Croisements sexuels avec le mucoromycète Phycomyces blakesleeanus

Nous présentons ici un protocole de base pour l’induction de l’accouplement de P. blakesleeanis .

Phycomyces blakesleeanus, un champignon filamenteux de l’embranchement des Mucoromycètes, se distingue par sa remarquable capacité de perception de l’environnement et de réponses adaptatives. Bien que des travaux antérieurs aient montré que les stimuli environnementaux, notamment la gravité, la lumière, l’humidité et la disponibilité des nutriments, influencent sa dynamique de croissance et ses stratégies de reproduction, les mécanismes sous-jacents restent un domaine de recherche. Les signaux environnementaux déclenchent la reproduction sexuée ou asexuée. La reproduction sexuée commence par la signalisation des phéromones, qui déclenche la chimioattraction des hyphes, conduisant finalement à des transitions morphologiques en série culminant dans la formation d’une zygospore.

En laboratoire, les croisements de P. blakesleeanus permettent d’obtenir des mycéliums complémentaires subissant le cycle sexuel à différents stades. Notre travail vise à tester si les signaux environnementaux peuvent déclencher l’accouplement à travers le mycélium de P. blakesleeanus. Les croisements de P. blakesleeanucultivés sur des milieux pauvres en nutriments seront soumis à une gélose limitée en nutriments pour déclencher une réponse sexuelle conforme à la privation en nutriments. Le déclenchement réussi de l’accouplement chez P. blakesleeanus facilitera les études futures qui nécessitent une grande quantité de mycélium à reproduction sexuée à des stades spécifiques. Les résultats de cette recherche permettront d’améliorer notre compréhension de la façon dont les mécanismes de reproduction de P. blakesleeanus sont influencés par les facteurs environnementaux, contribuant ainsi à l’élargissement de la base de connaissances sur la reproduction sexuée des champignons filamenteux.

L’induction de l’accouplement dans les systèmes fongiques dans des conditions de laboratoire a fait progresser la compréhension de la génétique eucaryote, de la biologie cellulaire, de la biologie évolutive et de la biotechnologie. Les champignons dikariens, en particulier les Ascomycètes, présentent les connaissances les plus approfondies sur l’induction de l’accouplement en laboratoire¹. Il est intéressant de noter que le premier champignon pour lequel la reproduction sexuée a été proposée, Syzygites megalocarpus, n’est pas membre d’Ascomycota, mais plutôt membre de l’embranchement Mucoromycota². L’embranchement des Mucoromycota est un groupe à divergence précoce, autrefois classé comme « Zygomycota », mais maintenant considéré comme frère des lignées Dikaryan ^3,4. Les Mucoromycota, ainsi que les Zoopagomycota, sont importants sur le plan évolutif car ces embranchements représentent la transition des champignons vers les écosystèmes terrestres ^4,5. Comme d’autres champignons, les Mucoromycètes utilisent des stratégies de reproduction asexuée et sexuée en réponse à leur environnement ^3,6. Dans des conditions limitées en nutriments, les mucoromycètes commenceront le cycle sexuel⁶. Les mucoromycètes présentent des mécanismes d’accouplement homothalliques et hétérothalliques, où la compatibilité est déterminée par les gènes de type d’accouplement sexM et sexP, désignés respectivement par (-) et (+) ^7,8,9.

Blakeslee¹⁰ a souligné la sensibilité du cycle sexuel des mucoromycètes aux conditions externes, notant que l’humidité est essentielle à leur formation et que la disponibilité des nutriments dans le substrat joue un rôle important. Les types d’accouplement complémentaires commencent le cycle sexuel par synthèse coopérative d’acides trisporiques (AT) en utilisant le bêta-carotène comme précurseur 11,12,13. Suite à la détection de l’AT, les hyphes végétatifs répondants s’épaississent et deviennent des zygophores très ramifiés 14,15,16. Les zygophores continuent la production de TA et se chimioattirent mutuellement. Chez P. blakesleeanus, les zygophores se différencient à l’intérieur du substrat et ne sont pas facilement visibles sur les milieux gélés solides¹⁷. Au contact, les zygophores s’entrelacent et deviennent des zygophores aériens.

Au fur et à mesure que le cycle sexuel se poursuit, les extrémités des zygophores s’attachent et le milieu des cellules s’étend pour former une structure en forme d’anneau avec un gonflement coralloïde à la base, complétant la transition vers le progametangium. Les extrémités des cellules formant le progametangium commencent à fusionner et à se développer dans le gamétangium. Au stade de gametangia, les zygophores présentent une ornementation semblable à celle d’épines. La paroi cellulaire aux extrémités se dissout et des septa adventifs apparaissent, délimitant la zone où les zygospores vont se former, et les zygophores agissent comme des suspenseurs comme des pinces¹⁸. La zygospore se pigmente à mesure que sa paroi cellulaire s’épaissit et qu’elle acquiert une ornementation supplémentaire semblable à une épine^17,18. Une fois formée, la zygospore entrera dans une période de dormance avant de redémarrer le cycle de croissance.

Phycomyces blakesleeanus est un mucoromycète hétérothallique connu pour ses grandes cellules et ses sporangiophores sensibles à l’environnement ^6,8,18. Cet organisme est facilement cultivé en laboratoire et les parties du cycle sexuel menant à la formation de zygospores peuvent être observées en l’espace de 8 à 10 jours. En tant que modèle, P. blakesleeanus a été examiné pour sa capacité à détecter la lumière dans son environnement^17,19. La facilité de culture et la capacité d’induire l’accouplement en ont également fait un modèle idéal pour étudier le mécanisme derrière sa capacité à percevoir la lumière²⁰ ; Ces résultats ont également mis en évidence la conservation évolutive des mécanismes de détection de la lumière chez les champignons. Chez P. blakesleeanus, il a été démontré que la lumière inhibe la reproduction sexuée via ces protéines photosensibles conservées²¹. Des études récentes sur le développement évolutif ont cherché à comprendre quels gènes contribuent à la différenciation cellulaire au cours du cycle sexuel⁶ de P. blakesleeanis. La corrélation de la morphogenèse avec des gènes spécifiques nécessiterait qu’une quantité suffisante de tissus des mêmes types de cellules soit isolée pour effectuer des études d’expression génique.

Bien que des protocoles aient déjà été décrits pour induire l’accouplement de P. blakesleeanus en laboratoire, certains ne mentionnent que le type de milieu à utiliser et les souches pertinentes¹⁸. Certaines descriptions de protocole n’incluent pas de formulation de milieu spécifique, mais décrivent où positionner les types d’accouplement complémentaires présumés sur une planche¹⁰. Des protocoles plus récents permettent d’augmenter la production de zygospores en mélangeant les spores de chaque type d’accouplement et en les inoculant avec la suspension de spores mixtes²¹, soit en plaçant les types d’accouplement à une certaine distance et en laissant la culture incuber pendant 20 jours²². Ces approches sont utiles pour générer un grand nombre de cellules différenciées, en particulier des zygospores, mais peuvent ne pas convenir pour observer un cours temporel du développement ou sélectionner des structures sexuées qui se forment avant les zygospores pour la transcriptomique unicellulaire. D’autres travaux ont abordé ce problème en plaçant des types d’accouplement complémentaires à distance sur des milieux solides pour permettre l’observation de transitions morphologiques en série au début du cycle sexuel ^6,22,23. Comme c’est le cas pour d’autres champignons, le mycélium de P. blakesleeanus s’étend radialement^24,25. Par conséquent, lorsque des types d’accouplement complémentaires sont cultivés sur la même plaque, différentes parties de leur mycélium entreront en contact à des moments différents. Étant donné que le contact entre les mycéliums est l’une des premières étapes du cycle sexuel de P. blakesleenus, cela signifie que différentes parties du mycélium en interaction se trouveront à différents stades du cycle sexuel. Cette asynchronie pourrait avoir un impact sur le résultat d’une étude d’expression génique, de sorte que si les types de cellules différenciés sont mélangés et s’ils ont des programmes d’expression génique distincts, il serait difficile d’attribuer le rôle d’un gène à une structure particulière.

En plus de la valeur de P. blakesleeanus en tant que modèle pour l’examen des gènes impliqués dans la morphogenèse au cours du cycle sexuel, sa croissance vigoureuse et sa capacité à se différencier en l’espace de quelques jours en font un champignon idéal pour la formation des étudiants intéressés par les champignons filamenteux à divergence précoce et pour une utilisation dans une salle de classe de premier cycle pour en apprendre davantage sur la diversité des champignons et leurs processus de développement. Le protocole présenté ici utilise trois concentrations de deux types de milieux différents pour démontrer l’effet de la disponibilité des nutriments sur l’apparence du mycélium, l’induction de l’accouplement et l’enrichissement de structures sexuelles particulières, soit pour la quantification, l’observation ou la transcriptomique potentielle d’une cellule unique.

1. Préparation des supports

1. Mettre en suspension la gélose à la semoule de maïs (CMA) ou la gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) dans de l’eau désionisée. Pour 100 % CMA ou PDA, suivez les instructions du fabricant et suspendez 17 g de CMA dans 1 L d’eau déminéralisée ou 39 g de PCA dans 1 L d’eau déminéralisée. Pour N % CMA ou PDA, suspendre 1/N de la quantité recommandée par le fabricant et compléter avec de la gélose supplémentaire pour obtenir une concentration de gélose de 7,5 % (p/v).
   REMARQUE : Étape facultative : Avant l’autoclavage, ajouter 25 μg/mL de chloramphénicol si la contamination bactérienne est préoccupante.
2. Stériliser les milieux en autoclave, à 121 °C pendant 15 min.
3. Refroidissez le média à ~60 °C en le plaçant pendant 30 min dans un bain-marie réglé à 60 °C.
   REMARQUE : Si la bouteille de média chaud peut être maintenue pendant 6 s avec peu ou pas d’inconfort, alors elle est prête à être versée.
4. Verser les plaques dans des conditions aseptiques dans une hotte à flux laminaire ou une enceinte de sécurité biologique. Inclinez la bouteille de média au-dessus d’une boîte de Pétri ouverte et vide et versez-la juste assez pour couvrir complètement le fond.
   1. Vous pouvez également utiliser une pipette sérologique en verre et pipeter 20 mL de milieu dans chaque plaque.
      REMARQUE : Cette approche augmente le temps pendant lequel la bouteille de média est à une température plus basse et augmente le risque de solidifier prématurément la gélose.
5. Laissez le support se resolidifier. Stockez les plaques à 4 °C si elles ne sont pas utilisées immédiatement.

2. Préparation des spores ou des tissus fongiques

1. Obtenir des cultures de chaque type d’accouplement de P. blakesleeanus (p. ex. NRRL 1555 (-), NRRL 1554 (+), NRRL 1464 (-) et NRRL 1465 (+)). Pour inoculer des croisements avec des spores, cultivez d’abord chaque type d’accouplement en culture pure sur 100 % CMA ou PDA
2. Coupez une partie du mycélium de pointe à partir de cultures existantes et placez le mycélium excisé sur une plaque 100 % CMA/PDA. Incuber des cultures pures pendant 1 semaine à 27 °C sous un cycle de lumière de 12 heures.
3. Une fois que les sporangiophores sont présents, inonder une culture pure sporulante avec 0,01 % de Tween 20 dans de l’eau stérilisée et désionisée en utilisant une technique aseptique. À l’aide d’une micropipette P1000, prélevez 1,0 mL du mélange de 20 spores Tween de la plaque et dans un tube de microcentrifugation.
4. Centrifuger dans une mini centrifugeuse pendant 30 s, puis décanter le surnageant.
   1. Si d’autres spores sont nécessaires, continuez à ajouter 1,0 mL du mélange de spores Tween 20 dans le même tube de microcentrifugation et répétez l’étape 2.4. Après avoir obtenu une quantité appropriée de spores, décantez le surnageant et remplacez-le par 500 μL d’eau désionisée stérile.
   2. Facultatif : Utilisez un hémacytomètre pour estimer la concentration des spores, ce qui permettra de savoir si plus d’eau doit être ajoutée ou si les spores doivent être recentriflées.
5. Vous pouvez également inoculer les croisements avec du mycélium de pointe à partir des cultures pures.
   1. Utilisez une lame de rasoir stérilisée ou une perceuse de trou de liège pour exciser le tissu et plaquer l’inoculum immédiatement.
6. Configurez les croix en tant que croix à 2 voies, croix à 4 voies ou croix à 8 voies (Figure 1).
   REMARQUE : Si des croix sont mises en place pour le travail transcriptomique, il est recommandé d’installer 1 à 2 plaques supplémentaires par condition/milieu pour servir de plaques indicatrices. Les plaques indicatrices permettent aux chercheurs de limiter l’exposition à la lumière aux plaques expérimentales, car la lumière inhibe la reproduction sexuée chez P. blakesleeanus.
   1. Pour un croisement à 2 voies, placez les types d’accouplement complémentaires l’un en face de l’autre (Figure 1A).
      1. Placez le mycélium du type (-) d’accouplement, NRRL 1555 ou NRRL 1464, à au moins 1 cm du bord d’une boîte de Pétri sur PDA ou CMA.
      2. Sur la même plaque, à l’opposé de l’endroit où le type d’accouplement (-) a été placé et à 1 cm du bord de la boîte de Pétri, placez le type d’accouplement (+), NRRL 1554 ou NRRL1465 (Figure 1A).
         REMARQUE : La distance entre les types d’accouplement complémentaires influencera la taille du tissu participant au cycle sexuel. Les types d’accouplement plus éloignés permettent au mycélium de s’étendre davantage, ce qui augmentera le nombre d’interactions sexuelles entre les deux partenaires.
   2. Pour un croisement à 4 voies, placez les types d’accouplement similaires l’un en face de l’autre mais à côté d’un type d’accouplement complémentaire (Figure 1B).
      1. Placez les spores ou le mycélium des types d’accouplement (-), NRRL 1555 et NRRL 1464, l’un en face de l’autre à au moins 1 cm du bord d’une boîte de Pétri sur PDA ou CMA.
      2. Sur la même plaque, choisissez un emplacement entre les deux (-) types d’accouplement et à au moins 1 cm du bord de la plaque et inoculez le site avec des spores ou des mycéliums du type d’accouplement (+), NRRL 1554 ou 1465.
      3. Sur la même plaque, à l’opposé de l’endroit où le premier type d’accouplement (+) a été inoculé et à au moins 1 cm de la plaque, placez l’autre type d’accouplement (+).
   3. Pour un croisement à 8 voies, alternez les types d’accouplement le long de la périphérie de la boîte de Pétri, avec quatre de chaque type d’accouplement (Figure 1C).
7. Après l’inoculation, scellez les plaques avec du parafilm ou (laissez-les descellées) et placez-les dans un récipient secondaire avant de les incuber à 22 °C dans l’obscurité. Observez les plaques tous les jours pour détecter des signes d’accouplement pendant cette période, prenez des photos sous la plaque et tracez le mycélium au fur et à mesure que les cultures se développent.
   REMARQUE : Après 24 heures après l’inoculation, attendez-vous à voir le mycélium s’étendre sur tous les types de milieux, mais il est peu probable que les individus soient en contact à ce stade.
8. Selon le type de milieu (PDA ou CMA) et la formulation (25 %, 50 %, 100 %), si le mycélium commence à entrer en contact, inspecter les mycéliums des types d’accouplement complémentaires qui sont en contact sous une lunette de dissection pour détecter des signes d’accouplement. Prenez des photos du mycélium en interaction avec un appareil photo ou un smartphone monté sur la lunette de dissection.
   1. Acquérez des images de mycélium et assemblez-les (par exemple, à l’aide de l’application Panorama Stitcher). Utilisez ImageJ pour estimer l’aire du mycélium (voir tutoriels en ligne).

À la suite d’un croisement à 4 voies, le taux de croissance de chaque souche variait légèrement, déterminé par le changement de surface du mycélium (figure 2). Bien qu’il ne soit pas statistiquement significatif, le NRRL 1555 présentait un changement de surface plus rapide lorsqu’il était plaqué sur 25 % de CMA, 25 % de PDA ou 100 % de PDA. De même, la variété NRRL 1465 présentait une variation de superficie plus importante lorsqu’elle était cultivée avec 50 % de PDA ou de CMA. La lignée NRRL 1464 a connu l’augmentation la plus rapide de sa superficie lorsqu’elle a été cultivée à 100 % CMA. Après 24 h (1 DPI), les souches cultivées sur la PCA apparaissaient plus jaunes que les souches cultivées sur la CMA (Figure 3) - Il a déjà été démontré que la PDA augmentait la production de pigment²⁶. Les souches à 100 % de PDA avaient, en moyenne, une mesure de surface plus élevée après 24 h (tableau 1). Cela contraste avec la RMR de 25 %, qui avait la plus petite superficie moyenne à 1 DPI (tableau 1).

Le contact entre les souches voisines n’a pas été observé avant 2 DPI et seulement entre les souches cultivées sur PDA, en particulier 100 % PDA (Figure 4). L’accouplement a été observé sur 100 % de PDA à 2 DPI. Les souches cultivées sur CMA n’ont pas été en contact à 2 DPI, bien que 100 % des CMA aient présenté des souches qui poussaient très près les unes des autres (figure 4). Après 3 jours d’incubation (3 DPI), les souches cultivées sur toutes les formulations de PDA ont montré un accouplement, bien que la densité des types cellulaires différenciés diffère (tableau 2 et figure 5). Une répétition de 25 % de CMA et une répétition de 50 % de CMA ont également présenté un accouplement (tableau 2) ; les autres plaques de CMA n’ont montré aucun accouplement (tableau 2). Il est intéressant de noter que les souches cultivées sur la PDA semblaient avoir un mycélium jaune plus dense et des hyphes aériens, qui auraient pu se transformer en sporangiophores (figure 5). À 4 DPI, les plaques PDA présentaient des réactions d’accouplement aux côtés de sporangiophores asexués (Figure 6). Les plaques CMA présentaient des souches avec un mycélium plus diffus et moins de sporangiophores (figure 6). L’accouplement n’a pas été observé chez les RMR à 100 % (tableau 2).

Des plaques représentatives ont été observées sous une lunette de dissection à 4 DPI pour évaluer si les types de cellules associés au début du cycle sexuel pouvaient être facilement observés. En général, une concentration décroissante de nutriments était corrélée à un mycélium sexué qualitativement moins dense et différencié (figures 7 et 8). Lorsqu’ils étaient cultivés avec 100 % de PDA, les zygophores aériens individuels ou les progametangia n’ont pas pu être visualisés et sont apparus comme une masse de cellules (figure 7A). Alors que 50 % et 25 % de la PDA semblaient avoir une densité cellulaire plus faible au site de l’accouplement, les plaques de la PDA à 25 % présentaient des cellules qui pouvaient être facilement distinguées (figures 7B et C). En comparant les types de cellules observées dans 50 % de PDA à 25 %, celles à la concentration la plus faible semblaient être principalement du même type, tandis qu’à la concentration plus élevée, il y avait un mélange de cellules à différents stades (figures 7D et E). Notamment, avec 50 % de PDA, les cellules observées à 4 DPI comprenaient des zygophores aériens qui venaient d’émerger (Figure 7D, astérisque) et certains qui étaient en transition vers la progametangia (Figure 7D, flèche). Avec 25 % de PCA, la plupart des cellules semblaient être à des stades de développement très similaires (Figure 7E).

Les plaques des différentes concentrations de CMA ont été évaluées en même temps que les plaques de PDA à 4 DPI (figure 8). Comme nous l’avons mentionné précédemment, l’accouplement n’a pas été observé lorsque 100 % de la CMA a été utilisé (figure 8A). À 50 % des CMA ou à 25 % des CMA, l’accouplement a été observé et le nombre total de types de cellules associés à la reproduction sexuée était plus faible (figures 8B et C). Les zygophores aériens observés à 4 DPI semblaient être de la même taille et de la même hauteur dans toute la zone d’interaction (Figure 8B,C). Étant donné le nombre global plus faible de cellules participant au cycle sexuel, celles-ci pourraient hypothétiquement être excisées avec des lames de rasoir stérilisées ou des aiguilles de dissection et immédiatement congelées dans de l’azote liquide pour l’isolement de l’ARN en aval. Être capable de sélectionner des structures spécifiques au même moment de développement peut augmenter la robustesse des études d’expression génique cherchant à relier les changements morphologiques aux gènes.

Figure 1 : Schéma de trois formats de croisement. (A) Un croisement à 2 voies avec deux sites d’inoculation (cercles jaunes) avec des types d’accouplement complémentaires (+) et (-). (B) un croisement à 4 voies avec deux sites d’inoculation de type (+) (cercles jaunes avec +) et deux sites d’inoculation de type (-) (cercles jaunes avec -). (C) Un croisement à 8 voies avec une alternance de sites d’inoculation (cercles jaunes) de types d’accouplement complémentaires (+) et (-). Les lignes pointillées représentent le site prédit des interactions d’accouplement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Variation de la superficie au fil du temps pour chaque souche de CMA et de PDA à différentes concentrations. La superficie moyenne des colonies de P. blakesleeanus a été calculée sur une période de 3 jours après l’inoculation. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la surface moyenne. Voir aussi le tableau 1. Les graphiques ont été générés avec ggplot2²⁷. Abréviation : DPI = jours après l’inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images représentatives de croisements à 4 voies 1 jour après l’inoculation. La comparaison des colonies montre des différences entre les types de milieux et les formulations, soulignant que les colonies avec 100 % de PDA apparaissent plus jaunes que les CMA et que la croissance semble plus rapide avec 100 % de PDA. Les images ont été prises depuis le bas de la boîte de Pétri. Des lignes noires ont été tracées avec un marqueur pour délimiter le mycélium. Abréviations : CMA = gélose à la semoule de maïs ; PDA = gélose au dextrose de pomme de terre ; DPI = jours après l’inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Images représentatives de croisements à 4 voies 2 jours après l’inoculation. La comparaison des colonies met en évidence la densité apparente de la croissance mycélienne, où les colonies sur la PDA semblent avoir un mycélium plus dense que celles sur la CMA. De plus, les colonies sur la PCA apparaissent plus jaunes et la plupart ont soit établi un contact, soit s’approchent du point de contact. Les pointes de flèches rouges mettent en évidence les zones où les interactions d’accouplement ont commencé, comme l’indique une augmentation de la densité des tissus. Cela contraste avec les colonies sur la CMA où seules celles sur 100 % de CMA sont proches du contact, et toutes les formulations de CMA présentent des colonies qui sont relativement moins jaunes que celles sur la PDA et aucune n’a commencé à s’accoupler. Les images ont été prises depuis le bas de la boîte de Pétri. Des lignes noires ont été tracées avec un marqueur pour délimiter le mycélium. Abréviations : CMA = gélose à la semoule de maïs ; PDA = gélose au dextrose de pomme de terre ; DPI = jours après l’inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images représentatives de croisements à 4 voies 3 jours après l’inoculation. La comparaison des colonies entre les deux types de milieux met en évidence que la densité mycélienne est plus élevée lorsqu’ils sont cultivés sur de la PDA que sur des CMA. Les pointes de flèches rouges mettent en évidence que toutes les plaques PDA hébergent au moins un site d’interactions d’accouplement. Les colonies de 100 % de CMA et de 50 % de CMA n’ont pas été en contact, mais deux colonies de 25 % de CMA (flèche bleue) ont établi un contact. Les images ont été prises au-dessus de la boîte de Pétri. Abréviations : CMA = gélose à la semoule de maïs ; PDA = gélose au dextrose de pomme de terre ; DPI = jours après l’inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Images représentatives de croisements à 4 voies 4 jours après l’inoculation. Toutes les colonies sur la PDA hébergent au moins une interaction d’accouplement (flèches rouges) et présentent un mycélium jaune. De plus, les colonies sur la PDA montrent une croissance extensive d’hyphes aériens (c’est-à-dire des sporanges asexués) qui peuvent entraver l’observation des interactions d’accouplement. Les colonies sur 50 % et 25 % de CMA présentent également des signes d’interactions d’accouplement (pointes de flèches rouges) et ont moins de croissance d’hyphes aériens que celles sur la PDA. Les images ont été prises au-dessus de la boîte de Pétri. Abréviations : CMA = gélose à la semoule de maïs ; PDA = gélose au dextrose de pomme de terre ; DPI = jours après l’inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Images de croix sur PDA : (A) 100 % PDA, (B) 50 % PDA et (C) 25 % PDA. Les régions d’intérêt ont été agrandies (rectangles rouges). Toutes les images ont été acquises à 4 DPI. Une vue supplémentaire de (D) 50 % PDA met en évidence la présence de cellules à reproduction sexuée à différents stades : jeunes zygophores aériens : astérisques ; Zygophores aériens plus anciens : flèches rouges. (E) 25 % des PDA présentent des cellules sexuellement reproductrices à différents stades, bien que cette vue représentative montre un encombrement moindre de ces structures par rapport à 50 % des PDA. Barres d’échelle = 1 mm (A-C), 0,5 mm (D,E). Abréviations : PDA = gélose au dextrose de pomme de terre ; DPI = jours après l’inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Images de croix sur RMR. (A) 100 % RMR, (B) 50 % RMR et (C) 25 % RMR avec amplification des régions d’intérêt. Des structures sexuelles distinctes sont facilement observées chez 50 % (B) et 25 % (C) des RMR, et l’encombrement est minime. Aucune structure sexuelle n’est observée sur 100 % CMA à ce stade. Toutes les images ont été acquises à 4 DPI. Des images de boîte de Pétri et des images de portée de dissection ont été obtenues au-dessus de la boîte de Pétri. Les lignes sombres à l’arrière-plan des images de la lunette de dissection sont dessinées avec un marqueur noir qui a été utilisé pour suivre l’expansion du mycélium. Barres d’échelle = 1 mm. Abréviations : CMA = gélose à la semoule de maïs ; DPI = jours après l’inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Superficie du mycélium pour chaque souche sur 4 jours. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Évaluation par paire du contact et de l’accouplement pour chaque souche sur différents milieux. 0 = Non, 1 = Oui. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Un protocole simple pour induire la reproduction sexuée chez P. blakesleeanus en laboratoire est présenté ici. L’une des considérations les plus critiques pour ce protocole est la limitation des nutriments. On suppose que les champignons ont coopté la reproduction sexuée en réponse à des conditions environnementales difficiles telles que la limitation des nutriments 6,28,29,30,31,32. La variation du niveau de nutriments peut éclairer la conception expérimentale. Par exemple, si un chercheur souhaite comparer les gènes exprimés dans les zygophores aériens par rapport à la gamétaxie, une limitation nutritionnelle plus extrême (telle que 25 % d’AMC) serait recommandée car la densité des structures sexuelles sera inférieure à celle des formulations plus élevées d’AMC ou de PDA. Une densité plus faible de structures sexuelles, comme ce qui a été observé avec 50 % ou 25 % d’AMC, signifie que l’isolement d’un type de cellule différencié spécifique serait non seulement plus facile (car les cellules seraient facilement identifiées et excisées), mais garantirait également que seul le type de cellule d’intérêt est échantillonné.

Les stagiaires ou les étudiants bénéficieraient également de ce protocole, car il permet à ce groupe de suivre la différenciation cellulaire et de distinguer de manière fiable les différents types de cellules qui se développent au cours du cycle sexuel de P. blakesleeanis. L’utilisation de la CMA et de la PCA reflète des travaux antérieurs sur l’induction de l’accouplement des mucoromycètes 18,22,23, et des formes en poudre sont disponibles à l’achat, ce qui en fait l’un des milieux les plus accessibles dans un cadre de formation ou d’éducation par rapport à d’autres milieux synthétiques.

Étant donné que l’objectif ultime de ce protocole est de démontrer le développement et la différenciation, et qu’il a été souligné que la concentration en nutriments a une incidence sur la facilité d’observation de types cellulaires distincts, une étape essentielle de ce protocole consiste à s’assurer que la composition appropriée des milieux est appropriée (section 1 du protocole). Si de la poudre de gélose supplémentaire n’est pas ajoutée à la PDA ou à la CMA diluée, le milieu peut ne pas se solidifier correctement et les interactions d’accouplement ultérieures peuvent ne pas être facilement observées. De plus, une attention particulière doit être accordée au placement des types d’accouplement complémentaires et similaires (section 2 du protocole). Comme P. blakesleeanus est hétérothallique, il a besoin d’un partenaire d’accouplement complémentaire, et si ce partenaire est inaccessible ou si un type d’accouplement similaire est utilisé à la place, alors l’accouplement ne se produira pas 10,33,34.

Une limite de ce protocole est le développement asynchrone des structures sexuelles. P. blakesleeanus, comme d’autres champignons cultivés sur des milieux solides, s’étend radialement dans toutes les directions. Cela signifie que des parties du mycélium seront à des stades plus avancés du cycle sexuel que les autres. Des protocoles existent pour synchroniser le développement sexuel chez Ascomycètes³⁵, mais ceux-ci n’ont pas été adaptés avec succès aux Mucoromycètes. Cela signifie que les travaux d’étude de l’expression des gènes au cours du cycle sexuel seront sujets à du bruit si trop de cellules sont à des stades de développement différents. Compte tenu des observations de cette étude, il semblerait que si la limitation de la disponibilité des nutriments entraîne une diminution globale des cellules à reproduction sexuée, les cellules observées semblent être à des stades de développement similaires. Par conséquent, la limitation des nutriments peut aider à limiter la densité des structures sexuelles différenciées, permettant à un chercheur d’accéder à des tissus principalement synchrones au détriment de rendements plus faibles.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Nous tenons à remercier le comité exécutif des sciences naturelles du Colorado College, le département de biologie et d’écologie des organismes et le Fonds de la famille Hevey pour la recherche étudiante pour le financement de ce travail. Nous exprimons également notre gratitude à Alice Keller et Tia Hutchens pour leur soutien technique.