于培养和诱导交配的能力也使其成为研究其感知光的能力背后的机制的理想模型²⁰;这些发现还强调了真菌中光感应机制的进化守恒性。在 P. blakesleeanus 中，光已被证明可以通过这些保守的感光蛋白抑制有性繁殖²¹。最近的进化发育研究试图了解哪些基因有助于 P. blakesleeanus 性周期中的细胞分化⁶。将形态发生与特定基因相关联需要分离出足够多的相同细胞类型的组织来进行基因表达研究。

虽然之前已经描述了在实验室环境中诱导 P. blakesleeanus 交配的方案，但有些只提到了要使用的培养基类型和相关菌株¹⁸。一些协议描述不包括特定的培养基配方，但确实描述了在板上放置假定互补交配类型的位置¹⁰。最近的方案允许通过混合每种交配类型的孢子并接种混合孢子悬浮液²¹ 或将交配类型相隔一定距离并让培养物孵育 20 天²² 来增加接合孢子的产生。这些方法可用于产生充足的分化细胞，特别是接合孢子，但可能不适合观察发育时间进程或选择在接合孢子之前形成的有性结构进行单细胞转录组学。其他工作通过将互补交配类型相距一定距离放置在固体介质上来解决这个问题，以便在有性周期开始时观察一系列形态转变 ^6,22,23。与其他真菌一样，P. blakesleeanus 菌丝体径向扩展^24,25。因此，当互补的交配类型在同一板上生长时，它们的菌丝体的不同部分将在不同的时间接触。由于菌丝体之间的接触是 P. blakesleeanus 性周期的第一步之一，这意味着相互作用的菌丝体的不同部分将处于性周期的不同阶段。这种异步可能会影响基因表达研究的结果，因此，如果分化的细胞类型是混合的，并且它们确实具有不同的基因表达程序，那么就很难将基因的作用归因于一种特定的结构。

除了 P. blakesleeanus 作为检查性周期中参与形态发生的基因的模型的价值外，其旺盛的生长和在几天内分化的能力使其成为培训对早期分化丝状真菌感兴趣的学生的理想真菌，并可用于本科课堂学习真菌的多样性及其发育过程。这里介绍的方案利用两种不同类型培养基的三种浓度来证明营养可用性对菌丝体外观、交配诱导和特定性结构富集的影响，用于定量、观察或潜在的单细胞转录组学。

1. 培养基制备

1. 将玉米粉琼脂 （CMA） 或马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 悬浮在去离子水中。对于 100% CMA 或 PDA，请按照制造商的说明将 17 g CMA 悬浮在 1 L 去离子水中，或在 39 g PDA 悬浮在 1 L 去离子水中。对于 N% CMA 或 PDA，悬浮 1/N 制造商推荐量，并补充额外的琼脂，以达到 7.5% （w/v） 的琼脂浓度。
   注：可选步骤：在高压灭菌之前，如果担心细菌污染，请添加 25 μg/mL 氯霉素。
2. 在高压灭菌器中对培养基进行消毒，在 121 °C 下 15 分钟。
3. 将培养基置于设置为 60 °C 的水浴中 30 分钟，将其冷却至 ~60 °C。
   注意：如果热介质瓶可以放置 6 秒，几乎没有不适感，则它可以倾倒。
4. 在无菌条件下将板倒入层流罩或生物安全柜中。将培养基瓶倾斜到打开的空培养皿上，倒入的量仅能完全覆盖底部。
   1. 或者，使用玻璃血清移液管，将 20 mL 培养基移液到每个板中。
      注：这种方法增加了培养基瓶处于较低温度的时间，并增加了琼脂过早凝固的风险。
5. 让介质重新凝固。如果不立即使用，请将板储存在 4 °C 下。

2. 准备真菌孢子或组织

1. 获得每种 P. blakesleeanus 交配类型（例如，NRRL 1555 （-）、NRRL 1554 （+）、NRRL 1464 （-） 和 NRRL 1465 （+））的培养物。为了用孢子接种杂交，首先在 100% CMA 或 PDA 的纯培养物中培养每种交配类型
2. 从现有培养物中切下一部分前沿菌丝体，并将切除的菌丝体放在 100% CMA/PDA 板上。将纯培养物在 27 °C 下在 12 小时光照循环下孵育 1 周。
3. 一旦存在孢子囊团，使用无菌技术在无菌去离子水中用 0.01% Tween 20 浸润孢子纯培养物。使用 P1000 微量移液器，从板中吸取 1.0 mL 吐温 20 孢子混合物，然后放入微量离心管中。
4. 在微型离心机中离心 30 秒，然后倒出上清液。
   1. 如果需要更多孢子，继续将 1.0 mL 的 Tween 20 孢子混合物加入同一微量离心管中，然后重复步骤 2.4。获得适量的孢子后，倒出上清液，并用 500 μL 无菌去离子水代替。
   2. 可选：使用血细胞计数器估计孢子的浓度，这将决定是否需要添加更多的水或是否需要重新离心孢子。
5. 或者，用来自纯培养物的前沿菌丝体接种杂交。
   1. 使用消毒的剃须刀片或软木孔蛀虫切除组织并立即接种。
6. 将交叉设置为 2 向交叉、4 向交叉或 8 向交叉（图 1）。
   注：如果要为转录组学工作设置杂交，建议为每个条件/培养基设置 1-2 个额外的板作为指示板。指示板允许研究人员限制暴露在实验板上，因为光线会抑制 P. blakesleeanus 的有性繁殖。
   1. 对于 2 向交叉，将互补的交配类型彼此相对放置（图 1A）。
      1. 将 （-） 交配型 NRRL 1555 或 NRRL 1464 的菌丝体放置在距离 PDA 或 CMA 培养皿边缘至少 1 厘米的地方。
      2. 在同一板上，与放置 （-） 交配型的位置相反，距离培养皿边缘 1 厘米，放置 （+） 交配型 NRRL 1554 或 NRRL1465（图 1A）。
         注意：互补交配类型之间的距离将影响参与有性周期的组织的大小。距离较远的交配类型使菌丝体扩张得更多，这将增加两个伴侣之间的性互动次数。
   2. 对于 4 向交叉，将相似的交配类型彼此相对但相邻于互补的交配类型放置（图 1B）。
      1. 将 （-） 交配型 NRRL 1555 和 NRRL 1464 的孢子或菌丝体彼此相对放置，距离 PDA 或 CMA 培养皿的边缘至少 1 厘米。
      2. 在同一板上，在两种 （-） 交配类型之间选择一个位置，距离板边缘至少 1 厘米，并用 （+） 交配类型 NRRL 1554 或 1465 的孢子或菌丝体接种该部位。
      3. 在同一块板上，与第一个 （+） 交配类型接种的相对位置，距离板至少 1 厘米，放置另一个 （+） 交配类型。
   3. 对于 8 向交叉，沿培养皿外围交替交配类型，每种交配类型有四个（图 1C）。
7. 接种后，用封口膜或（保持未密封）密封板并将其放入二级容器中，然后在 22 °C 下避光孵育。每天观察板以寻找交配的证据，从板下方拍照，并随着培养物的生长追踪菌丝体。
   注意：接种后 24 小时后，预计会看到菌丝体在所有培养基类型上扩展，但在这个阶段个体不太可能接触。
8. 根据培养基类型（PDA 或 CMA）和配方（25%、50%、100%），如果菌丝体开始接触，请检查在解剖镜下接触的互补交配类型的菌丝体，寻找交配的证据。用安装在解剖镜上的相机或智能手机拍摄相互作用的菌丝体的照片。
   1. 获取菌丝体的图像并将它们拼接在一起（例如，使用 Panorama Stitcher 应用程序）。使用 ImageJ 估计菌丝体的面积（参见在线教程）。

在 4 向杂交之后，每个菌株的生长速率略有不同，这取决于菌丝体面积的变化（图 2）。虽然没有统计学意义，但当接种在 25% CMA、25% PDA 或 100% PDA 上时，NRRL 1555 的面积变化更快。同样，当在 50% PDA 或 CMA 上生长时，NRRL 1465 的面积变化更大。NRRL 1464 在 100% CMA 上生长时面积增加最快。24 小时 （1 DPI） 后，相对于在 CMA 上生长的菌株，在 PDA 上生长的菌株显得更黄（图 3）-PDA 先前已被证明可以增加色素产生²⁶。平均而言，100% PDA 上的菌株在 24 小时后具有更高的面积测量值（表 1）。这与 25% CMA 形成鲜明对比，后者在 1 DPI 时的平均面积最小（表 1）。

直到 2 DPI 才观察到相邻菌株之间的接触，并且仅在 PDA 上生长的菌株之间，尤其是 100% PDA（图 4）。在 2 DPI 的 100% PDA 上观察到交配。在 CMA 上生长的菌株在 2 DPI 时没有接触，尽管 100% CMA 的菌株彼此非常接近（图 4）。孵育 3 天 （3 DPI） 后，在所有 PDA 制剂上生长的菌株表现出交配，尽管分化细胞类型的密度不同（表 2 和 图 5）。一个 25% CMA 的重复和一个 50% CMA 的重复也表现出交配（表 2）;其余的 CMA 板没有表现出任何交配（表 2）。有趣的是，在 PDA 上生长的菌株似乎具有更密集的黄色菌丝体和气生菌丝，它们可能已经发展成孢子囊（图 5）。到 4 DPI 时，PDA 板与无性孢子囊一起表现出交配反应（图 6）。CMA 板具有具有更多弥漫菌丝体和较少孢子囊的菌株（图 6）。在 100% CMA 上未观察到交配（表 2）。

在 4 DPI 的解剖镜下观察代表性板，以评估是否容易观察到与性周期开始相关的细胞类型。一般来说，营养物质浓度的降低与定性密度较低、分化的有性菌丝体相关（图 7 和 图 8）。当在 100% PDA 上生长时，单个空气合子或前合子无法可视化，并表现为细胞团（图 7A）。虽然 50% 和 25% PDA 在交配部位的细胞密度似乎较低，但 25% PDA 板的细胞很容易区分（图 7B、C）。当比较在 50% PDA 和 25% PDA 中观察到的细胞类型时，较低浓度的细胞似乎主要是同一类型，而在较高浓度下，存在不同阶段的细胞混合（图 7D，E）。值得注意的是，在 50% PDA 的情况下，在 4 DPI 下观察到的细胞包括刚刚出现的空气合子细胞（图 7D，星号）和一些正在过渡到 progametangia 的细胞（图 7D，箭头）。对于 25% 的 PDA，大多数细胞似乎处于非常相似的发育阶段（图 7E）。

在 4 DPI 下与 PDA 板一起评估各种浓度的 CMA 板（图 8）。如前所述，当使用 100% CMA 时未观察到交配（图 8A）。在 50% CMA 或 25% CMA 时，观察到交配，并且与有性生殖相关的细胞类型的总数较低（图 8B，C）。在 4 DPI 处观察到的空气合母在整个相互作用区似乎具有相同的大小和高度（图 8B，C）。鉴于参与性周期的细胞总数较低，可以假设用消毒的剃须刀片或解剖针切除这些细胞，并立即在液氮中冷冻以进行下游 RNA 分离。能够在同一发育时间点选择特定结构可能会增加寻求将形态变化与基因联系起来的基因表达研究的稳健性。

图 1：三种交叉格式的示意图。 （A） 具有两个接种位点（黄色圆圈）的 2 向交叉，具有互补的交配类型 （+） 和 （-）。（B） 一个 4 向杂交，具有两个 （+） 交配型接种位点（带 + 的黄色圆圈）和两个 （-） 交配型接种位点（带 - 的黄色圆圈）。（C） 具有互补交配类型 （+） 和 （-） 的交替接种位点（黄色圆圈）的 8 向杂交。虚线表示预测的交配相互作用部位。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：不同浓度的 CMA 和 PDA 上每种菌株的面积随时间的变化。 在接种后 3 天内绘制 P. blakesleeanus 菌落的平均面积。误差线表示平均面积的标准差。另请参阅 表 1。绘图是使用 ggplot2²⁷ 生成的。缩写：DPI = 接种后天数。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：接种后 1 天 4 向杂交的代表性图像。 菌落比较显示了不同培养基类型和配方的差异，突出表明 100% PDA 上的菌落看起来比 CMA 更黄，而 100% PDA 上的生长看起来更快。图像是从培养皿的底部拍摄的。用记号笔画黑线勾勒出菌丝体的轮廓。缩写：CMA = 玉米面琼脂;PDA = 马铃薯葡萄糖琼脂;DPI = 接种后天数。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：接种后 2 天 4 向杂交的代表性图像。 菌落比较突出了菌丝生长的表观密度，其中 PDA 上的菌落似乎比 CMA 上的菌丝体更致密。此外，PDA 上的菌落看起来更黄，并且大多数菌落已经接触或接近接触点。红色箭头突出显示了已经开始交配相互作用的区域，如组织密度的增加所示。这与 CMA 上的菌落形成鲜明对比，在 CMA 上，只有 100% CMA 上的菌落接近接触，并且所有 CMA 制剂的菌落与 PDA 上的菌落相比，菌落的黄色相对较弱，并且没有菌落开始交配。图像是从培养皿的底部拍摄的。用记号笔画黑线勾勒出菌丝体的轮廓。缩写：CMA = 玉米面琼脂;PDA = 马铃薯葡萄糖琼脂;DPI = 接种后天数。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：接种后 3 天 4 向杂交的代表性图像。 两种培养基类型之间的菌落比较突出表明，与 CMA 相比，在 PDA 上生长的菌丝密度更高。红色箭头突出显示所有 PDA 板都至少承载一个配接相互作用位点。100% CMA 和 50% CMA 上的菌落未接触，但 25% CMA（蓝色箭头）上的两个菌落已接触。图像是从培养皿上方拍摄的。缩写：CMA = 玉米面琼脂;PDA = 马铃薯葡萄糖琼脂;DPI = 接种后天数。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6：接种后 4 天 4 向杂交的代表性图像。 PDA 上的所有菌落都至少承载一次交配相互作用（红色箭头），并显示黄色菌丝体。此外，PDA 上的菌落显示气生菌丝（即无性孢子囊）的广泛生长，这可能会阻碍对交配相互作用的观察。与 PDA 上的菌落相比，50% 和 25% CMA 上的菌落也表现出交配相互作用（红色箭头）的证据，并且空气菌丝生长较少。图像是从培养皿上方拍摄的。缩写：CMA = 玉米面琼脂;PDA = 马铃薯葡萄糖琼脂;DPI = 接种后天数。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7：PDA 上的杂交图像。 （A） 100% PDA，（B） 50% PDA 和 （C） 25% PDA。感兴趣的区域被放大（红色矩形）。所有图像均以 4 DPI 采集。（D） 50% PDA 的另一种观点强调了不同阶段有性繁殖细胞的存在：年轻的气生接合细胞：星号;较老的空中合子：红色箭头。（E） 25% PDA 在不同阶段表现出有性繁殖细胞，尽管与 50% PDA 相比，这种代表性视图显示这些结构的拥挤程度较低。比例尺 = 1 毫米 （A-C），0.5 毫米 （D，E）。缩写：PDA = 马铃薯葡萄糖琼脂;DPI = 接种后天数。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 8：CMA 上的交叉图像。 （A） 100% CMA、（B） 50% CMA 和 （C） 25% CMA，放大感兴趣区域。对于 50% （B） 和 25% （C） CMA，很容易观察到不同的性结构，并且拥挤程度最低。此时在 100% CMA 上未观察到性结构。所有图像均以 4 DPI 采集。培养皿图像和解剖镜图像是从培养皿上方获得的。解剖镜图像背景中的黑线是用黑色标记绘制的，该标记用于跟踪菌丝体的扩增。比例尺 = 1 毫米。缩写：CMA = 玉米面琼脂;DPI = 接种后天数。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：每种菌株在 4 天内的菌丝体面积。请点击此处下载此表格。

表 2：不同介质上每种菌株的接触和交配的成对评估。0 = 否，1 = 是。请点击此处下载此表格。

这里介绍了在实验室环境中诱导 P. blakesleeanus 有性繁殖的简单方案。该方案最关键的考虑因素之一是营养限制。据推测，真菌选择有性繁殖作为对恶劣环境条件（如营养限制）的反应 6,28,29,30,31,32。改变营养物质的水平可以为实验设计提供信息。例如，如果研究人员有兴趣比较空气合子细胞与配子体内表达的基因，那么建议采用更极端的营养限制（例如 25% CMA），因为与 CMA 或 PDA 的高级制剂相比，有性结构的密度会更低。较低的有性结构密度，例如用 50% 或 25% CMA 观察到的结构，意味着分离特定的分化细胞类型不仅更容易（因为细胞很容易识别和切除），而且还能确保只对感兴趣的细胞类型进行采样。

受训者或学生也将从该协议中受益，因为它使该组能够追踪细胞分化并可靠地区分在 P. blakesleeanus 性周期中发育的各种细胞类型。CMA 和 PDA 的使用反映了先前在诱导粘霉菌交配方面的工作 18,22,23，并且粉末形式可供购买，与其他合成培养基相比，它们成为培训或教育环境中更容易获得的培养基选择之一。

由于该协议的最终目标是证明发育和分化，并且已经指出营养浓度会影响是否易于观察到不同的细胞类型，因此该协议中的一个关键步骤是确保适当的培养基组成（协议第 1 节）。如果未向稀释的 PDA 或 CMA 中添加额外的琼脂粉，培养基可能无法正常凝固，并且可能不容易观察到随后的交配相互作用。此外，应密切注意互补和相似交配类型的放置（协议第 2 节）。由于 P. blakesleeanus 是异丘的，它需要一个互补的交配伙伴，如果该伙伴无法接近或改用类似的交配类型，则不会发生交配 10,33,34。

该协议的一个限制是性结构的异步发展。 P. blakesleeanus 与在固体培养基上生长的其他真菌一样，向各个方向径向扩展。这意味着菌丝体的某些部分将比其他部分处于性周期的更高级阶段。存在同步子囊菌³⁵ 性发育的方案，但这些方案尚未成功适应粘菌。这意味着，如果太多细胞处于不同的发育阶段，研究性周期中基因表达的工作将受到噪音的影响。鉴于本研究中的观察结果，虽然限制营养物质的可用性会导致整体有性繁殖细胞减少，但观察到的细胞似乎处于相似的发育阶段。因此，营养物质的限制可能有助于限制分化性结构的密度，使研究人员能够以较低的产量为代价获得大部分同步的组织。

作者没有需要声明的利益冲突。

我们要感谢科罗拉多学院自然科学执行委员会、有机生物学和生态学系以及 Hevey 家庭学生研究基金对这项工作的资助。我们还要感谢 Alice Keller 和 Tia Hutchens 提供的技术支持。