Volumetrische Bildgebung und Analyse von primären Zilien im Muskel-Skelett-Gewebe mit dem Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2

Diese Methode beschreibt die Nutzung des endogenen Signals in einem transgenen ARL13B-CENTRIN-2-Mausmodell, um primäre Zilien in situ dreidimensional über große Bereiche mineralisierten Gewebes abzubilden, von der Gewebeentnahme bis zur Analyse der Zilienorganisation. Dieses Protokoll kann auch auf andere Arten von Geweben angewendet werden.

Das primäre Zilium ist ein unbewegliches, solitäres Organell, das von den meisten Zelltypen zusammengesetzt wird. Es ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase des Skeletts und für die Koordination der Zellreaktionen auf biochemische und mechanische Signale aus ihrer Umgebung. Aufgrund seiner Größe im Mikrometerbereich ist es schwierig, das primäre Zilium in situ abzubilden, um es in Geweben zu charakterisieren, und zwar mit hohem Durchsatz und ohne optische Verzerrungen. Das Verständnis seiner Organisation in seiner 3D-Umgebung in vivo wird der Schlüssel zum Verständnis der Ziliarrollen in Physiologie und Krankheit sein. Die Mauslinie ARL13B-CENTRIN-2 zeigt einen mCherry-Tag auf dem ziliären Axonemprotein ARL13B und einen grün fluoreszierenden Protein-Tag (GFP) auf dem Zentriolprotein CENTRIN-2, lokalisiert an der Basis des Ziliums. Diese Mauslinie ermöglicht die Bildgebung des primären Ziliums ohne Färbung, wodurch die Anzahl der Schritte in der Bilderfassung reduziert und Probleme mit dem Signal-Rausch-Verhältnis umgangen werden. Diese Veröffentlichung beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Abbildung primärer Zilien in Muskel-Skelett-Geweben unter Beibehaltung des Fluoreszenzsignals. Es beschreibt auch eine universell einsetzbare Bildanalyse-Pipeline, die eine unverzerrte Quantifizierung von Zilienmerkmalen wie Länge und 3D-Orientierung ermöglicht.

Das primäre Zilium ist ein essentielles Organell bei der Entwicklung und Homöostase vieler Gewebe und Organe, einschließlich des Skeletts. Während des postnatalen Wachstums reguliert es die Knorpelmineralisierung während der endochondralen Ossifikation¹. Beim Menschen verursachen genetische Mutationen, die mit Zilien verwandte Proteine betreffen, eine Reihe von Krankheiten und Entwicklungsstörungen, die als Ziliopathien bekannt sind. Ein Verständnis der Organisation primärer Zilien im Gewebe ist wichtig, um zu verstehen, wie sie das zelluläre Verhalten auf Organebene regulieren. Es wurde gezeigt, dass Inzidenz, Länge und Orientierung der primären Zilien innerhalb und zwischen den Geweben variieren, was auf eine Rolle für die Gewebeorganisation und ihre Funktion hindeutet ^2,3,4. Die Wachstumsfuge, die Knorpelschicht am Ende der langen Knochen, in der das meiste postnatale Knochenwachstum vom frühen Leben bis zur Adoleszenz stattfindet, ist ein hochorganisiertes Gewebe mit Chondrozytenzellen, die in Säulen angeordnet sind. In der Wachstumsfuge durchlaufen Chondrozyten Stadien der Differenzierung, von ruhend über proliferierend bis hypertroph.

Diese zelluläre Organisation geht bei einigen Ziliopathien verloren, was darauf hindeutet, dass primäre Zilien eine Rolle bei der Koordination dieser zellulären Organisation spielen und/oder zumindest mit der zellulären Polarisation verbunden sein könnten. Darüber hinaus scheint die primäre Orientierung der Zilien eine Rolle bei ihrer mechanosensorischen Funktion zu spielen, wobei Unterschiede zwischen tragenden und nicht tragenden Bereichen im Gelenkknorpel beobachtet^{werden 4}. Unsere eigenen neueren Studien haben unterschiedliche Rollen innerhalb verschiedener Regionen des Gelenkknorpels und der Wachstumsfuge impliziert ^5,6. Frühere Studien, in denen primäre Zilien in der Wachstumsfuge abgebildet wurden, waren auf 2D beschränkt, wodurch Informationen über die Organisation der Zilien im Gewebe verloren gehen, oder sie sind auf eine kleine Anzahl von Zellen in 3D beschränkt, was den Umfang und die Aussagekraft der Analyse verringert ^7,8.

Zu den Herausforderungen bei der Bildgebung des primären Ziliums gehören seine Größe im Mikrometermaßstab und die Unspezifität der immunhistochemischen Antikörper. Die Verwendung eines nativen Fluoreszenzsignals gewährleistet eine starke Lokalisierung und Spezifität. Native Fluoreszenzsignale können jedoch in mineralisiertem Gewebe schwierig abzubilden sein, da der lange Entkalkungsprozess zur Einbettung von Geweben in Paraffin zu einem Signalverlust führen kann. Die Kryosektion von Proben, die im nativen Zustand eingefroren sind, verhindert diesen Verlust, indem sie den Einbettungs- und Schnittprozess beschleunigt.

Um primäre Zilien in situ abzubilden, wurde von Bangs et al. eine doppeltransgene Mauslinie erzeugt, die das ADP-Ribosylierungsfaktor-ähnliche Protein (ARL13B) exprimiert, das mit mCherry fusioniert ist, und CENTRIN-2, das mit GFP⁹ fusioniert ist. ARL13B ist eine kleine GTPase, die an der primären Ziliummembran lokalisiert ist, und CENTRIN-2 ist ein zentriolares Protein, das an den beiden Zentrosomen an der Basis des Ziliums^{lokalisiert ist 10,11}. Diese Mauslinie ermöglicht daher die Abbildung von fluoreszenzmarkierten primären Zilien, ohne dass eine Immunhistochemie erforderlich ist.

Das hier beschriebene Protokoll nutzt diese transgene Linie, um primäre Zilien in 3D in murinen postnatalen Wachstumsfugen mit konfokaler Mikroskopie abzubilden, wobei nur eine zusätzliche 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung erforderlich ist. Hunderte von primären Zilien in Hunderten von Zellen können gemeinsam in einem Gewebekontext abgebildet und analysiert werden. Eine Bildanalyse-Pipeline misst anschließend das Auftreten, die Länge und die Orientierung der primären Zilien in den verschiedenen Regionen der Wachstumsfuge. Die Pipeline ist auch in der Lage, diese Merkmale für Zentriolen zu quantifizieren. Eine Übersicht über die Schritte im Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

Die Tierhaltung und die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Rahmenwerken der Universität Oxford und im Rahmen einer Projektlizenz durchgeführt, die vom britischen Innenministerium erteilt wurde. Dieses Protokoll wurde an Mäusen im Alter zwischen 2 und 10 Wochen durchgeführt, würde aber auch im Knorpel von Mäusen über dieses Alter hinaus funktionieren.

1. Gewebeentnahme

1. Euthanasieren Sie Mäuse, indem Sie eine Schachtel mit den Mäusen mit Kohlendioxid bis zu 80 Vol.-% füllen und die Konzentration 5 Minuten lang aufrechterhalten. Führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch.
2. Sezieren Sie das Gewebe, das Sie interessiert.
   HINWEIS: Nachfolgend finden Sie ein Protokoll für die Präparierung der Knie der Hinterbeine, einschließlich der Wachstumsfugen des Schienbeins, des Femurs und des Gelenkknorpels.
   1. Die Haut am Fuß einschneiden und bis zur Oberseite des Oberschenkels schneiden. Entfernen Sie die Haut mit einer Pinzette von der Schnittlinie.
   2. Schneiden Sie das Muskel- und Fettgewebe von den Beinen ab.
   3. Um das Bein vom Körper zu lösen, schneiden Sie den Oberschenkelknochen oben an der Hüfte sauber durch. Schneide den Fuß an der Unterseite des Schienbeins ab.
   4. Entfernen Sie überschüssiges Muskel- und Fettgewebe, das am Bein verbleibt.

2. Gewebefixierung und -einbettung

HINWEIS: Achten Sie während des gesamten Protokolls darauf, das Gewebe im Dunkeln zu halten, um einen Verlust des Fluoreszenzsignals zu vermeiden.

1. Fixieren Sie das Gewebe in 10% Formalin bei Raumtemperatur für 4 h.
2. Übertragen Sie das Gewebe über Nacht auf 2,5 % Formalin bei 4 °C.
3. Übertragen Sie das Gewebe auf 30%ige Saccharose in destilliertem Wasser (dH₂O) und drehen Sie es vorsichtig bei Raumtemperatur über Nacht oder 3 Tage lang bei 4 °C. Füllen Sie die Röhrchen bis zum Rand, um ein vollständiges Eintauchen des Gewebes während der Rotation zu gewährleisten. Nach dieser Inkubation sinkt das Gewebe auf den Boden des Röhrchens.
4. Geben Sie eine kleine Menge Trockeneis in eine separate Box und positionieren Sie den Kryomold darauf. Zeichnen Sie eine Linie aus Super Cryoembedding Medium (SCEM) und platzieren Sie die Gliedmaße entlang, wobei die Kniescheibe nach unten zeigt und das Schienbein und der Oberschenkelknochen auseinander geöffnet werden, damit das Bein so flach wie möglich ist. Halten Sie die Zange so lange fest, bis sich das SCEM zu verfestigen beginnt und sich die Gliedmaße nicht mehr bewegt, wenn sie nicht festgehalten wird.
5. Vollständig mit SCEM bedecken und die Form bis zum Rand füllen. Legen Sie die Probe in die Trockeneisbox und halten Sie die Probe flach, um eine Bewegung des Gewebes zu vermeiden, bis sich das SCEM vollständig verfestigt hat.
6. Auf -20 °C umstellen.

3. Einteilung

1. Entfernen Sie den Block aus der Form und schneiden Sie ihn auf eine Größe zu, die auf das Bohrfutter eines Kryostaten passt. Befestigen Sie den Block am Futter, indem Sie SCEM auf das Futter auftragen und den Block darauf legen.
2. Mindestens 5 min bei -20 °C im Kryostaten erstarren lassen.
3. Befestigen Sie das Spannfutter am Probenhalter und eine Klinge am Klingenhalter.
4. Schneiden Sie den Block ab, bis die Tibia-Wachstumsfuge erreicht ist. Idealerweise mit dem Schienbein nach oben schneiden.
5. Schneiden Sie das Kryofilmband auf eine Größe zu, die zur Probe passt und genügend Platz um sie herum bietet. Montieren Sie den Kryofilm auf der Schnittfläche und sorgen Sie mit einem passenden Werkzeug für eine feste Haftung des Kryofilms. Schneiden Sie 40-60 μm dicke Abschnitte, um zweizellige Dicken zu erhalten. Entnehmen Sie das Klebeband mit einer Pinzette und legen Sie es mit der Probenseite nach oben und der Tibia-Wachstumsfuge in einer Linie mit dem kurzen Objektträger des Objektträgers.
6. Lagern Sie die Objektträger bei -20 °C.

4. Vorbereitung und Montage von Objektträgern

1. Tauen Sie den Objektträger waagerecht bei Raumtemperatur auf.
2. Waschen Sie den Objektträger 3 x 5 Minuten lang mit einem Tropfen PBS, um das SCEM zu entfernen.
3. Mit 10 μM DAPI 1 min färben.
4. Waschen Sie den Objektträger mit einem Tropfen PBS für 2 x 5 min.
5. Aufstecken, mit einem Deckglas abdecken und über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Deckglas-Dichtmittel.
6. Bild am nächsten Tag.

5. Bildgebung durch konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Die Auflösung des 40x/1,4-Objektivs des verwendeten Konfokalmikroskops beträgt 240 nm.

1. Richten Sie das Mikroskop ein.
   1. Schalten Sie das Mikroskop ein und öffnen Sie die Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche System .
   2. Klicken Sie auf der Registerkarte Akquisition auf Smart Setup , um die Kanäle einzurichten. Wählen Sie die Kanäle GFP, mCherry und DAPI aus, und fügen Sie sie hinzu. Wählen Sie die Option Airyscan und die Funktion SR8Y im Airyscan-Dreieck (zwischen Auflösung und Speed-Multiplex 8Y). Klicken Sie auf Bestes Signal | OK (ergänzende Abbildung S1A).
   3. Wählen Sie auf der Registerkarte "Lokalisieren " unter "Mikroskopsteuerung" das 40x/1,4-Objektiv mit Ölimmersion aus.
2. Suchen Sie den gewünschten Bereich.
   1. Legen Sie den Objektträger in den Objektträgerhalter und heben Sie das Objektiv an, bis das Öl das Deckglas berührt.
   2. Positionieren Sie die Wachstumsfuge oder einen anderen interessierenden Bereich unterhalb des Strahlengangs.
   3. Klicken Sie auf der Registerkarte "Lokalisieren " auf "Fluoreszenz", wählen Sie DAPI und bewegen Sie mit dem Okular den Diahalter mit dem Joystick, um die Wachstumsfuge oder den interessierenden Bereich unter dem Sichtfeld zu positionieren.
   4. Wählen Sie auf der Registerkarte "Erfassung " zunächst nur den DAPI-Kanal aus.
   5. Klicken Sie auf Fortlaufend , um das Bild dieses Kanals auf dem Bildschirm anzuzeigen und sicherzustellen, dass die Wachstumsfuge sichtbar ist.
   6. Öffnen Sie den Kachel-Viewer, indem Sie auf der Registerkarte Kacheln auf Viewer anzeigen klicken. Fügen Sie die gewünschte Anzahl von Kacheln hinzu (in der Regel 1 Kachel in x-Richtung und 3-5 in y-Richtung) und klicken Sie auf Vorschau und Start (Ergänzende Abbildung S1B).
   7. Vergewissern Sie sich, dass die Kacheln die drei Zonen der Wachstumsfuge abdecken – ruhende, proliferationsaktive und hypertrophe Zone. Passen Sie die Position und Anzahl der Kacheln nach Bedarf an.
3. Richten Sie die Bildgebungsparameter ein.
   1. Klicken Sie auf Kontinuierlich auf der Registerkarte Akquisition . Passen Sie auf der Registerkarte "Kanäle " die Verstärkung (Master) und die Laserleistung an, um die Kerne deutlich auf dem Bildschirm anzuzeigen. Lassen Sie den Airyscan-Detektor ausrichten. Öffnen Sie das Fenster für die Anpassung des Airyscan-Detektors , indem Sie auf das gekachelte Rosettensymbol am unteren Rand des Fensters klicken. Sobald es ausgerichtet ist, werden alle Kacheln grün (Ergänzende Abbildung S1C).
   2. Wählen Sie die GFP- und mCherry-Kanäle einzeln aus und wiederholen Sie diese Schritte, indem Sie Gain (Master) und Laserleistung einstellen und den Airyscan-Detektor ausrichten.
   3. Wählen Sie alle drei Kanäle aus und klicken Sie auf Kontinuierlich. Lassen Sie den Airyscan-Detektor ausrichten.
   4. Definieren Sie auf der Registerkarte "Aufnahmemodus" die Werte für "Bildgröße", "Pixel", "Größe", "Bildgröße", "Geschwindigkeit" und "Mittelwertbildung". In der ergänzenden Abbildung S1D,E finden Sie die Werte für die Einstellungen für den Erfassungsmodus, die Verstärkung (Master) und die Laserleistung für die verwendeten Kanäle.
4. Erfassen Sie Bilder.
   1. Klicken Sie auf der Registerkarte "Akquisition " auf das Kontrollkästchen "Z-Stack ".
   2. Wenn nur der DAPI-Kanal ausgewählt ist, klicken Sie auf Kontinuierlich , um das Bild auf dem Bildschirm anzuzeigen. Bewegen Sie das Objektiv auf die nächstgelegene Ebene, die abgebildet werden soll. Klicken Sie auf der Registerkarte Z-Stapel auf Erste Ebene festlegen , fokussieren Sie weg auf die letzte Ebene, die angezeigt werden soll, und klicken Sie auf Letzte Ebene festlegen . Bild 30-40 μm Z-Stapel.
   3. Stellen Sie das Intervall auf 0,15 μm ein.
   4. Verschieben Sie sich in die Mitte des Z-Stapels. Klicken Sie auf der Registerkarte Kacheln unter Kachelbereiche auf Überprüfen und klicken Sie auf Z festlegen und zum nächsten Mal verschieben.
   5. Überprüfen Sie auf der Registerkarte Fokusstrategie , ob die Fokusstrategie auf Z-Werte/Fokusoberfläche verwenden eingestellt ist, die in der Kacheleinrichtung definiert ist.
   6. Klicken Sie auf Experiment starten , um die Bildaufnahme zu starten.
5. Bildverarbeitung
   1. Wählen Sie auf der Registerkarte Verarbeitung die Option Einzel - oder Batch-Modus aus. Wählen Sie Airyscan-Verarbeitung. Markieren Sie 3D-Verarbeitung und wählen Sie Standard-Autofilter. Wählen Sie das aufgenommene Rohbild aus und beginnen Sie mit der Verarbeitung (Ergänzende Abbildung S2A).
   2. Sobald die Airyscan-Verarbeitung abgeschlossen ist, wählen Sie Stitching in den Verarbeitungsmethoden. Wählen Sie Neue Ausgabe, Sicherungskacheln, Schattierung korrigieren und Alle als Referenz aus, wobei die Referenz DAPI ist. Wählen Sie das von Airyscan verarbeitete Bild aus und starten Sie die Verarbeitung (Ergänzende Abbildung S2B).
   3. Speichern Sie die rohen und doppelt bearbeiteten Bilder. Letzteres wird im Batch-Modus automatisch gespeichert.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Die hier verwendete Analyse-Pipeline wurde an die Zwecke dieser Studie angepasst. Die Details zu den Pipeline-Operationen sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.

1. Importieren Sie die czi-Image-Datei in die Software. Öffnen Sie das Analysefenster. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Neue Pipeline aus...
2. Um eine Zellenerkennungspipeline zu erstellen, importieren Sie den Cellpose Python Segmenter in die Pipeline¹². Legen Sie Model_Name auf cyto2, Input_channel auf 2, Second_channel auf 3, Diameter_in_μm auf 10, Flow_threshold auf 0,4 und Cellprob_threshold auf 0 fest. Fügen Sie vor der Pipeline einen Dokumentobjekt importieren (umbenannt in Manuelle Beschriftungen importieren) und nach der Pipeline einen Objektfeaturefilter (umbenannt in Größenfilter) hinzu, indem Sie auf + Vorgang hinzufügen klicken. In der ergänzenden Abbildung S3A finden Sie die Werte der Pipeline-Einstellungen.
   1. Verschieben des Betrachters auf die erste Ebene von Interesse
   2. Klicken Sie auf das Symbol für das Werkzeug "Objekte zeichnen"
   3. Klicken Sie auf das Symbol für den Polygon-Modus
   4. Zu analysierende Fläche zeichnen
   5. Verschieben des Betrachters auf die letzte Ebene von Interesse
   6. Zu analysierender Bereich zeichnen
   7. Klicken Sie auf das grüne Häkchen Änderungen übernehmen
   8. Klicken Sie auf das Symbol Objekttabelle anzeigen
   9. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das erstellte Objekt und wählen Sie Objekt umbenennen , um das Objekt in einen geeigneten Namen umzubenennen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das erstellte Objekt und klicken Sie auf Tag hinzufügen. Fügen Sie ein Tag mit dem Namen Analysebereich hinzu.
3. Führen Sie diese Pipeline aus, indem Sie oben im Bereich Analyse auf den blauen Pfeil nach vorne klicken.
4. Um eine primäre Zilien- und Zentriol-Detektionspipeline zu erstellen, öffnen Sie das Analysefenster, und wählen Sie in der Dropdown-Liste Neue Pipeline... aus. Fügen Sie der Pipeline die folgenden Operatoren hinzu: Dokumentobjekte importieren (umbenannt in Manuelle Beschriftungen importieren), zwei Segmentieroperatoren für den Intensitätsschwellenwert (umbenannt in Cilia-Schwellenwert und Zentriole-Schwellenwert), Aufteilen (umbenannt in Zentriol-Aufteilung), Objekt-Feature-Filter (umbenannt in Zentriole-Aufteilungsgrößenfilter) und Kompartiment (umbenannt in Fach - Zelle). In der ergänzenden Abbildung S3B finden Sie die Werte der Pipeline-Einstellungen.
5. Führen Sie diese Pipeline aus, indem Sie oben im Bereich Analyse auf den blauen Pfeil nach vorne klicken.
6. Öffnen Sie das Fenster Objekte. Klicken Sie auf Im/Export..., wählen Sie Excel-Export.... Wählen Sie die folgenden zu speichernden Funktionen aus: # Untergeordnete Elemente, Name, Übergeordnete Namen, 3D-orientierte Grenzen Kurze Seite, Mittlere Seite, Lange Seite, Winkel XY, Winkel XZ, Winkel YZ, Begrenzungsrahmen X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, SizeX, SizeY, SizeZ, Mittelpunkt der Geometrie X, Y, Z, Ebene Erste, Letzte, Anzahl, Sphärizität (Netz), Volumen (Netz), Oberfläche (Netz).

Die Wachstumsfuge einer 6 Wochen alten Maus wurde unter Verwendung des beschriebenen Protokolls abgebildet und die primäre Zilienorganisation im Gewebe kartiert. Ein Bild aller drei Regionen der Wachstumsfuge - ruhend, proliferativ und hypertroph - wurde aufgenommen und durch die Analysepipeline geleitet (Abbildung 2A). Einzelne Zellen können mit der DAPI-Färbung identifiziert werden, wobei ihr ziliäres Axonem in rot und ihre Zentriolen in grün sind. Die Auflösung mit dieser Methode ist hoch genug, um einzelne Zentriolen zu unterscheiden (Abbildung 2B). Bei dieser Auflösung können die Flimmerhärchen in ihrer 3D-Umgebung visualisiert werden, wobei sie in verschiedene Richtungen zeigen (Video 1).

Bilder mit niedrigerer Auflösung und Objektiven höherer Vergrößerung können ebenfalls aufgenommen werden, um primäre Zilien in einer größeren Geweberegion zu visualisieren. Diese sind jedoch nicht für die Analyse der Zilienorientierung in 3D geeignet. So wurden beispielsweise die primären Flimmerhärchen im Gelenkknorpel mit dem 20x-Objektiv abgebildet, was zeigt, dass die Methode auch bei anderen Geweben funktioniert (Abbildung 2C). Bei dieser Auflösung sind die ziliären Axoneme in Rot zu erkennen, aber die Zentriolen sind schwieriger zu unterscheiden. Der subchondrale Knochen neigt dazu, viele GFP-Hintergrundsignale zu präsentieren, was die Identifizierung von Zentriolen in diesem Gewebe erschwert.

Die Pipeline kann einzelne Zellen, primäre Zilien und Zentriolen nachweisen und eignet sich für hochorganisierte junge Wachstumsfugen und ältere Wachstumsplatten, bei denen die Säulen weniger gut definiert sind, wie bei 10 Wochen alten Mäusen (Abbildung 3). Zellen und Zilien werden in 3D detektiert, wie sie auf dem gesamten Z-Stack zu sehen sind.

Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf. Flussdiagramm der verschiedenen Schritte im Protokoll von der Gewebeentnahme bis zur Bildanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Primäre Zilien in murinen Geweben der ARL13B-CENTRIN-2-Maus. (A) Eine 6 Wochen alte Wachstumsfuge mit DAPI in weiß, CENTRIN-2 in grün und ARL13B in rot, aufgenommen mit dem 40x-Objektiv. (B) Vergrößern Sie ein einzelnes primäres Zilium und seine beiden Zentriolen. (C) Gelenkknorpel und subchondraler Knochen einer 4 Wochen alten Maus, aufgenommen mit dem 20x-Objektiv. (D) Niere einer 6 Wochen alten Maus, die mit der gleichen Pipeline wie für Muskel-Skelett-Gewebe aufgenommen wurde. (E) Vergrößerung des weißen Kastens in D , der einzelne primäre Zilien und ihre Zentriolen in der Niere zeigt. Maßstabsleisten = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Pipeline zur Detektion von Zellen und Zilien. Beispielhafte Anwendung der Bildanalyse-Pipeline auf einer 10 Wochen alten Wachstumsfuge. (A) Das Bild wurde in der Software geöffnet. (B) Ergebnis der Zelldetektionspipeline. (C) Ergebnis der Nachweisleitung für Zilien und Zentriolen. Die Flimmerhärchen sind rosa und die Zentriolen grün. Die Seitenansicht zeigt, dass die Auflösung hoch genug ist, um Flimmerhärchen, die in verschiedene Richtungen ausgerichtet sind, in 3D zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Dreidimensionale Rekonstruktion einer 6 Wochen alten Wachstumsfuge aus der ARL13B-CENTRIN-2 Maus. Die dreidimensionale Rekonstruktion wurde in der Software Imaris durchgeführt und als Animationsvideo aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Einstellungen für die Bildaufnahme am Mikroskopsystem. (A) Smart Setup-Fenster , um die Kanäle hinzuzufügen und den Airyscan-Modus auszuwählen. (B) Kachel-Viewer zum Auswählen und Anzeigen einer Vorschau der Kacheln, die abgebildet werden sollen. (C) Airyscan-Detektor-Anpassungsfenster , in dem die Ausrichtung der Airyscan-Detektoren bestätigt wird, sobald alle Kacheln grün werden. (D) Lasereinstellungen für die drei Kanäle. (E) Einstellungen für den Erfassungsmodus und den Z-Stapel. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Bildverarbeitungseinstellungen am Mikroskopsystem. (A) Einstellungen für die Airyscan-Verarbeitung. (B) Einstellungen für das Sticken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Benutzerdefinierte Bildanalyse-Pipelines. (A) Zelldetektionspipeline unter Verwendung der GFP- und DAPI-Kanäle. (B) Primäre Zilien- und Zentriol-Detektionspipeline unter Verwendung der mCherry- bzw. GFP-Kanäle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

In diesem Protokoll ist es wichtig, mit den Schritten der Gewebeverarbeitung und -einbettung unmittelbar nach der Entnahme fortzufahren. Die Gewebeblöcke und -schnitte können jedoch mindestens 3 Monate bei -20 °C aufbewahrt werden. Mehrere Schritte in diesem Protokoll können geändert werden, um für unterschiedliche Anwendungen geeignet zu sein, insbesondere für die Schnittdicke, die Vergrößerung und die Z-Stapel-Parameter. Dies wirkt sich auf die Bildgebungstiefe und die erzielte Auflösung aus. Änderungen in der numerischen Apertur und im Auflösungsmodus konnten genutzt werden, um eine noch höhere Auflösung zu erhalten und die Größe des Z-Stacks-Intervalls zu verringern. Dies würde jedoch die Bildgebungszeit verlängern oder die Größe des Sichtfelds verringern, das abgebildet werden kann. Die beschriebenen bildgebenden Parameter sind die Mindestanforderungen, die für die 3D-Analyse der primären Zilienorientierung identifiziert wurden.

Die Wahl des Einbettmediums ist wichtig, um eine hohe Auflösung zu erzielen. Der Brechungsindex des Eindeckmediums muss ähnlich wie der des Immersionsmediums sein, um die Bildverschlechterung im Z-Stapel zu minimieren. Der Brechungsindex des Eindeckmittels und des hier verwendeten Immersionsöls haben Brechungsindizes von 1,52 bzw. 1,518. Die Airyscan-Funktion des hier verwendeten Konfokalmikroskops bietet hochauflösende Bilder. Andere hochauflösende Mikroskope könnten verwendet werden; Wir stellten jedoch fest, dass der konfokale Modus allein nicht ausreichte, um die für die Größe der abgebildeten Bereiche erforderliche Auflösung zu erreichen. Die maximale Auflösung des Airyscan-Modus SR-8Y beträgt 120/160 nm in x/y und 450 nm in z und eine maximale Anzahl von Bildern/s von 47,5. Wir haben festgestellt, dass der Multiplex SR-4Y Airyscan-Modus, der eine maximale Auflösung von 140 nm in x/y und 450 nm in z bietet, aber mit halber Geschwindigkeit und einer maximalen Anzahl von Bildern/s von 25 Bildern Bilder liefert, keinen signifikanten Unterschied für die Abbildung primärer Zilien in 3D darstellt. In ähnlicher Weise würde die Abbildung des Airyscan-Superauflösungsmodus (SR), der die höchste Auflösung bei diesem Mikroskop bietet – 120 nm in x/y und 350 nm in z – länger dauern, da die maximale Anzahl von Bildern/s 4,7¹³ beträgt.

Das Hintergrund-GFP-Signal kann in anderen Geweben wie dem Muskel beobachtet werden. Um dies zu minimieren, kann der Bereich der Laser verengt werden, um die Überlappung mit anderen Wellenlängen zu reduzieren. Diese Linie wurde zuvor verwendet, um primäre Zilien im Embryo, primäre Zellkulturen, Muskelfasern und das retinale Pigmentepithel^{abzubilden 9,14,15}. Wir haben erfolgreich primäre Zilien in Nieren-, Knorpel- und Knochengewebe abgebildet. Eine gewisse Optimierung der Bildgebungseinstellungen wird wahrscheinlich für verschiedene Gewebe erforderlich sein. Dieses Kryosektionsprotokoll sollte jedoch die Erhaltung des Signals gewährleisten.

Zweizellige Dickschnitte (40-60 μm) sind ausreichend, um 3D-Orientierungsinformationen in der Wachstumsfuge zu erhalten, da dies die Abbildung ganzer Zellen und ihrer primären Zilien ermöglicht. Für andere Gewebe, in denen Zellen größer als Chondrozyten sind, wie z. B. Adipozyten, können dickere Schnitte erforderlich sein, um Daten über die Zellpopulation zu sammeln. Abhängig von der Tiefenauflösung des verwendeten Mikroskops kann es sein, dass es nicht möglich ist, bis in dickere Bereiche hinein abzubilden. Gewebereinigungstechniken würden wahrscheinlich aufgrund der dafür benötigten Zeit zum Verlust des endogenen mCherry- und GFP-Signals führen. Dies wurde untersucht, da Clearing-Methoden für andere Bildgebung in der Extremität verwendet wurden, dies in diesem Zusammenhang jedoch nicht als notwendig erachtet wurde. Unsere Erfahrungen mit endogenem CD31-RFP deuteten darauf hin, dass Clearing-Techniken eine sorgfältige, maßgeschneiderte Probenoptimierung erfordern.

Diese ARL13B-CENTRIN-2-Linie kann mit anderen Mauslinien gekreuzt werden, um die Organisation der primären Zilien in Geweben weiter zu untersuchen. Zum Beispiel haben wir es mit einem aggrecan-Cre IFT88^fl/fl gekreuzt, um IFT88, ein primäres Zilienprotein, dessen Deletion die Ciliation verhindert, in aggrecan-exprimierenden Zellen (postnatalen Chondrozyten) bedingt ^{auszuschalten5,6}. Diese ARL13B- und CENTRIN-2-Fluoreszenzsignale können dann verwendet werden, um die Effizienz genetischer Störungen auf der Ebene der Ziliarstruktur in Geweben und der damit verbundenen Veränderungen in der Ziliarorganisation zu messen. Genau das wird derzeit in der laufenden Arbeit getan. Unser erstes Ziel wird es sein, mit dieser robusteren Methodik den Effekt der IFT88-Deletion auf die Prävalenz von Zilien zu quantifizieren. Zuvor haben wir dies mit Hilfe von Immunfluoreszenz gemessen und eine Reduktion von 20 % geschätzt⁶. Diese Methode kann auch mit der Immunhistochemie kombiniert werden, um primäre Zilien in Kombination mit anderen Proteinen, beispielsweise einem Zellmembranprotein, abzubilden.

Das Transgen auf ARL13B könnte einen Einfluss auf die ARL13B-Expression und die Länge der primären Zilien haben. Frühere Studien haben mit der ARL13B-CENTRIN-2-Linie unterschiedliche primäre Zilienlängen im Vergleich zu nicht-transgenem ARL13B in bestimmten Regionen des Mäusegehirns gemessen, mit keinem Unterschied in anderen¹⁶. Eine andere Studie beobachtete Unterschiede in der Länge der primären Zilien in einer GFP-markierten ARL13B-Mauslinie im Vergleich zu unmarkiertem ARL13B in embryonalen Fibroblasten der Maus¹⁰. Die laufenden Arbeiten verifizieren Veränderungen der primären Zilienlänge in der Wachstumsfuge und anderen Geweben durch den Vergleich der Ergebnisse mit der ARL13B-CENTRIN-2-Mauslinie mit der Antikörperfärbung gegen nicht-transgenes ARL13B.

Die Bildanalyse-Pipeline in diesem Protokoll wurde entwickelt, um anschließend den Flimmerprozentsatz, die Länge und die 3D-Orientierung der primären Zilien sowie die Anzahl und Position der Zentriolen in der Wachstumsfuge zu messen. Die Bildanalysesoftware ermöglicht die Erstellung benutzerdefinierter Pipelines, indem die beteiligten Schritte geändert werden. Das Ergebnis dieser Pipeline ist eine Tabelle mit den Maßen der ausgewählten Merkmale für die erkannten Zellen, Zilien und Zentriolen. Die Nachanalyse kann dann je nach Zweck der Studie in R oder einer anderen Software durchgeführt werden. Wie bei den Bildgebungseinstellungen können die Pipeline-Schritte und spezifischen Einstellungen geändert werden, um mit verschiedenen Bildern und entsprechend den Zielen der Studie zu arbeiten. Insgesamt ermöglicht diese Methode eine Hochdurchsatzanalyse von primären Zilien, als sie bisher in der Wachstumsfuge publiziert wurde. Die Anzahl der Zellen und der zugehörigen Zilien, die untersucht werden können, ermöglicht größere und zuverlässigere Messungen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Wir danken allen Mitarbeitern der BSU am Kennedy Institute of Rheumatology, insbesondere Albertino Bonifacio, für die Tierhaltung. Wir danken dem Oxford-ZEISS Centre of Excellence of Biomedical Imaging für die Unterstützung bei der Verwendung des Mikroskops, insbesondere Dr. Jacky (Ka Long) Ko für die Hilfe bei der Entwicklung der Bildanalyse-Pipeline. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des Kennedy Trust of Rheumatology Research (Johnson) und den Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC, BB/X007049/1) unterstützt.