Imaging volumetrico e analisi delle ciglia primarie nel tessuto muscoloscheletrico utilizzando il modello murino ARL13B-CENTRIN-2

Questo metodo descrive lo sfruttamento del segnale endogeno in un modello murino transgenico ARL13B-CENTRIN-2 per visualizzare le ciglia primarie in situ, in tre dimensioni su ampie aree di tessuto mineralizzato, dalla raccolta dei tessuti all'analisi dell'organizzazione delle ciglia. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi di tessuti.

Il cilio primario è un organello solitario non mobile assemblato dalla maggior parte dei tipi di cellule. È essenziale per lo sviluppo e l'omeostasi dello scheletro e per coordinare le risposte cellulari a segnali biochimici e meccanici provenienti dall'ambiente circostante. A causa delle sue dimensioni su scala micrometrica, il cilio primario è difficile da visualizzare in situ per caratterizzare i tessuti, in modo ad alta produttività e senza distorsioni ottiche. Una comprensione della sua organizzazione nel suo ambiente 3D in vivo sarà la chiave per comprendere i ruoli ciliari in fisiologia e malattia. La linea di topi ARL13B-CENTRIN-2 presenta un tag mCherry sulla proteina dell'assonema ciliare ARL13B e un tag per la proteina fluorescente verde (GFP) sulla proteina centriola CENTRIN-2, localizzata alla base del cilio. Questa linea di topi consente l'imaging del cilio primario senza la necessità di colorazione, riducendo il numero di passaggi nella raccolta delle immagini ed eludendo i problemi con il rapporto segnale/rumore. Questa pubblicazione descrive un protocollo passo-passo per visualizzare le ciglia primarie nei tessuti muscoloscheletrici preservando il segnale fluorescente. Descrive inoltre una pipeline di analisi delle immagini universalmente applicabile, che consente una quantificazione imparziale delle caratteristiche delle ciglia, come la lunghezza e l'orientamento 3D.

Il cilio primario è un organello essenziale nello sviluppo e nell'omeostasi di molti tessuti e organi, compreso lo scheletro. Durante la crescita postnatale, regola la mineralizzazione della cartilagine durante l'ossificazione endocondrale¹. Nell'uomo, le mutazioni genetiche che colpiscono le proteine correlate alle ciglia causano una serie di malattie e disturbi dello sviluppo, noti come ciliopatie. Una comprensione dell'organizzazione delle ciglia primarie all'interno dei tessuti è importante per capire come regolano il comportamento cellulare a livello d'organo. È stato dimostrato che l'incidenza, la lunghezza e l'orientamento delle ciglia primarie variano all'interno e tra i tessuti, suggerendo un ruolo dell'organizzazione dei tessuti nella loro funzione ^2,3,4. La cartilagine di accrescimento, lo strato di cartilagine all'estremità delle ossa lunghe dove si verifica la maggior parte della crescita ossea postnatale dai primi anni di vita e durante l'adolescenza, è un tessuto altamente organizzato con cellule condrocitarie disposte in colonne. Nella cartilagine di crescita, i condrociti attraversano fasi di differenziazione, da quelle a riposo a quelle proliferanti a quelle ipertrofiche.

Questa organizzazione cellulare è persa in alcune ciliopatie, il che suggerisce che le ciglia primarie possono svolgere un ruolo nel coordinare questa organizzazione cellulare e/o, per lo meno, essere associate alla polarizzazione cellulare. Inoltre, l'orientamento delle ciglia primarie sembra svolgere un ruolo nella loro funzione meccanosensoriale, con differenze osservate tra regioni portanti e non portanti nella cartilagine articolare⁴. I nostri studi recenti hanno implicato ruoli differenziali all'interno di diverse regioni della cartilagine articolare e della cartilagine di crescita ^5,6. Studi precedenti che hanno visualizzato le ciglia primarie nella cartilagine di crescita sono stati limitati al 2D, che perde informazioni relative all'organizzazione delle ciglia nei tessuti o sono limitati a un piccolo numero di cellule in 3D, il che riduce la scala e la potenza dell'analisi ^7,8.

Tra le sfide per l'imaging del cilio primario ci sono le sue dimensioni su scala micrometrica e la non specificità degli anticorpi immunoistochimici. L'utilizzo di un segnale fluorescente nativo garantisce una forte localizzazione e specificità. I segnali fluorescenti nativi possono, tuttavia, essere difficili da visualizzare nei tessuti mineralizzati, poiché il lungo processo di decalcificazione per incorporare i tessuti nella paraffina può causare la perdita del segnale. La criosezione dei campioni congelati allo stato nativo previene questa perdita accelerando il processo di inclusione e sezionamento.

Per l'imaging delle ciglia primarie in situ, Bangs et al. ha generato una doppia linea di topo transgenico, che esprime la proteina ADP-ribosylation factor-like (ARL13B) fusa a mCherry e CENTRIN-2 fusa a GFP⁹. ARL13B è una piccola GTPasi localizzata alla membrana del cilio primario, e CENTRIN-2 è una proteina centriolare localizzata ai due centrosomi alla base del cilio^10,11. Questa linea di topi, quindi, consente di visualizzare le ciglia primarie marcate in fluorescenza senza la necessità di immunoistochimica.

Il protocollo qui descritto utilizza questa linea transgenica per visualizzare le ciglia primarie in 3D in placche di crescita postnatali murine con microscopia confocale, richiedendo solo un'ulteriore colorazione 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Centinaia di ciglia primarie in centinaia di cellule possono essere visualizzate e analizzate collettivamente in un contesto tissutale. Una pipeline di analisi delle immagini misura successivamente l'incidenza, la lunghezza e l'orientamento delle ciglia primarie nelle diverse regioni della cartilagine di crescita. La pipeline è anche in grado di quantificare queste caratteristiche per i centrioli. Una descrizione dei passaggi del protocollo è presentata nella Figura 1.

L'allevamento e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i quadri etici dell'Università di Oxford e con una licenza di progetto concessa dal Ministero degli Interni del Regno Unito. Questo protocollo è stato eseguito su topi di età compresa tra 2 e 10 settimane, ma funzionerebbe nella cartilagine dei topi oltre questa età.

1. Raccolta dei tessuti

1. Sopprimere i topi riempiendo una scatola contenente i topi con anidride carbonica fino all'80% in volume e mantenendo la sua concentrazione per 5 minuti. Eseguire la lussazione cervicale.
2. Seziona il tessuto di interesse.
   NOTA: Di seguito è riportato un protocollo per sezionare le ginocchia delle zampe posteriori, comprese le placche di crescita tibiale e femorale e la cartilagine articolare.
   1. Incidere la pelle ai piedi e tagliare fino alla parte superiore della coscia. Rimuovere la pelle dalla linea di incisione con una pinza.
   2. Taglia i muscoli e il tessuto adiposo dalle gambe.
   3. Per staccare la gamba dal corpo, tagliare in modo netto il femore nella parte superiore dell'anca. Taglia il piede nella parte inferiore della tibia.
   4. Rimuovere il tessuto muscolare e adiposo in eccesso rimasto sulla gamba.

2. Fissazione e inclusione dei tessuti

NOTA: Durante tutto il protocollo, fare attenzione a mantenere il tessuto al buio per evitare la perdita del segnale fluorescente.

1. Fissare il tessuto in formalina al 10% a temperatura ambiente per 4 ore.
2. Trasferire i tessuti in formalina al 2,5% a 4 °C per una notte.
3. Trasferire i tessuti al 30% di saccarosio in acqua distillata (dH₂O) e ruotare delicatamente a temperatura ambiente per una notte o per 3 giorni a 4 °C. Riempire le provette fino in cima per garantire la completa immersione del tessuto durante la rotazione. Dopo questa incubazione, il tessuto affonderà sul fondo della provetta.
4. Metti una piccola quantità di ghiaccio secco in una scatola separata e posiziona il criomold sopra. Traccia una linea di super terreno crioincorporante (SCEM) e posiziona l'arto lungo di essa, con la rotula rivolta verso il basso e aprendo la tibia e il femore in modo che la gamba sia il più piatta possibile. Tenere in posizione con il forcipe fino a quando lo SCEM non ha iniziato a solidificarsi e l'arto non si muove più quando non viene tenuto premuto.
5. Coprite completamente con SCEM, riempiendo lo stampo fino in cima. Posizionare il campione nella scatola del ghiaccio secco, mantenendolo piatto per evitare il movimento del tessuto, fino a quando lo SCEM non si solidifica completamente.
6. Trasferire a -20 °C.

3. Sezionamento

1. Rimuovere il blocco dallo stampo e tagliarlo a una dimensione che si adatti al mandrino di un criostato. Fissare il blocco al mandrino applicando SCEM sul mandrino e posizionando il blocco sopra.
2. Lasciare solidificare per almeno 5 minuti a -20 °C nel criostato.
3. Fissare il mandrino al portacampioni e una lama al portalama.
4. Tagliare il blocco fino a raggiungere la cartilagine di accrescimento tibiale. Idealmente, seziona con la tibia rivolta verso l'alto.
5. Tagliare il nastro criografico a una dimensione che si adatti al campione con spazio sufficiente intorno ad esso. Montare il criofilm sulla superficie di taglio, garantendo una perfetta adesione del criofilm con uno strumento adatto. Tagliare sezioni di spessore 40-60 μm per ottenere sezioni spesse due celle. Raccogliere il nastro con una pinza e posizionarlo su un vetrino, con il lato del campione rivolto verso l'alto, e la placca di crescita tibiale in linea con il vetrino corto del vetrino.
6. Conservare i vetrini dei campioni a -20 °C.

4. Preparazione e montaggio dei vetrini

1. Scongelare il vetrino orizzontalmente a temperatura ambiente.
2. Lavare il vetrino con una goccia di PBS per 3 x 5 minuti per rimuovere lo SCEM.
3. Colorare con 10 μM DAPI per 1 min.
4. Lavare il vetrino con una goccia di PBS per 2 x 5 min.
5. Montare, coprire con un vetrino coprioggetti e lasciare a temperatura ambiente per una notte. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con sigillante per vetrini.
6. Immagine il giorno seguente.

5. Imaging mediante microscopia confocale

NOTA: La risoluzione dell'obiettivo 40x/1.4 sul microscopio confocale utilizzato è di 240 nm.

1. Impostare il microscopio.
   1. Accendi il microscopio e apri il software. Fare clic sul pulsante Sistema .
   2. Nella scheda Acquisizione , fare clic su Smart Setup per configurare i canali. Seleziona e aggiungi i canali GFP, mCherry e DAPI. Selezionare l'opzione Airyscan e la funzione SR8Y nel triangolo Airyscan (tra risoluzione e velocità multiplex 8Y). Clicca su Miglior segnale | OK (Figura supplementare S1A).
   3. Nella scheda Localizza , in Controllo microscopio, selezionare l'obiettivo 40x/1.4 con immersione in olio.
2. Individua la regione di interesse.
   1. Posizionare il vetrino nel supporto del carrello e sollevare l'obiettivo fino a quando l'olio non tocca il vetrino.
   2. Posizionare la piastra di crescita o un'altra regione di interesse sotto il percorso della luce.
   3. Nella scheda Localizza , fare clic su Fluorescenza, selezionare DAPI e, utilizzando l'oculare, spostare il supporto del vetrino con il joystick per posizionare la piastra di crescita o la regione di interesse sotto il campo visivo.
   4. Nella scheda Acquisizione , iniziare selezionando solo il canale DAPI .
   5. Fare clic su Continuo per visualizzare l'immagine di quel canale sullo schermo e assicurarsi che la placca di crescita sia in vista.
   6. Apri il visualizzatore di riquadri facendo clic su Mostra visualizzatore nella scheda Riquadri . Aggiungi il numero di tessere richieste (di solito 1 tessera in direzione x e 3-5 in direzione y) e fai clic su Anteprima e Avvia (Figura supplementare S1B).
   7. Verificare che le tessere coprano le tre zone della placca di crescita: riposo, proliferazione e ipertrofia. Regolare la posizione e il numero delle tessere in base alle esigenze.
3. Impostare i parametri di imaging.
   1. Fare clic su Continuo nella scheda Acquisizione . Nella scheda Canali , regolare il guadagno (master) e la potenza del laser per visualizzare chiaramente i nuclei sullo schermo. Consentire l'allineamento del rilevatore Airyscan. Aprire la finestra di regolazione del rivelatore Airyscan facendo clic sul simbolo della rosetta piastrellata nella parte inferiore della finestra; una volta allineato, tutte le tessere diventeranno verdi (Figura supplementare S1C).
   2. Selezionare i canali GFP e mCherry singolarmente e ripetere questi passaggi, impostando il guadagno (Master), la potenza del laser e allineando il rivelatore Airyscan.
   3. Seleziona tutti e tre i canali e fai clic su Continuo. Consentire l'allineamento del rilevatore Airyscan.
   4. Nella scheda Modalità di acquisizione, definire i valori di Dimensione immagine, Pixel, Dimensione, Dimensione fotogramma, Velocità e Media. Vedere la Figura supplementare S1D,E per i valori delle impostazioni della modalità di acquisizione, del guadagno (master) e della potenza laser per i canali utilizzati.
4. Acquisisci immagini.
   1. Nella scheda Acquisizione , fare clic sulla casella di controllo Z-Stack .
   2. Con solo il canale DAPI selezionato, fare clic su Continuo per visualizzare l'immagine sullo schermo. Spostare l'obiettivo verso il basso sul piano più vicino da riprendere. Nella scheda Z-Stack , fare clic su Imposta primo piano, concentrarsi sull'ultimo piano da visualizzare e fare clic su Imposta ultimo piano. Immagine 30-40 μm z-stacks.
   3. Impostare l'intervallo su 0,15 μm.
   4. Spostatevi al centro dello z-stack. Nella scheda Tiles , in Tile Regions, fai clic su Verifica e fai clic su Imposta Z e passa a successivo.
   5. Nella scheda Strategia di messa a fuoco , verificare che la strategia di messa a fuoco sia impostata su Usa valori Z/Superficie di messa a fuoco definita in Impostazione piastrelle.
   6. Clicca su Avvia esperimento per avviare l'acquisizione dell'immagine.
5. Elaborazione di immagini
   1. Nella scheda Elaborazione, selezionare la modalità Singola o Batch . Selezionare Elaborazione Airyscan. Spuntare Elaborazione 3D e selezionare Filtro automatico standard. Selezionare l'immagine raw acquisita e avviare l'elaborazione (Figura supplementare S2A).
   2. Una volta completata l'elaborazione Airyscan, selezionare Stitching nei metodi di elaborazione. Selezionare Nuovo output, Unisci tessere, Correggi ombreggiatura e Tutto per riferimento, con il riferimento DAPI. Selezionare l'immagine elaborata da Airyscan e avviare l'elaborazione (Figura supplementare S2B).
   3. Salva le immagini raw e le immagini elaborate due volte. Quest'ultimo viene salvato automaticamente in modalità Batch .

6. Analisi delle immagini

NOTA: La pipeline di analisi utilizzata qui è stata personalizzata per gli scopi di questo studio. I dettagli delle operazioni della pipeline sono illustrati nella Figura S3 supplementare.

1. Importa il file immagine czi nel software. Apri il pannello di analisi; nell'elenco a discesa selezionare Nuova pipeline...
2. Per creare una pipeline di rilevamento delle celle, importare il segmentatore Python Cellpose nella pipeline¹². Impostare Model_Name su cito2, Input_channel su 2, Second_channel su 3, Diameter_in_μm su 10, Flow_threshold su 0,4 e Cellprob_threshold su 0. Aggiungere un operatore Importa oggetti documento (rinominato in Importa etichette manuali) prima e un operatore Filtro funzionalità oggetto (rinominato in Filtro dimensioni) dopo la pipeline facendo clic su + Aggiungi operazione. Vedere la Figura supplementare S3A per i valori delle impostazioni della pipeline.
   1. Spostare il visualizzatore sul primo piano di interesse
   2. Fare clic sull'icona dello strumento Disegna oggetti
   3. Fare clic sull'icona della modalità Poligono
   4. Disegna l'area da analizzare
   5. Sposta il visualizzatore sull'ultimo piano di interesse
   6. Disegna area da analizzare
   7. Fare clic sul segno di spunta verde Applica modifiche
   8. Fare clic sull'icona Mostra tabella oggetti
   9. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto creato e selezionare Rinomina oggetto per rinominare l'oggetto con un nome appropriato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto creato e fare clic su Aggiungi tag. Aggiungi un tag chiamato Regione di analisi.
3. Eseguire questa pipeline facendo clic sulla freccia blu in avanti nella parte superiore del pannello Analisi .
4. Per creare una pipeline di rilevamento delle ciglia primarie e del centriolo, aprire il pannello di analisi, nell'elenco a discesa selezionare Nuova pipeline.... Aggiungere gli operatori seguenti alla pipeline: Importa oggetti documento (rinominato in Importa etichette manuali), due operatori Intensity Threshold Segmenter (rinominati in Cilia Threshold e Centriole Threshold), Splitting (rinominato in Centriole Splitting), Object Feature Filter (rinominato in Centriole Splitting size filter) e Compartment (rinominato in Compartment - Cell). Vedere la Figura supplementare S3B per i valori delle impostazioni della pipeline.
5. Eseguire questa pipeline facendo clic sulla freccia blu in avanti nella parte superiore del pannello Analisi.
6. Aprire la finestra Oggetti. Fare clic su Im/Esporta..., selezionare Esportazione Excel.... Selezionare le seguenti funzioni da salvare: # Figli, Nome, Nomi genitori, Limiti orientati 3D Lato corto, Lato centrale, Lato lungo, Angolo XY, Angolo XZ, Angolo YZ, Riquadro di delimitazione X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, DimensioneX, DimensioneY, Dimensione Z, Centro della geometria X, Y, Z, Piano primo, Ultimo, Conteggio, Sfericità (mesh), Volume (mesh), Area della superficie (mesh).

La cartilagine di crescita di un topo di 6 settimane è stata analizzata utilizzando il protocollo descritto e l'organizzazione delle ciglia primarie mappata nel tessuto. Un'immagine di tutte e tre le regioni della placca di crescita - a riposo, proliferativa e ipertrofica - è stata catturata ed eseguita attraverso la pipeline di analisi (Figura 2A). Le singole cellule possono essere identificate con la colorazione DAPI, con il loro assonema ciliare in rosso e i loro centrioli in verde. La risoluzione con questo metodo è sufficientemente alta da discriminare i singoli centrioli (Figura 2B). A questa risoluzione, le ciglia possono essere visualizzate nel loro ambiente 3D, puntando in direzioni diverse (Video 1).

È inoltre possibile acquisire immagini a bassa risoluzione, con obiettivi di ingrandimento più elevati, per visualizzare le ciglia primarie in una regione più ampia di tessuto; tuttavia, questi non sono adatti per l'analisi dell'orientamento delle ciglia in 3D. Ad esempio, le ciglia primarie nella cartilagine articolare sono state visualizzate con l'obiettivo 20x, dimostrando che il metodo funziona anche su altri tessuti (Figura 2C). A questa risoluzione, gli assonomi ciliari in rosso possono essere identificati, ma i centrioli sono più difficili da discriminare. L'osso subcondrale tende a presentare molto segnale di fondo GFP, rendendo difficile l'identificazione del centriolo in questo tessuto.

La pipeline è in grado di rilevare singole cellule, ciglia primarie e centrioli e funziona per placche di crescita giovani e vecchie altamente organizzate in cui le colonne sono meno ben definite, come nei topi di 10 settimane (Figura 3). Le cellule e le ciglia vengono rilevate in 3D, come possono essere visualizzate attraverso lo z-stack.

Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale. Diagramma di flusso delle diverse fasi del protocollo, dalla raccolta dei tessuti all'analisi delle immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ciglia primarie nei tessuti murini del topo ARL13B-CENTRIN-2. (A) Una placca di crescita di 6 settimane, con DAPI in bianco, CENTRIN-2 in verde e ARL13B in rosso, ripresa con l'obiettivo 40x. (B) Ingrandisci un singolo cilio primario e i suoi due centrioli. (C) Cartilagine articolare e osso subcondrale di un topo di 4 settimane, ripreso con l'obiettivo 20x. (D) Rene di un topo di 6 settimane ripreso utilizzando la stessa pipeline del tessuto muscoloscheletrico. (E) Ingrandimento della casella bianca in D che mostra le singole ciglia primarie e i loro centrioli nel rene. Barre di scala = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Pipeline di rilevamento di cellule e ciglia. Esempio di applicazione della pipeline di analisi delle immagini su una piastra di crescita di 10 settimane. (A) Immagine aperta nel software. (B) Risultato della pipeline di rilevamento delle celle. (C) Risultato della pipeline di rilevamento delle ciglia e del centriolo. Le ciglia sono in rosa e i centrioli in verde. La vista laterale esemplifica che la risoluzione è sufficientemente alta da discriminare le ciglia orientate in direzioni diverse in 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Ricostruzione tridimensionale di una cartilagine di crescita di 6 settimane dal topo ARL13B-CENTRIN-2. La ricostruzione tridimensionale è stata condotta nel software Imaris e registrata come video di animazione. Clicca qui per scaricare questo video.

Figura S1 supplementare: Impostazioni di acquisizione delle immagini sul sistema del microscopio. (A) Finestra Smart Setup per aggiungere i canali e scegliere la modalità Airyscan . (B) Visualizzatore di tessere per selezionare e visualizzare in anteprima le tessere nell'immagine. (C) Finestra di regolazione del rivelatore Airyscan , in cui l'allineamento dei rilevatori Airyscan viene confermato una volta che tutte le tessere diventano verdi. (D) Impostazioni laser per i tre canali. (E) Impostazioni della modalità di acquisizione e Z-Stack. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Impostazioni di elaborazione delle immagini sul sistema del microscopio. (A) Impostazioni di elaborazione Airyscan. (B) Impostazioni di cucitura. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Pipeline di analisi delle immagini personalizzate. (A) Pipeline di rilevamento delle celle utilizzando i canali GFP e DAPI. (B) Pipeline di rilevamento delle ciglia primarie e del centriolo utilizzando rispettivamente i canali mCherry e GFP. Clicca qui per scaricare questo file.

In questo protocollo, è fondamentale procedere con le fasi di processazione e inclusione dei tessuti subito dopo la raccolta. I blocchi e i vetrini di tessuto, invece, possono essere conservati per almeno 3 mesi a -20 °C. Diversi passaggi di questo protocollo possono essere modificati per adattarsi a diverse applicazioni, in particolare lo spessore della sezione, l'ingrandimento e i parametri z-stack. Ciò influirà sulla profondità dell'imaging e sulla risoluzione ottenuta. Le modifiche all'apertura numerica e alla modalità di risoluzione potrebbero essere utilizzate per ottenere una risoluzione ancora più elevata e la dimensione dell'intervallo z-stacks diminuita. Tuttavia, ciò aumenterebbe il tempo di imaging o ridurrebbe le dimensioni del campo visivo che può essere visualizzato. I parametri di imaging descritti sono i requisiti minimi identificati per l'analisi 3D dell'orientamento delle ciglia primarie.

La scelta del mezzo di montaggio è importante per ottenere un'alta risoluzione. L'indice di rifrazione del mezzo di montaggio deve essere simile a quello del mezzo di immersione per ridurre al minimo la degradazione dell'immagine nello z-stack. L'indice di rifrazione del montante e l'olio da immersione qui utilizzati hanno indici di rifrazione rispettivamente di 1,52 e 1,518. La funzione Airyscan del microscopio confocale qui utilizzato offre immagini a super risoluzione. Potrebbero essere utilizzati altri microscopi a super risoluzione; Tuttavia, abbiamo scoperto che la sola modalità confocale non era sufficiente per ottenere la risoluzione richiesta per le dimensioni delle aree riprese. La risoluzione massima della modalità Airyscan Multiplex SR-8Y è di 120/160 nm in x/y e 450 nm in z, e un numero massimo di fotogrammi/s di 47,5. Abbiamo riscontrato che la modalità Airyscan Multiplex SR-4Y, che presenta una risoluzione massima di 140 nm in x/y e 450 nm in z ma immagini a metà velocità con un numero massimo di fotogrammi/s di 25, non presenta una differenza significativa per l'imaging delle ciglia primarie in 3D. Allo stesso modo, la modalità Airyscan super-resolution (SR), che offre la massima risoluzione su questo microscopio - 120 nm in x/y e 350 nm in z - richiederebbe più tempo per l'immagine, poiché il suo numero massimo di fotogrammi/s è 4,7¹³.

Il segnale GFP di fondo può essere osservato in altri tessuti come il muscolo. Per ridurre al minimo questo problema, la portata dei laser può essere ristretta per ridurre la sovrapposizione con altre lunghezze d'onda. Questa linea è stata precedentemente utilizzata per visualizzare le ciglia primarie nell'embrione, le colture cellulari primarie, le fibre muscolari e l'epitelio pigmentato retinico ^9,14,15. Abbiamo analizzato con successo le ciglia primarie nei reni, nella cartilagine e nel tessuto osseo. Probabilmente sarà necessaria una certa ottimizzazione delle impostazioni di imaging per tessuti diversi; Tuttavia, questo protocollo di criosezione dovrebbe garantire la conservazione del segnale.

Le sezioni spesse a due cellule (40-60 μm) sono sufficienti per ottenere informazioni di orientamento 3D nella piastra di crescita, in quanto ciò consente l'imaging di cellule intere e delle loro ciglia primarie. Per altri tessuti in cui le cellule sono più grandi dei condrociti, come gli adipociti, possono essere necessarie sezioni più spesse per raccogliere dati sulla popolazione cellulare. A seconda della risoluzione della profondità del microscopio utilizzato, potrebbe non essere possibile acquisire immagini in profondità in sezioni più spesse. Le tecniche di chiarificazione tissutale porterebbero probabilmente alla perdita del segnale endogeno di mCherry e GFP a causa del tempo necessario. Questo è stato esplorato, poiché i metodi di pulizia sono stati utilizzati per altre immagini nell'arto, ma non è stato ritenuto necessario in questo contesto. La nostra esperienza con il CD31-RFP endogeno ha suggerito che le tecniche di clearing richiederebbero un'attenta ottimizzazione, su misura per il campionamento.

Questa linea ARL13B-CENTRIN-2 può essere incrociata con altre linee di topi per studiare ulteriormente l'organizzazione delle ciglia primarie nei tessuti. Ad esempio, l'abbiamo incrociato con un aggrecan-Cre IFT88^fl/fl per eliminare condizionatamente IFT88, una proteina primaria delle ciglia la cui delezione impedisce la ciliazione, nelle cellule che esprimono aggrecani (condrociti postnatali)^5,6. Questi segnali fluorescenti ARL13B e CENTRIN-2 possono quindi essere utilizzati per misurare l'efficienza delle perturbazioni genetiche a livello della struttura ciliare nei tessuti e qualsiasi cambiamento associato nell'organizzazione ciliare. I lavori in corso stanno attualmente facendo esattamente questo. Il nostro primo obiettivo sarà quello di quantificare, con questa metodologia più robusta, l'effetto della delezione di IFT88 sulla prevalenza delle ciglia. In precedenza, abbiamo misurato questo dato utilizzando l'immunofluorescenza e abbiamo stimato che si tratta di una riduzione del 20%⁶. Questo metodo può anche essere combinato con l'immunoistochimica per visualizzare le ciglia primarie in combinazione con altre proteine, ad esempio una proteina della membrana cellulare.

Il transgene su ARL13B può avere un effetto sull'espressione di ARL13B e sulla lunghezza delle ciglia primarie. Studi precedenti hanno misurato diverse lunghezze delle ciglia primarie con la linea ARL13B-CENTRIN-2 rispetto ad ARL13B non transgene in alcune regioni del cervello del topo, senza differenze in altre¹⁶. Un altro studio ha osservato differenze nella lunghezza delle ciglia primarie in una linea di topo ARL13B marcata con GFP rispetto ad ARL13B non marcata nei fibroblasti embrionali di topo¹⁰. Il lavoro in corso sta verificando eventuali cambiamenti nella lunghezza delle ciglia primarie nella cartilagine di crescita e in altri tessuti confrontando i risultati utilizzando la linea di topi ARL13B-CENTRIN-2 con colorazione anticorpale contro ARL13B non transgenico.

La pipeline di analisi delle immagini in questo protocollo è stata progettata per misurare successivamente la percentuale di ciliazione, la lunghezza e l'orientamento 3D delle ciglia primarie, nonché il numero di centrioli e la posizione nella placca di crescita. Il software di analisi delle immagini consente di creare tubazioni personalizzate modificando i passaggi coinvolti. L'output di questa pipeline è un foglio di calcolo con le misure delle caratteristiche scelte per le cellule, le ciglia e i centrioli rilevati. La postanalisi può quindi essere eseguita in R o in altri software in base agli scopi dello studio. Come per le impostazioni di imaging, i passaggi della pipeline e le impostazioni specifiche possono essere modificati per funzionare su immagini diverse e in base agli obiettivi dello studio. Nel complesso, questo metodo consente un'analisi ad alto rendimento delle ciglia primarie rispetto a quanto pubblicato in precedenza nella piastra di crescita. Il numero di cellule e ciglia associate che possono essere studiate consente misurazioni più grandi e più affidabili.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamo tutti i membri dello staff della BSU presso il Kennedy Institute of Rheumatology, in particolare Albertino Bonifacio, per l'allevamento degli animali. Ringraziamo il Centro di eccellenza per l'imaging biomedico di Oxford-ZEISS per l'assistenza nell'uso del microscopio, in particolare il Dr. Jacky (Ka Long) Ko per l'aiuto nello sviluppo della pipeline di analisi delle immagini. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Kennedy Trust of Rheumatology Research (Johnson) e dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC, BB/X007049/1).