הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2

שיטה זו מתארת את ניצול האות האנדוגני במודל עכבר טרנסגני ARL13B-CENTRIN-2 להדמיית ריסים ראשוניים באתרם, בתלת מימד על פני שטחים גדולים של רקמה מינרלית, מאיסוף רקמות ועד לניתוח ארגון הריסים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם על סוגים אחרים של רקמות.

הסיליום הראשוני הוא אברון בודד שאינו נע המורכב על ידי רוב סוגי התאים. זה חיוני להתפתחות והומאוסטזיס של השלד ובתיאום תגובות התאים לרמזים ביוכימיים ומכניים מהסביבה הסובבת אותם. בשל גודלו בקנה מידה מיקרומטרי, הריסים הראשוניים מאתגרים להדמיה באתרם כדי לאפיין ברקמות, בצורה תפוקה גבוהה וללא הטיות אופטיות. הבנת ארגונו בסביבה התלת-ממדית שלו in vivo תהיה המפתח להבנת תפקידי הריסים בפיזיולוגיה ובמחלות. קו העכברים ARL13B-CENTRIN-2 מציג תג mCherry על חלבון האקסונם הריסי ARL13B ותג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על החלבון הצנטריול CENTRIN-2, הממוקם בבסיס הסיליום. קו עכבר זה מאפשר הדמיה של הריסים הראשוניים ללא צורך בצביעה, מה שמפחית את מספר השלבים באיסוף התמונות ועוקף בעיות עם אות לרעש. פרסום זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיית ריסים ראשוניים ברקמות שרירים ושלד תוך שמירה על האות הפלואורסצנטי. הוא גם מתאר צינור ניתוח תמונה ישים אוניברסלי, המאפשר כימות חסר פניות של תכונות ריסים, כגון אורך וכיוון תלת מימד.

הסיליום הראשוני הוא אברון חיוני בהתפתחות והומאוסטזיס של רקמות ואיברים רבים, כולל השלד. במהלך צמיחה לאחר הלידה, הוא מווסת את מינרליזציה של הסחוס במהלך אוסיפיקציה אנדוכונדרלית¹. בבני אדם, מוטציות גנטיות המשפיעות על חלבונים הקשורים לריסים גורמות למגוון מחלות והפרעות התפתחותיות, הידועות בשם ריסים. הבנת הארגון של ריסים ראשוניים בתוך רקמות חשובה להבנת האופן שבו הם מווסתים את ההתנהגות התאית ברמת האיבר. הוכח כי שכיחות, אורך וכיוון של ריסים ראשוניים משתנים בתוך ובין רקמות, מה שמרמז על תפקיד לארגון הרקמות לתפקודם ^2,3,4. לוחית הגדילה, שכבת הסחוס בקצה העצמות הארוכות שבה מתרחשת רוב צמיחת העצם לאחר הלידה מגיל המוקדמות ועד גיל ההתבגרות, היא רקמה מאורגנת מאוד עם תאי כונדרוציטים המסודרים בעמודות. בצלחת הגידול, כונדרוציטים עוברים שלבי התמיינות, מהמנוחה ועד להתפשטות להיפרטרופיים.

ארגון תאי זה הולך לאיבוד בחלק מהריסים, מה שמצביע על כך שריסים ראשוניים עשויים למלא תפקיד בתיאום הארגון התאי הזה ו/או, לכל הפחות, להיות קשורים לקיטוב תאי. בנוסף, נראה כי אוריינטציה ראשונית של ריסים ממלאת תפקיד בתפקוד המכנו-סנסורי שלהם, עם הבדלים שנצפו בין אזורים נושאי עומס ולא נושאי עומס בסחוס מפרקי⁴. המחקרים האחרונים שלנו רמזו על תפקידים דיפרנציאליים באזורים שונים של סחוס מפרקי וצלחת הצמיחה ^5,6. מחקרים קודמים שצילמו ריסים ראשוניים בצלחת הגידול הוגבלו לדו-ממד, שמאבד מידע הקשור לארגון ריסים ברקמה או מוגבל למספר קטן של תאים בתלת מימד, מה שמפחית את קנה המידה והעוצמה של הניתוח ^7,8.

בין האתגרים להדמיית הסיליום הראשוני הם גודלו בקנה מידה מיקרומטרי וחוסר הספציפיות של נוגדנים אימונוהיסטוכימיים. שימוש באות פלואורסצנטי מקורי מבטיח לוקליזציה וספציפיות חזקות. עם זאת, אותות פלואורסצנטיים מקוריים יכולים להיות מאתגרים להדמיה ברקמות מינרליות, מכיוון שתהליך הסרת האבדן הארוך להטמעת רקמות בפרפין עלול לגרום לאובדן אות. הקפאת דגימות שהוקפאו במצב המקורי מונעת אובדן זה על ידי האצת תהליך ההטבעה והחיתוך.

כדי לדמות ריסים ראשוניים באתרם, נוצר קו עכבר טרנסגני כפול על ידי Bangs et al., המבטא חלבון דמוי גורם ADP-ribosylation (ARL13B) שהתמזג ל-mCherry ו-CENTRIN-2 התמזג ל-GFP⁹. ARL13B הוא GTPase קטן הממוקם בקרום הסיליום הראשוני, ו-CENTRIN-2 הוא חלבון צנטריולרי הממוקם בשני הצנטרוזומים בבסיס הסיליום^10,11. קו עכבר זה, אם כן, מאפשר לדמות ריסים ראשוניים המסומנים בפלואורסצנט ללא צורך באימונוהיסטוכימיה.

הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בקו טרנסגני זה כדי לדמות ריסים ראשוניים בתלת מימד בלוחות גדילה לאחר לידה של עכברים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, רק דורש צביעה נוספת של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). ניתן לדמות ולנתח מאות ריסים ראשוניים במאות תאים באופן קולקטיבי בהקשר של רקמה. צינור ניתוח תמונה מודד לאחר מכן את שכיחות, אורך וכיוון ראשוניים של ריסים באזורים השונים של לוחית הגידול. הצינור מסוגל גם לכמת את התכונות הללו עבור צנטריולות. מתווה של השלבים בפרוטוקול מוצג באיור 1.

גידול בעלי חיים וניסויים נערכו בהתאם למסגרות האתיות של אוניברסיטת אוקספורד ותחת רישיון פרויקט כפי שהוענק על ידי משרד הפנים הבריטי. פרוטוקול זה בוצע בעכברים בין הגילאים 2 ל-10 שבועות, אך עבד בסחוס של עכברים מעבר לגיל זה.

1. איסוף רקמות

1. המתת חסד של עכברים על ידי מילוי קופסה המכילה את העכברים בפחמן דו חמצני עד 80% בנפח ושמירה על ריכוזו למשך 5 דקות. בצע פריקת צוואר הרחם.
2. נתח את הרקמה המעניינת.
   הערה: להלן פרוטוקול לניתוח הברכיים האחוריות, כולל לוחות הגדילה של השוק והירך והסחוס המפרקי.
   1. חותכים את העור בכף הרגל וחותכים לחלק העליון של הירך. הסר את העור מקו החתך בעזרת מלקחיים.
   2. חתוך את רקמת השריר והשומן מהרגליים.
   3. כדי לנתק את הרגל מהגוף, חותכים בצורה נקייה דרך עצם הירך בחלק העליון של הירך. חותכים את כף הרגל בתחתית השוקה.
   4. הסר את כל רקמת השריר והשומן העודפת שנותרה על הרגל.

2. קיבוע והטמעה של רקמות

הערה: לאורך כל הפרוטוקול, הקפד לשמור על הרקמה בחושך כדי למנוע אובדן אות פלואורסצנטי.

1. מקבעים את הרקמה בפורמלין של 10% בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות.
2. העבירו את הרקמות ל-2.5% פורמלין ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. העבירו את הרקמות ל-30% סוכרוז במים מזוקקים (dH₂O), וסובבו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך הלילה או למשך 3 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מלאו את הצינורות עד למעלה כדי להבטיח טבילה מלאה של הרקמה במהלך הסיבוב. לאחר הדגירה הזו, הרקמה תשקע לתחתית הצינור.
4. הניחו כמות קטנה של קרח יבש בקופסה נפרדת והניחו את הקריומולד מעל. עקבו אחר קו של מדיום סופר קריו-הטבעה (SCEM) והניחו את הגפה לאורכו, כשפיקת הברך פונה כלפי מטה ופותחים את השוקה ועצם הירך בנפרד כדי שהרגל תהיה שטוחה ככל האפשר. החזק במקומו עם מלקחיים עד שה-SCEM מתחיל להתמצק והגפה כבר לא זזה כשהיא לא מוחזקת.
5. מכסים לחלוטין ב-SCEM, ממלאים את התבנית עד למעלה. הנח את הדגימה בקופסת הקרח היבש, תוך שמירה על הדגימה שטוחה כדי למנוע תזוזה של הרקמה, עד שה-SCEM מתמצק לחלוטין.
6. מעבירים ל -20 מעלות צלזיוס.

3. חתך

1. הסר את הבלוק מהתבנית וחתוך לגודל שמתאים לצ'אק של קריוסטט. חבר את הבלוק לצ'אק על ידי מריחת SCEM על הצ'אק והנחת הבלוק מעל.
2. הניחו להתמצקות לפחות 5 דקות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בקריוסטט.
3. חבר את הצ'אק למחזיק המדגם ולהב למחזיק הלהב.
4. חתוך את הבלוק עד שמגיעים ללוחית הצמיחה של השוקה. באופן אידיאלי, חתך כשהשוקה פונה כלפי מעלה.
5. חותכים סרט קריופילם לגודל שמתאים לדגימה עם מספיק מקום סביבו. התקן את הקריופילם על המשטח החתוך, תוך הבטחת הידבקות הדוקה של הקריופילם בעזרת כלי מתאים. חותכים קטעים בעובי 40-60 מיקרומטר לקבלת חלקים בעובי שני תאים. אסוף את הסרט באמצעות מלקחיים והניח על שקופית, צד הדגימה כלפי מעלה, ואת צלחת הצמיחה הטיביאלית בקו אחד עם המגלשה הקצרה של המגלשה.
6. אחסן את השקופיות לדוגמה ב-20 מעלות צלזיוס.

4. הכנת שקופיות והרכבה

1. הפשירו את המגלשה אופקית בטמפרטורת החדר.
2. שטפו את השקופית עם טיפת PBS למשך 3 x 5 דקות כדי להסיר את ה-SCEM.
3. מכתים עם 10 מיקרומטר DAPI למשך דקה אחת.
4. שטפו את השקופית עם טיפת PBS למשך 2 x 5 דקות.
5. הר, מכסים בכיסוי ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אטום את שולי הכיסוי עם איטום כיסוי.
6. תמונה למחרת.

5. הדמיה במיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: הרזולוציה של המטרה 40x/1.4 במיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש היא 240 ננומטר.

1. הגדר את המיקרוסקופ.
   1. הפעל את המיקרוסקופ ופתח את התוכנה. לחץ על כפתור המערכת .
   2. תחת הכרטיסייה רכישה , לחץ על הגדרה חכמה כדי להגדיר את הערוצים. בחר והוסף את ערוצי GFP, mCherry ו- DAPI. בחר באפשרות Airyscan ובפונקציה SR8Y במשולש Airyscan (בין רזולוציה למהירות מולטיפלקס 8Y). לחץ על האות הטוב ביותר | בסדר (איור משלים S1A).
   3. בכרטיסייה אתר , תחת בקרת מיקרוסקופ, בחר את המטרה 40x/1.4 עם טבילת שמן.
2. אתר את אזור העניין.
   1. הנח את השקופית במחזיק השקופיות והעלה את המטרה עד שהשמן נוגע בכיסוי.
   2. מקם את לוחית הגידול או אזור עניין אחר מתחת לנתיב האור.
   3. בכרטיסייה אתר , לחץ על פלואורסצנטי, בחר DAPI, ובעזרת העינית, הזז את מחזיק השקופית עם הג'ויסטיק כדי למקם את לוחית הגידול או אזור העניין מתחת לשדה הראייה.
   4. בכרטיסיה רכישה , התחל על-ידי בחירת ערוץ DAPI בלבד.
   5. לחץ על רציף כדי להציג את התמונה של אותו ערוץ על המסך ולוודא שלוחית הגידול מוצגת.
   6. פתח את מציג האריחים על-ידי לחיצה על הצג מציג בכרטיסיה אריחים. הוסף את מספר האריחים הנדרש (בדרך כלל אריח אחד בכיוון x ו-3-5 בכיוון y) ולחץ על תצוגה מקדימה והתחל (איור משלים S1B).
   7. בדוק שהאריחים מכסים את שלושת האזורים של לוחית הצמיחה - מנוחה, התפשטות והיפרטרופיה. התאם את מיקום האריח ומספרו כנדרש.
3. הגדר את פרמטרי ההדמיה.
   1. לחץ על רציף בכרטיסייה רכישה . בכרטיסייה ערוצים , כוונן את הרווח (מאסטר) ואת עוצמת הלייזר כדי להציג את הגרעינים בבירור על המסך. אפשר לגלאי Airyscan להתיישר. פתח את חלון התאמת גלאי Airyscan על ידי לחיצה על סמל הרוזטה המרוצף בתחתית החלון; ברגע שהוא מיושר, כל האריחים יהפכו לירוקים (איור משלים S1C).
   2. בחר את ערוצי GFP ו-mCherry בנפרד וחזור על שלבים אלה - הגדרת הרווח (מאסטר), כוח הלייזר ויישר את גלאי Airyscan.
   3. בחר את כל שלושת הערוצים ולחץ על רציף. אפשר לגלאי Airyscan להתיישר.
   4. בכרטיסייה Acquisition Mode, הגדר את ערכי גודל התמונה, הפיקסל, הגודל, גודל המסגרת, המהירות והממוצע. ראה איור משלים S1D,E לערכים של הגדרות מצב רכישה, רווח (מאסטר) ועוצמת לייזר עבור הערוצים המשמשים.
4. השגת תמונות.
   1. בכרטיסייה רכישה , לחץ על תיבת הסימון Z-Stack .
   2. כאשר רק ערוץ ה-DAPI נבחר, לחץ על רציף כדי להציג את התמונה על המסך. הזז את המטרה למטה למישור הקרוב ביותר לצילום. בכרטיסייה Z-Stack , לחץ על הגדר מישור ראשון, התמקד הרחק למישור האחרון לצפייה ולחץ על הגדר מישור אחרון . תמונה של ערימות z של 30-40 מיקרומטר.
   3. הגדר את המרווח ל-0.15 מיקרומטר.
   4. עבור למרכז ערימת ה-z. בכרטיסייה אריחים , תחת אזורי אריחים, לחץ על אמת ולחץ על הגדר Z והעבר להבא.
   5. תחת הכרטיסיה אסטרטגיית מיקוד , ודא שאסטרטגיית המיקוד מוגדרת כהשתמש בערכי Z/משטח מיקוד המוגדרים בהגדרת האריחים.
   6. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישת התמונה.
5. עיבוד תמונה
   1. בכרטיסייה עיבוד, בחר במצב יחיד או אצווה . בחר עיבוד Airyscan. סמן עיבוד תלת מימד ובחר סינון אוטומטי רגיל. בחר את התמונה הגולמית שנרכשה והתחל לעבד (איור משלים S2A).
   2. לאחר השלמת עיבוד Airyscan, בחר תפירה בשיטות העיבוד. בחרו 'פלט חדש', 'נתיך אריחים', 'הצללה נכונה' ו'הכל לפי הפניה', עם ההפניה כ-DAPI. בחר את התמונה המעובדת של Airyscan והתחל לעבד (איור משלים S2B).
   3. שמור את התמונות הגולמיות והמעובדות כפולות. האחרון נשמר אוטומטית במצב אצווה .

6. ניתוח תמונה

הערה: צינור הניתוח המשמש כאן הותאם למטרות מחקר זה. הפרטים של פעולות הצינור מוצגים באיור משלים S3.

1. ייבא את קובץ התמונה czi לתוכנה. פתח את לוח הניתוח; ברשימה הנפתחת , בחר קו צינור חדש...
2. כדי ליצור צינור זיהוי תאים, ייבא את Cellpose Python Segmenter לצינור¹². הגדר את Model_Name ל-Cyto2, Input_channel ל-2, Second_channel ל-3, Diameter_in_מיקרומטר ל-10, Flow_threshold ל-0.4 ו-Cellprob_threshold ל-0. הוסף אופרטור ייבוא אובייקטי מסמך (ששמו שונה לייבוא תוויות ידניות) לפני ואופרטור מסנן תכונות אובייקטים (ששמו שונה למסנן גודל) לאחר קו הצינור על-ידי לחיצה על + הוסף פעולה. ראה איור משלים S3A לערכי הגדרות הצינור.
   1. העברת הצופה למישור העניין הראשון
   2. לחץ על סמל הכלי Draw Objects
   3. לחץ על סמל מצב מצולע
   4. צייר אזור לניתוח
   5. העברת הצופה למישור העניין האחרון
   6. אזור ציור לניתוח
   7. לחץ על הסימון הירוק החל שינויים
   8. לחץ על הסמל Show Objects Table
   9. לחץ לחיצה ימנית על האובייקט שנוצר ובחר Rename Object כדי לשנות את שם האובייקט לשם מתאים. לחץ לחיצה ימנית על האובייקט שנוצר ולחץ על הוסף תגית. הוסף תגית בשם אזור ניתוח.
3. הפעל קו צינור זה על ידי לחיצה על החץ הכחול קדימה בחלק העליון של לוח הניתוח .
4. כדי ליצור קו צינור ראשי לזיהוי ריסים וצנטריולה, פתח את לוח הניתוח, ברשימה הנפתחת בחר קו צינור חדש.... הוסף את האופרטורים הבאים לקו הצינור: ייבוא אובייקטי מסמך (ששמם שונה ל-Import Manual Labels), שני אופרטורים של Intensity Threshold Segmenter (ששמם שונה ל-Cilia Threshold ו-Centriole Threshold), פיצול (שמו שונה ל-Centriole Splitting), Object Feature Filter (ששמו שונה ל-Centriole Splitting size filter) ותא (ששמו שונה ל-Compartment - Cell). ראה איור משלים S3B לערכי הגדרות הצינור.
5. הפעל קו צינור זה על ידי לחיצה על החץ הכחול קדימה בחלק העליון של לוח הניתוח.
6. פתח את החלון אובייקטים. לחץ על Im/Export..., בחר Excel Export.... בחר את התכונות הבאות לשמירה: # צאצאים, שם, שמות אבים, גבולות בכיוון תלת-ממד צד קצר, צד אמצעי, צד ארוך, זווית XY, זווית XZ, זווית YZ, תיבה תוחמת X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, SizeX, SizeY, SizeZ, מרכז הגיאומטריה X, Y, Z, מישור ראשון, אחרון, ספירה, כדוריות (רשת), נפח (רשת), שטח פנים (רשת).

לוחית הגדילה של עכבר בן 6 שבועות צולמה באמצעות הפרוטוקול המתואר וארגון הריסים הראשוני שמופו ברקמה. תמונה של כל שלושת האזורים של לוחית הגידול - מנוחה, שגשוג והיפרטרופית - נלכדה והועברה דרך צינור הניתוח (איור 2A). ניתן לזהות תאים בודדים עם צביעת DAPI, עם האקסונם הריסי שלהם באדום והצנטריולים שלהם בירוק. הרזולוציה בשיטה זו גבוהה מספיק כדי להבחין בין צנטריולים בודדים (איור 2B). ברזולוציה זו, ניתן לדמיין את הריסים בסביבה התלת-ממדית שלהם, כשהם מצביעים לכיוונים שונים (וידאו 1).

ניתן גם לצלם תמונות ברזולוציה נמוכה יותר, עם יעדי הגדלה גבוהים יותר, כדי לדמיין ריסים ראשוניים על פני אזור גדול יותר של רקמה; עם זאת, אלה אינם מתאימים לניתוח אוריינטציה של ריסים בתלת מימד. לדוגמה, הריסים הראשוניים בסחוס המפרקי צולמו עם המטרה פי 20, מה שמדגים שהשיטה עובדת גם על רקמות אחרות (איור 2C). ברזולוציה זו ניתן לזהות את האקסונמים הריסים באדום, אך קשה יותר להבחין בין הצנטריולים. עצם תת-כונדרלית נוטה להציג הרבה אות רקע של GFP, מה שמקשה על זיהוי הצנטריול ברקמה זו.

הצינור יכול לזהות תאים בודדים, ריסים ראשוניים וצנטריולות, והוא עובד עבור לוחיות גדילה צעירות מאורגנות מאוד ולוחות גדילה מבוגרים יותר שבהם העמודות מוגדרות פחות טוב, כמו בעכברים בני 10 שבועות (איור 3). תאים וריסים מזוהים בתלת מימד, כפי שניתן לראות על פני מחסנית ה-z.

איור 1: זרימת עבודה ניסיונית. תרשים זרימה של השלבים השונים בפרוטוקול מאיסוף רקמות ועד ניתוח תמונה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ריסים ראשוניים ברקמות עכברים של עכבר ARL13B-CENTRIN-2. (A) לוחית גדילה בת 6 שבועות, עם DAPI בלבן, CENTRIN-2 בירוק ו-ARL13B באדום, בתמונה עם המטרה פי 40. (B) התקרב לריסים ראשוניים בודדים ולשני הצנטריולים שלו. (C) סחוס מפרקי ועצם תת-כונדרלית של עכבר בן 4 שבועות, בתמונה עם המטרה פי 20. (D) כליה של עכבר בן 6 שבועות שצולמה באמצעות אותו צינור כמו של רקמת שריר ושלד. (E) הגדלה של הקופסה הלבנה ב-D המציגה ריסים ראשוניים בודדים והצנטריולים שלהם בכליה. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר (A,D), 4 מיקרומטר (B), 60 מיקרומטר (C), 6 מיקרומטר (E). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צינור זיהוי תאים וריסים. יישום לדוגמה של צינור ניתוח התמונה על לוחית גידול בת 10 שבועות. (א) תמונה שנפתחה בתוכנה. (ב) תוצאה של צינור זיהוי התאים. (ג) תוצאה של צינור גילוי הריסים והצנטריולים. ריסים בוורוד וצנטריולים בירוק. מבט הצד מדגים שהרזולוציה גבוהה מספיק כדי להבחין בין ריסים המכוונים לכיוונים שונים בתלת מימד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: שחזור תלת מימדי של לוחית גדילה בת 6 שבועות מעכבר ARL13B-CENTRIN-2. השחזור התלת מימדי בוצע בתוכנת אימאריס והוקלט כסרטון אנימציה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

איור משלים S1: הגדרות רכישת תמונה במערכת המיקרוסקופ. (A) חלון הגדרה חכמה כדי להוסיף את הערוצים ולבחור במצב Airyscan . (B) מציג אריחים כדי לבחור ולהציג תצוגה מקדימה של האריחים לתמונה. (C) חלון כוונון גלאי Airyscan , שבו יישור גלאי Airyscan מאושר ברגע שכל האריחים הופכים לירוקים. (D) הגדרות לייזר עבור שלושת הערוצים. (ה) הגדרות מצב רכישה ו-Z-Stack. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S2: הגדרות עיבוד תמונה במערכת המיקרוסקופ. (א) הגדרות עיבוד Airyscan. (ב) הגדרות תפירה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S3: צינורות ניתוח תמונות מותאמים אישית. (A) צינור זיהוי תאים באמצעות ערוצי GFP ו-DAPI. (B) צינור זיהוי ריסים וצנטריולה ראשוניים באמצעות ערוצי mCherry ו-GFP, בהתאמה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

בפרוטוקול זה, חיוני להמשיך בשלבי עיבוד הרקמה וההטמעה מיד לאחר האיסוף. עם זאת, ניתן לשמור את הבלוקים והשקופיות של הרקמה לפחות 3 חודשים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. ניתן לשנות מספר שלבים בפרוטוקול זה כך שיתאימו ליישומים שונים, בפרט, עובי חתך, הגדלה ופרמטרים של z-stack. זה ישפיע על עומק ההדמיה ועל הרזולוציה המתקבלת. ניתן להשתמש בשינויים בצמצם המספרי ובמצב הרזולוציה כדי להשיג רזולוציה גבוהה עוד יותר וגודל מרווח ה-z-stacks קטן. עם זאת, זה יגדיל את זמן ההדמיה או יקטין את גודל שדה הראייה שניתן לצלם. פרמטרי ההדמיה המתוארים הם הדרישות המינימליות שזוהו לניתוח תלת מימד של אוריינטציה ראשונית של ריסים.

הבחירה באמצעי הרכבה חשובה להשגת רזולוציה גבוהה. מקדם השבירה של מדיום ההרכבה חייב להיות דומה לזה של מדיום הטבילה כדי למזער את ירידת התמונה בערימת z. למקדם השבירה של התושבת ולשמן הטבילה המשמש כאן יש מקדמי שבירה של 1.52 ו-1.518, בהתאמה. פונקציית Airyscan במיקרוסקופ הקונפוקלי המשמשת כאן מציעה תמונות ברזולוציה גבוהה. ניתן להשתמש במיקרוסקופים אחרים ברזולוציה גבוהה; עם זאת, מצאנו שהמצב הקונפוקלי בלבד לא הספיק כדי להשיג את הרזולוציה הנדרשת לגודל האזורים המצולמים. הרזולוציה המקסימלית של מצב Multiplex SR-8Y Airyscan היא 120/160 ננומטר ב-x/y ו-450 ננומטר ב-z, ומספר מרבי של פריימים/שנייה של 47.5. מצאנו את מצב Multiplex SR-4Y Airyscan, המציג רזולוציה מקסימלית של 140 ננומטר ב-x/y ו-450 ננומטר ב-z, אך תמונות בחצי מהמהירות עם מספר מקסימלי של פריימים/שנייה של 25, לא כדי להציג הבדל משמעותי להדמיית ריסים ראשוניים בתלת מימד. באופן דומה, מצב הסופר-רזולוציה (SR) של Airyscan, המציע את הרזולוציה הגבוהה ביותר במיקרוסקופ זה - 120 ננומטר ב-x/y ו-350 ננומטר ב-z - ייקח זמן רב יותר לצילום, מכיוון שמספר הפריימים המרבי שלו הוא 4.7¹³.

ניתן להבחין באות GFP ברקע ברקמות אחרות כמו השריר. כדי למזער זאת, ניתן לצמצם את טווח הלייזרים כדי להפחית את החפיפה עם אורכי גל אחרים. קו זה שימש בעבר להדמיית ריסים ראשוניים בעובר, תרביות תאים ראשוניות, סיבי שריר ואפיתל פיגמנט הרשתית ^9,14,15. הצלחנו לדמות ריסים ראשוניים בכליות, בסחוס וברקמת העצם. סביר להניח שתידרש אופטימיזציה מסוימת של הגדרות הדמיה עבור רקמות שונות; עם זאת, פרוטוקול הקפאה זה אמור להבטיח את שימור האות.

חתכים עבים של שני תאים (40-60 מיקרומטר) מספיקים כדי לקבל מידע על אוריינטציה תלת מימדית בצלחת הגידול, מכיוון שהדבר מאפשר הדמיה של תאים שלמים והריסים הראשוניים שלהם. עבור רקמות אחרות שבהן התאים גדולים מכונדרוציטים, כגון אדיפוציטים, ייתכן שיידרשו קטעים עבים יותר כדי לאסוף נתוני אוכלוסיית תאים. בהתאם לרזולוציית העומק של המיקרוסקופ בו נעשה שימוש, ייתכן שלא ניתן יהיה לצלם עמוק לתוך קטעים עבים יותר. טכניקות ניקוי רקמות יובילו ככל הנראה לאובדן אות ה-mCherry וה-GFP האנדוגני בשל הזמן הנדרש. זה נחקר, מכיוון ששיטות ניקוי שימשו להדמיה אחרת בגפיים, אך זה לא נמצא הכרחי בהקשר זה. הניסיון שלנו עם CD31-RFP אנדוגני הצביע על כך שטכניקות ניקוי יצטרכו אופטימיזציה זהירה, מותאמת אישית לדגימה.

ניתן לחצות קו ARL13B-CENTRIN-2 זה עם קווי עכבר אחרים כדי להמשיך ולחקור את ארגון הריסים הראשוניים ברקמות. לדוגמה, הצלבנו אותו עם אגרקן-Cre IFT88^fl/fl כדי להפיל באופן מותנה IFT88, חלבון ריסים ראשוני שמחיקתו מונעת ריסים, בתאים המבטאים אגרקן (כונדרוציטים לאחר לידה)^5,6. לאחר מכן ניתן להשתמש באותות פלואורסצנטיים אלה של ARL13B ו-CENTRIN-2 כדי למדוד את היעילות של הפרעות גנטיות ברמת המבנה הריסי ברקמות וכל שינוי נלווה בארגון הרירי. העבודה המתמשכת עושה כרגע בדיוק את זה. המטרה הראשונה שלנו תהיה לכמת, באמצעות מתודולוגיה חזקה יותר, את ההשפעה של מחיקת IFT88 על שכיחות הריסים. בעבר, מדדנו זאת באמצעות אימונופלואורסצנציה והערכנו זאת בהפחתה של 20%⁶. ניתן לשלב שיטה זו גם עם אימונוהיסטוכימיה כדי לדמות ריסים ראשוניים בשילוב עם חלבונים אחרים, למשל, חלבון קרום התא.

הטרנסגן ב-ARL13B עשוי להשפיע על ביטוי ARL13B ואורך הריסים הראשוניים. מחקרים קודמים מדדו אורכי ריסים ראשוניים שונים עם קו ARL13B-CENTRIN-2 בהשוואה ל-ARL13B שאינו טרנסגן באזורים מסוימים במוח העכבר, ללא הבדל באחרים¹⁶. מחקר אחר הבחין בהבדלים באורך הריסים הראשוניים בקו עכברים ARL13B מתויג GFP בהשוואה ל-ARL13B לא מתויג בפיברובלסטים עובריים של עכברים¹⁰. עבודה מתמשכת מאמתת כל שינוי באורך הריסים הראשוניים בצלחת הגידול וברקמות אחרות על ידי השוואת התוצאות באמצעות קו העכברים ARL13B-CENTRIN-2 עם צביעת נוגדנים כנגד ARL13B לא טרנסגני.

צינור ניתוח התמונה בפרוטוקול זה תוכנן למדוד לאחר מכן את אחוז הריסים, האורך והכיוון התלת-ממדי של הריסים הראשוניים, כמו גם את מספר הצנטריולה והמיקום בלוחית הגידול. תוכנת ניתוח התמונות מאפשרת ליצור צינורות מותאמים אישית על ידי שינוי השלבים המעורבים. הפלט של צינור זה הוא גיליון אלקטרוני עם מידות התכונות שנבחרו עבור התאים, הריסים והצנטריולים שזוהו. לאחר מכן ניתן לבצע פוסט-אנליזה ב-R או בתוכנה אחרת בהתאם למטרות המחקר. בדומה להגדרות ההדמיה, ניתן לשנות את שלבי הצינור וההגדרות הספציפיות כדי לעבוד על תמונות שונות ובהתאם למטרות המחקר. בסך הכל, שיטה זו מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של ריסים ראשוניים ממה שפורסם בעבר בצלחת הגידול. מספר התאים והריסים הקשורים שניתן לחקור מאפשר מדידות גדולות ואמינות יותר.

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

אנו מודים לכל חברי צוות BSU במכון קנדי לראומטולוגיה, במיוחד אלברטינו בוניפאציו, על גידול בעלי חיים. אנו מודים למרכז המצוינות של אוקספורד-צייס להדמיה ביו-רפואית על הסיוע בשימוש במיקרוסקופ, במיוחד לד"ר ג'קי (קה לונג) קו על עזרתו בפיתוח צינור ניתוח התמונה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדי למחקר ראומטולוגי (ג'ונסון) ומועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC, BB/X007049/1).