Generazione di un modello riproducibile di attivazione immunitaria materna a metà gestazionale utilizzando poli (I: C) per studiare la suscettibilità e la resilienza nella prole

L'infezione materna è un fattore di rischio per i disturbi dello sviluppo neurologico. I modelli murini di attivazione immunitaria materna (MIA) possono chiarire l'impatto dell'infezione sullo sviluppo e sulla funzione del cervello. Qui vengono fornite linee guida generali e una procedura per produrre una prole resiliente e suscettibile esposta a MIA.

L'attivazione immunitaria materna (MIA) durante la gravidanza è costantemente legata ad un aumentato rischio di disturbi dello sviluppo neurologico e neuropsichiatrico nella prole. I modelli animali di MIA sono utilizzati per testare la causalità, studiare i meccanismi e sviluppare diagnostica e trattamenti per questi disturbi. Nonostante il loro uso diffuso, molti modelli di MIA soffrono di una mancanza di riproducibilità e quasi tutti ignorano due aspetti importanti di questo fattore di rischio: (i) molti figli sono resilienti al MIA e (ii) la prole suscettibile può mostrare combinazioni distinte di fenotipi. Per aumentare la riproducibilità e modellare sia la suscettibilità che la resilienza alla MIA, l'immunoreattività basale (BIR) dei topi femmina prima della gravidanza viene utilizzata per prevedere quali gravidanze si tradurranno in prole resiliente o prole con anomalie comportamentali e molecolari definite dopo l'esposizione a MIA. Qui, viene fornito un metodo dettagliato per indurre MIA tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) del poli(I:C) mimica virale a doppio filamento (dsRNA) a 12,5 giorni di gestazione. Questo metodo induce una risposta infiammatoria acuta nella madre, che si traduce in perturbazioni nello sviluppo del cervello nei topi che mappano domini influenzati in modo simile nei disturbi psichiatrici e dello sviluppo neurologico umano (NDD).

L'evidenza epidemiologica collega l'infezione materna ad un aumentato rischio di malattie psichiatriche e NDD, tra cui la schizofrenia (SZ) e il disturbo dello spettro autistico (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Il modello murino MIA è stato sviluppato per testare la causalità e il ruolo meccanicistico del MIA nell'eziologia di questi disturbi, nonché per identificare biomarcatori molecolari e^{sviluppare strumenti} diagnostici e terapeutici ^4,6. Nonostante l'utilità di questo modello e la sua crescente popolarità, vi è una notevole variabilità nei protocolli di induzione MIA all'interno del campo, rendendo difficile confrontare i risultati tra gli studi e replicare i risultati ^8,9. Inoltre, la maggior parte delle iterazioni del modello non indaga due importanti aspetti traslazionali della MIA: (i) molti discendenti sono resilienti al MIA, e (ii) la prole suscettibile può mostrare combinazioni distinte di fenotipi⁸.

Per generare un modello MIA riproducibile, i ricercatori dovrebbero riportare almeno una misura quantitativa dell'entità del MIA indotto nelle dighe. Per indurre MIA durante la gestazione, il nostro laboratorio esegue iniezioni intraperitoneali (i.p.) del poliinositico mimica virale dell'RNA a doppio filamento: acido policitidilico [poli(I:C)]. Il poli(I:C) induce una cascata immunitaria simile ai virus influenzali in quanto riconosciuto dal recettore toll-like 3 (TLR3)¹⁰. Di conseguenza, il poli (I: C) attiva la risposta di fase acuta che si traduce in un rapido aumento delle citochine proinfiammatorie 8,11,12. Studi precedenti hanno dimostrato che l'elevazione delle citochine proinfiammatorie, inclusa l'interleuchina-6 (IL-6), è necessaria per produrre anomalie comportamentali e neuropatologia nella prole a seguito di MIA^11,12,13. Pertanto, il livello di IL-6 nel siero materno raccolto durante il suo picco a 2,5 ore dopo l'iniezione di poli (I: C) è una misura quantitativa convincente di MIA che può essere utilizzata per confrontare i risultati tra i laboratori all'interno del campo.

Al fine di generare un modello MIA che affronti gli elementi traslazionalmente essenziali di resilienza e suscettibilità con un singolo protocollo di induzione ^8,14, i ricercatori possono combinare approcci tipici di induzione con la caratterizzazione dell'immunoreattività basale (BIR) della madre prima della gravidanza⁸. Recentemente, è stato scoperto che topi C57BL / 6 femmine vergini mostrano una vasta gamma di risposte IL-6 a un'esposizione a basse dosi di poli (I: C) prima della gravidanza⁸. È solo un sottogruppo di queste femmine che continua a produrre prole suscettibile, e solo a certe grandezze di attivazione immunitaria come dettato dalla combinazione di BIR e poli (I: C) dose⁸. La MIA induce fenotipi in un pattern a U invertito; La prole mostra le maggiori aberrazioni comportamentali e molecolari quando le madri sono moderatamente immunoreattive e l'entità dell'infiammazione materna raggiunge, ma non supera, un intervallo critico⁸. Qui, viene fornito un metodo dettagliato su come creare in modo affidabile sia la prole resiliente che suscettibile con fenotipi comportamentali divergenti a seguito dell'iniezione gestazionale di poli (I: C).

Tutti i protocolli sono eseguiti sotto l'approvazione dell'Università della California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione degli animali

1. Quando si acquisiscono animali, mantenere coerenti i seguenti parametri per garantire la massima riproducibilità.
   1. Fornitore e posizione del fornitore: come riportato in precedenza, i topi selvatici C57BL / 6J mostrano risposte diverse alla stessa dose di poli (I: C) a seconda del fornitore⁸. Scegli un fornitore e un ceppo di mouse che mostrino una risposta coerente. Per gli esperimenti qui, i topi C57BL / 6 ottenuti da Charles River hanno mostrato cambiamenti coerenti nel comportamento dopo l'esposizione a MIA a metà gestazione, mentre quelli acquistati da Taconic mostrano una risposta di magnitudo maggiore, con alcune differenze tra i gruppi di trattamento rispetto ai topi Charles River⁸.
   2. Ceppo: i topi C57BL / 6J sono i più comunemente utilizzati, ma i topi BTBR e altri ceppi mostrano risposte differenziali al MIA⁹ a metà gestazione. Si noti queste risposte differenziali, in quanto migliorano la riproducibilità del metodo e possono essere una potenziale variabile nel contribuire agli esiti differenziali nella prole.
   3. Per garantire una variabilità minima, utilizzare solo femmine vergini per gli studi MIA⁸ e annotare chiaramente i dettagli nei metodi.
   4. Età al momento della spedizione e periodo di acclimatazione: i topi spediti prima delle 7 settimane mostrano sistemi endocrini disregolati¹⁵. Permettere agli animali di acclimatarsi per un minimo di 48 h^16,17. Ordinare i topi da spedire a 7 settimane (± 2 giorni) e iniettare per BIR a 8 settimane (± 2 giorni).
   5. Età all'accoppiamento: il sistema immunitario degli animali è dinamico nel corso della loro vita. Fare attenzione a ridurre al minimo la variabilità mantenendo l'età all'accoppiamento/iniezione il più coerente possibile^18,19,20. Mate femmine di topi a 9 settimane (± 2 giorni). Non usare maschi di età superiore ai 6 mesi per l'accoppiamento.

2. Test e preparazione del lotto di poli (I: C)

1. Preparare poli ad alto peso molecolare (I:C) come descritto di seguito.
   1. Tubi da microcentrifuga da 1,5 mL per autoclave per lo stoccaggio. Il poli(I:C) risospeso può essere conservato a -20 °C, ma ripetuti disgeli congelati possono influire sulla potenza. Riscaldare il bagno d'acqua a 70 °C.
   2. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere 10 ml di soluzione fisiologica sterile (NaCl 0,9%) al poli(I:C) liofilizzato utilizzando una siringa. Riscaldare a bagnomaria a 70 °C per 15 minuti per consentire la piena ricottura. Rimuovere e lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
   3. In una cappa sterile, aggiungere altri 40 ml di soluzione salina fisiologica al flacone e capovolgere più volte per mescolare. Rimuovere la parte superiore del flacone di poli (I:C) o utilizzare una siringa per aliquote in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Conservare a -20 °C.
2. Preparare poli(I:C) a peso molecolare misto come descritto di seguito.
   1. Tubi da microcentrifuga da 1,5 mL per autoclave per lo stoccaggio. Il poli(I:C) risospeso può essere conservato a -20 °C, ma ripetuti disgeli congelati possono influire sulla potenza. Impostare il bagnomaria a 50 °C.
   2. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere 10 ml di NaCl sterile allo 0,9% al poli(I:C) liofilizzato e fissare il coperchio. Riscaldare a bagnomaria a 50 °C per 25 minuti per consentire la piena ricottura. Rimuovere e lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
   3. Con tecnica sterile, aliquote in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -20 °C.
3. Somministrare poli(I:C) attraverso iniezioni intraperitoneali (i.p.) come descritto di seguito.
   1. Pesare il mouse per determinare il dosaggio accurato. Utilizzando un ago da insulina da 0,5 cc, disegnare poli (I: C) risospeso. Collottola e capovolgere in modo che l'addome sia esposto.
   2. Usando l'altra mano, inserire l'ago ad una profondità di circa 0,5 cm tra i due capezzoli anteriori con un angolo di circa 45°.
   3. Prelevare per determinare che sangue o urina non entra nella siringa prima dell'iniezione. Se si verifica uno dei due casi, riposizionare l'ago e riprovare. Iniettare lentamente. Se il poli(I:C) bolle, l'iniezione era probabilmente sottocutanea. Un posizionamento corretto dell'iniezione comporterà che non venga estratto nulla una volta inserito l'ago e nessuna perdita una volta rimosso.
4. Testare la potenza del lotto di poli (I:C) MMW come descritto di seguito⁸.
   1. Ottenere la forma desiderata di poli (I: C). Alcuni produttori consentiranno ai ricercatori di bloccare un lotto completo o parziale mentre la potenza viene testata in modo che più bottiglie possano essere ottenute in seguito contemporaneamente. Tipicamente, questi possono essere conservati liofilizzati a -20 °C per diversi anni se si evita il gelo-disgelo.
   2. Ottenere o allevare 30 madri gravide per i test. A E12.5, eseguire iniezioni i.p. di 20, 30 e 40 mg / kg in un minimo di 10 topi per dose.
   3. A 2,5 ore dopo l'iniezione, raccogliere il sangue tramite sanguinamento della coda. Si noti che il sangue periferico e il sangue del tronco possono differire nei livelli di citochine, quindi mantenere il metodo di raccolta coerente all'interno di uno studio.
   4. Lasciare coagulare il sangue durante la notte a temperatura ambiente. Dopo 12-24 ore, centrifugare i campioni di sangue a 3.768 x g a 4 °C per 8 minuti. Raccogliere il siero e conservare a -80 °C fino all'analisi.
   5. Isolare il siero e misurare i livelli di IL-6 tramite ELISA o Luminex. Mantenere coerenti gli strumenti di misurazione in quanto vi è una significativa variabilità nella concentrazione totale misurata con diverse modalità e produttori. Determinare l'entità della risposta IL-6 necessaria per indurre fenotipi utilizzando una coorte pilota.

3. Test di immunoreattività al basale (BIR)

Nota : la Figura 1 mostra lo schema dei passaggi. Utilizzare un diverso peso molecolare poli (I: C) per il test BIR rispetto a gestazionale per ridurre la probabilità di risposte immunitarie adattative al composto.

1. Ordina topi femmina vergini da spedire a 7 settimane di età. All'arrivo, raggruppa e ospita da quattro a cinque topi in una gabbia e mantieni il gruppo alloggiato fino all'accoppiamento. Utilizzare la tacca auricolare o qualsiasi altro sistema di identificazione.
2. Iniettare le femmine per via intraperitoneale con 5 mg/kg di poli (I:C) 1 settimana dopo l'arrivo. A 2,5 ore dopo l'iniezione, quando l'IL-6 circolante è più alta⁶, raccogliere sangue intero dagli animali iniettati tramite tail snip.
3. Lasciare coagulare il sangue durante la notte a temperatura ambiente. Dopo 12-24 ore, centrifugare i campioni di sangue a 3.768 x g a 4 °C per 8 minuti.
4. Raccogliere un minimo di 32 μL di siero da ciascun campione. Congelare a -80 °C fino al momento di testare le citochine. Per misurare i livelli di IL-6 in modo più coerente, utilizzare un test multiplex come Luminex. Mantenere coerenti gli strumenti di misurazione in quanto vi è una significativa variabilità nella concentrazione totale misurata con diverse modalità e produttori.
   1. Per il protocollo di analisi Luminex, fare riferimento a Bruce et ^al.21.
5. Utilizzando i livelli relativi di IL-6, dividere gli animali in gruppi BIR basso (quartile inferiore), medio (due quartili centrali) e alto (quartile più alto).

4. Metodo di sanguinamento della coda per la raccolta del sangue

NOTA: Per evitare l'uso di sedativi potenzialmente immunomodulatori, utilizzare il metodo di sanguinamento della coda per la raccolta del sangue.

1. Per installare, posizionare un supporto di saldatura e una tazza di ritenuta su una superficie sul lato della mano non dominante. In una capsula di Petri da 35 mm, aggiungere 1-2 ml di olio commestibile alimentare. Rimuovere il cappuccio dal tappo di sangue rapido e posizionarlo vicino alla configurazione.
2. Posizionare alcuni strati di tovagliolo di carta sul supporto di saldatura e sul primo tubo capillare in una clip, posizionandolo vicino a dove verrà tenuta la punta della coda del mouse e tenuto parallelo alla superficie del tavolo. Avere una lama di rasoio a portata di mano.
3. Per raccogliere il sangue, eseguire i seguenti passaggi.
   1. Al momento richiesto, rimuovere il mouse dalla gabbia e posizionarlo sotto la tazza con la coda che esce dalla tacca alla base. Utilizzando una nuova lama di rasoio, tagliare l'estremità (1-2 mm) della coda e raccogliere la prima goccia di sangue nel tubo capillare agganciato al supporto di saldatura.
   2. Immergere le dita della mano dominante nell'olio commestibile e utilizzare per spremere dalla base della coda alla punta, guidando la punta della coda al tubo capillare per raccogliere le gocce di sangue risultanti. Continuare fino a ~200 μL di sangue è stato raccolto.
   3. Mettere un piccolo tappo terminale sull'estremità affusolata del tubo capillare prima del tappo superiore. Se il tappo superiore viene applicato per primo, il campione verrà espulso dall'estremità affusolata del tubo. Mettere il tubo nel guscio esterno protettivo.
   4. Lasciare coagulare per una notte a temperatura ambiente. Raffreddare una microcentrifuga a 4 °C e centrifugare il sangue come indicato al punto 3.3.

Figura 1. La tempistica per testare l'immunoreattività e l'accoppiamento di base delle femmine vergini. Ordina ai topi di arrivare a 7 settimane e consentire di acclimatarsi alla struttura per 1 settimana. Iniettare agli animali 5 mg/kg di poli (I:C) e 2,5 ore dopo prelevare il sangue. Lasciare coagulare il sangue durante la notte, quindi centrifugare a 3.768 x g, 4 °C per 8 minuti. Raccogliere il siero e valutare i livelli relativi di IL-6 tramite ELISA o Multiplex. A 9 settimane, imposta coppie di accoppiamento. Creato utilizzando BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Metodo basato sul peso per l'accoppiamento e l'iniezione gestazionale di E12.5

Nota : la Figura 2 mostra lo schema dei passaggi. È possibile utilizzare due metodi per impostare coppie di accoppiamento e determinare il punto temporale E12.5. Il primo, l'accoppiamento a tempo, è descritto altrove²². I calcoli basati sul peso possono anche essere utilizzati per valutare una gravidanza E12.5²³. Il vantaggio di questo approccio è che consente il blocco temporale dell'età della diga all'accoppiamento, diminuendo la variabilità della risposta immunitaria. Questa procedura viene utilizzata qui.

1. Metti i maschi in gabbie pulite e lascia che si acclimatino per un minimo di 2 ore. Ciò diminuisce la probabilità di aggressione femminile poiché i maschi formeranno già un profumo dominante nella gabbia.
2. Crea coppie riproduttive di un singolo maschio e di una singola femmina aggiungendo la femmina alla gabbia del maschio. Prima di metterla nella gabbia, pesarla e registrare il peso. Aggiungi una piccola manciata di semi di girasole a ciascuna gabbia per aumentare l'efficienza dell'accoppiamento.
3. Per determinare l'intervallo di aumento di peso, attenersi alla seguente procedura.
   1. Ottieni un gruppo di prova di femmine e imposta coppie di accoppiamento, registrando il peso al momento dell'accoppiamento.
   2. Quando le femmine iniziano ad apparire visibilmente incinte, pesarle e dividerle in sottogruppi di 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g e 11,5 g di peso guadagnato. I feti a E12.5 hanno appena iniziato a sviluppare cifre distinte nelle loro zampe. Utilizzare la morfologia fetale per determinare l'aumento di peso medio per raggiungere E12.5.
4. A 12 giorni dopo l'accoppiamento, pesare le femmine e determinare l'aumento di peso. In una struttura di prova, le femmine guadagnano costantemente 9,5-10,5 g dal momento dell'accoppiamento a E12,5. Iniettare tramite i.p. la dose di poli(I:C) solubilizzato determinata al punto 2.3.2 quando l'aumento di peso della femmina rientra nell'intervallo predeterminato.
5. Osservare la risposta al MIA nelle dighe utilizzando i seguenti parametri.
   1. Comportamento di malattia: raccogliere punteggi soggettivi su una scala da 1 a 3 per come le dighe diventano attive in risposta all'essere gestite, dove 1 è poco o nessun movimento in risposta all'essere maneggiato e 3 è una risposta normale alla cattura e alla contenzione. Gli animali con maggiori risposte immunitarie mostreranno meno resistenza alla manipolazione⁸.
   2. Risposta febbrile: utilizzando un termometro IR, raccogliere le temperature pre-iniezione e 2,5 ore dopo l'iniezione. Gli animali con risposte immunitarie di maggiore entità spesso mostrano ipotermia in risposta a una maggiore attività immunitaria⁸.
   3. Variazione di peso: pesare gli animali a 24 ore dopo l'iniezione. Gli animali con risposte immunitarie di maggiore entità generalmente perdono più peso⁸.
   4. Misurare i livelli gestazionali di IL-6 come segue⁸.
      1. A 2,5 ore dopo l'iniezione, raccogliere il sangue con il metodo preferito. Lasciare coagulare il sangue durante la notte a temperatura ambiente. Dopo 12-24 ore, centrifugare i campioni di sangue a 3.768 x g a 4 °C per 8 minuti.
      2. Raccogliere il siero e conservare a -80 °C fino all'analisi. Isolare il siero e misurare i livelli di IL-6 tramite ELISA o Luminex. Mantenere coerenti gli strumenti di misurazione in quanto vi è una significativa variabilità nella concentrazione totale misurata con diverse modalità e produttori.
      3. Ospitare singolarmente la diga dopo l'iniezione con un arricchimento appropriato come nidi e dispositivi di arricchimento. Mantenere tutto l'arricchimento coerente in quanto le alterazioni nell'arricchimento possono avere impatti significativi sul comportamento dei roditori 24,25,26,27,28,29.
6. Il tempo di gestazione per i topi C57 varia da 18,5 a 20,5 giorni. Eseguire controlli della lettiera per determinare se gli animali sono nati all'interno di questo intervallo per garantire che l'iniezione sia stata eseguita nel momento corretto. Quando si controlla la presenza di cucciolate, disturbare la gabbia il meno possibile. Lo stress immediatamente dopo la nascita della cucciolata può aumentare il rischio di cannibalizzazione.

Figura 2. Induzione MIA. L'induzione MIA richiede la valutazione della gravidanza, l'iniezione i.p. di poli (I: C) e controlli della cucciolata per garantire la corretta tempistica dell'infiammazione materna. Dopo aver valutato il giorno gestazionale tramite accoppiamento temporizzato o il metodo di aumento di peso, somministrare un'iniezione i.p. di poli (I: C) a E12.5. Raccogliere un campione di sangue a 2,5 ore dopo l'iniezione per confermare l'attivazione immunitaria e determinare il livello di attivazione di IL-6. Le cucciolate nasceranno approssimativamente a E18.5-E20.5. Creato utilizzando BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

6. Studio delle alterazioni nel comportamento nella MIA adulta e nella prole di controllo (opzionale)

1. A partire da P60 e prima di condurre test comportamentali, acclimatare gli animali al contatto umano con una manipolazione delicata per 1 minuto al giorno per 3 giorni consecutivi. Assicurati che i giorni di cambio della gabbia non si verifichino lo stesso giorno in cui vengono eseguiti i test comportamentali.
2. Consentire sempre ai topi di acclimatarsi alla sala test per 30-60 minuti prima di iniziare i test comportamentali. Utilizzare camere scarsamente illuminate (15-20 lux) per ridurre al minimo l'ansia.
3. Per la toelettatura ripetitiva, metti i topi da soli in gabbie pulite e prive di biancheria da letto con coperchi. Utilizzando una fotocamera, registrare i topi in queste gabbie per 20 minuti. I primi 10 minuti funzionano come periodo di acclimatazione, gli ultimi 10 minuti sono il periodo di prova.
4. Utilizzando i video salvati e un cronometro, calcola il tempo di toelettatura cumulativo per ciascun mouse durante il periodo di test di 10 minuti. Altri comportamenti che possono essere valutati da questi video includono l'allevamento (in piedi sulle zampe posteriori), il congelamento e il salto⁸.
5. Utilizzare altri test comuni per il modello MIA come l'inibizione prepulsuale (PPI) 14,30,31,32, campo aperto^12,33,34, approccio sociale a 3 camere 13,35,36, riconoscimento di nuovi oggetti³⁷, y-maze^30, elevato più labirinto³³ e condizionamento della paura del contesto / cued ³⁸.
6. Immunoblotting postnatale⁸ (opzionale)
   1. A P0, decapitare rapidamente e sezionare il tessuto cerebrale fetale in HBSS, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.
   2. Interrompere i campioni utilizzando un sonicatore a sonda con un'ampiezza del 20% per 5 s in 2x tampone Laemmli, quindi denaturare a 85 °C per 5 minuti. Lisato di centrifuga a 16.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e conservare a -80 °C.
   3. Misurare il contenuto proteico totale utilizzando un kit commerciale di dosaggio delle proteine BCA, seguendo le istruzioni del produttore, e utilizzare l'albumina sierica bovina come standard di calibrazione.
   4. Aggiungere ditiotreitolo come agente riducente ai campioni come concentrazione finale di 100 mM. Riscaldare a 85 °C per 2 minuti prima di caricare su un gel.
   5. Eseguire 5 μg/corsia di proteine in condizioni riducenti su gel TGS al 7,5% e trasferire elettroforeticamente su membrane PVDF. Bloccare le membrane con tampone bloccante e incubare con anticorpi scelti.
   6. Lavare tre volte con TBS + 0,05% Tween 20 e incubare le membrane per 45 minuti con anticorpi secondari marcati con fluorescenza.
   7. Lavare altre quattro volte in TBS/Tween 20 e ottenere risultati dell'immagine. Standardizzare i risultati utilizzando β-tubulina, rilevata utilizzando anti-β-tubulina.

Non tutti gli animali esposti a 30 mg/kg di poli (I:C) a E12.5 producono prole con anomalie comportamentali costanti ^8,31. Sebbene sia 30 mg / kg che 40 mg / kg di poli (I: C) producano in modo affidabile comportamenti di malattia nelle dighe, tra cui diminuzione dei livelli di attività, risposte ipotermiche e perdita di peso, e causino anche aumenti significativi di IL-6, solo un sottogruppo di cucciolate esposte a MIA continuerà a sviluppare anomalie comportamentali in domini simili a quelli osservati nella psichiatria umana e nelle NDD (Figura 3A-C)⁸ . Una dose più bassa di 20 mg / kg di poli (I: C) induce anche il comportamento di malattia e la perdita di peso, ma in contrasto con dosi più elevate non produce costantemente risposte IL-6 abbastanza elevate in grandezza da indurre aberrazioni comportamentali nella prole, anche se le risposte IL-6 sono elevate ben al di sopra di quelle delle madri iniettate con soluzione salina (Figura 3D) ⁸.

Figura 3. Diverse dosi di poli (I: C) portano a effetti differenziali nelle dighe. (A) Le dighe esposte a 20 mg/kg, 30 mg/kg o 40 mg/kg di poli(I:C) hanno sperimentato una diminuzione dell'attività su scala soggettiva (ANOVA unidirezionale; P < 0,0001). (B) Le dighe esposte solo a 30 mg/kg di poli (I:C) hanno mostrato una temperatura significativamente alterata sotto forma di una risposta ipotermica (ANOVA unidirezionale; F3,35 = 4,289, P < 0,05). (C) Sia 30 mg/kg di poli (I:C) che 40 mg/kg di poli (I:C) hanno indotto una significativa perdita di peso (ANOVA unidirezionale; F7.187 = 26,93, P < 0,0001) e (D) hanno mostrato livelli elevati di IL-6 al di sopra della soglia richiesta per indurre alterazioni comportamentali (ANOVA unidirezionale; F3,35 = 25,54, P < 0,0001). (E) L'immunoreattività basale negli animali femmina isogenica C57BL / 6J è altamente variabile e la classificazione delle femmine BIR in gruppi bassi, medi e alti consente ai ricercatori di prevedere quale prole ha maggiori probabilità di essere suscettibile all'impatto della MIA. Le barre rappresentano la media ± SEM. Questa cifra è stata modificata da Estes et ^al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Inaspettatamente, topi C57BL/6 femmine vergini mostrano immunoreattività basale (BIR) abbastanza variabile a una bassa dose di poli (I: C) (5 mg / kg di poli (I: C)) prima della gravidanza anche se sono isogeni, e questa variabilità non è associata al peso (Figura 3E, Figura supplementare 1) ⁸. Le madri iniettate con 5 mg/kg di poli(I:C) prima della gravidanza le cui risposte IL-6 sono nel 50% medio (madri BIR medie) producono prole maschile adulta con alterazioni dei livelli di proteina STAT3, MEF2 e tirosina idrossilasi nel tessuto striatale P0 (Figura 4C-E)⁸. Anche i figli maschi di madri BIR medie esposte a 30 mg/kg di poli (I:C) mostrano una diminuzione della densità delle sinapsi e un elevato complesso maggiore di istocompatibilità I (MHCI) in coltura neuronale dissociata (Figura 4A,B)⁸. Le madri iniettate con 5 mg / kg di poli (I: C) prima della gravidanza le cui risposte IL-6 sono nel mezzo 50% (madri BIR medie) producono in modo affidabile prole maschio adulto con comportamenti ripetitivi elevati e ridotto comportamento esplorativo quando esposti a 30 mg / kg di poli (I: C) a E12.5 (Figura 5A-F) ⁸.

Al contrario, i topi del gruppo BIR elevato (con livelli di IL-6 nel 25% superiore quando esposti a 5 mg / kg di poli (I: C) prima della gravidanza) producono in modo affidabile prole senza cambiamenti di comportamento ripetitivi dopo MIA. Tuttavia, i figli maschi di queste dighe ad alto BIR mostrano un comportamento esplorativo elevato dopo MIA (Figura 5D)⁸. Insieme, questi risultati indicano che il MIA può causare esiti differenziali nella prole, a seconda del BIR⁸ della diga.

Figura 4. Una dose intermedia di poli (I: C) e BIR porta ai maggiori risultati nei modelli MIA. (A) I neuroni corticali della prole esposti all'attivazione immunitaria materna a metà gestazionale hanno mostrato un aumento significativo della presentazione di MHCI solo quando alle madri sono stati somministrati 30 mg / kg di poli (I: C) (ANOVA unidirezionale; F3,19 = 5,156, P < 0,01). (B) Al contrario, tutti i dosaggi (20 mg/kg, 30 mg/kg e 40 mg/kg) hanno determinato una significativa diminuzione della densità delle sinapsi nella coltura neuronale dissociata (ANOVA unidirezionale; F3,43 = 11,01, P < 0,0001). (C-E) Le macchie occidentali striatali P0 mostrano STAT3, MEF2A e TH elevati, solo negli animali le cui madri avevano BIR medi ed erano esposte a 30 mg/kg di poli (I:C) (Anova unidirezionale; MEF2A: F3,24 = 3,968, P < 0,05; STAT3: F3,24 = 6.401, P < 0.01; TH: F3,24 = 3,668, P < 0,05). Le barre rappresentano la media ± SEM. Questa cifra è stata modificata da Estes et ^al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli animali sensibili nei gruppi BIR 30 mg/kg medio e BIR 30 mg/kg elevato possono essere confrontati non solo con i controlli, ma anche con gli animali resilienti. L'iniezione di dighe BIR medie con una dose ancora più elevata di 40 mg/kg di poli (I:C) produce prole senza alterazioni significative nel comportamento identificate utilizzando i saggi impiegati fino ad oggi (Figura 5A-F)⁸. Ciò suggerisce una relazione U invertita tra attivazione immunitaria e suscettibilità alla MIA.

Figura 5. I figli maschi di madri esposte a una dose intermedia di poli (I: C) mostrano le maggiori alterazioni nel comportamento. (A-F) Progenie maschile da madri esposte a 30 mg/kg di poli(I:C) (Anova unidirezionale nidificato; F3,27 = 8,775; Bassa: P = 0,0427; Medio: P = 0,0062; Alto: (P = 0,9568) ma non 20 mg / kg o 40 mg / kg di poli (I: C) mostrano alterazioni nel comportamento ripetitivo di toelettatura e di allevamento esplorativo. Inoltre, gli animali nel gruppo di trattamento con 30 mg/kg di poli (I: C) mostrano forme disparate di suscettibilità, e la prole maschile di madri BIR medie mostra un aumento del comportamento ripetitivo e una diminuzione dell'esplorazione, mentre la prole maschile di madri BIR elevate non mostra alcuna alterazione nel comportamento ripetitivo, ma ha avuto un aumento del comportamento esplorativo (A,D ; Anova unidirezionale nidificato; F3,15 = 9,407, basso: P = 0,4910; Medio: P < 0,001; Alto: P = 0,0117). La prole esposta a 20 mg/kg di poli (I:C) non sembrava raggiungere la soglia di attivazione immunitaria richiesta per alterare lo sviluppo neuronale poiché non mostrava alterazioni nei comportamenti testati, mentre la prole esposta a 40 mg/kg di poli (I: C) era anche per lo più resistente ai suoi effetti (B, C, E, F). Le barre rappresentano la media ± SEM. Questa cifra è stata modificata da Estes et ^al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1. L'immunoreattività basale non è correlata al peso animale. I topi femmina vergini mostrano una vasta gamma di risposte IL-6 a 5 mg / kg di poli (I: C) iniettati prima della gravidanza in modo indipendente dal peso, R² = 0,0086, P = 0,9. Clicca qui per scaricare questo file.

L'infezione materna altera il corso dello sviluppo cerebrale nell'uomo e sia nei roditori che nei primati non umani ^4,5,7. Qui, viene delineata una procedura per indurre MIA nei topi a metà gestazione usando poli (I: C). Questo metodo incorpora la valutazione del BIR prima della gravidanza, che aumenta la riproducibilità e offre la possibilità di studiare meccanicamente i meccanismi che portano alla resilienza e alla suscettibilità della prole al MIA⁸. Dopo MIA, le madri del gruppo BIR medio (con livelli di IL-6 nel 50% medio) generano in modo affidabile prole adulta con alterazioni nei comportamenti ripetitivi, alterazioni nei livelli di MHCI sui neuroni della prole neonatale come determinato dall'immunocitochimica e livelli elevati di tirosina idrossilasi striatale, MEF2 e proteina STAT3 dalla prole neonatale come determinato da Western blot⁸.

L'uso del MIA come modello ambientale conferisce una maggiore rilevanza traslazionale in quanto soddisfa i criteri per un modello di malattia: costruzione, faccia e validità predittiva⁷. Tuttavia, come per qualsiasi modello ambientale, è necessario prestare molta attenzione a ridurre al minimo le variabili esterne. Molti fattori come il fornitore, il lotto di poli (I: C), i tempi di iniezione, l'età delle dighe e persino il sistema di ingabbiamento possono alterare l'impatto del MIA sulla prole ^8,9,39. Come riportato in precedenza, la potenza del poli (I: C) è incoerente tra produttori, lotti e persino bottiglie all'interno di un lotto a causa dell'elevata variabilità delle concentrazioni di dsRNA e dei pesi molecolari ^8,40. Poiché questa variabilità può aumentare l'eterogeneità nella risposta immunitaria materna, è fondamentale che i laboratori determinino la dose efficace per ciascun lotto per mantenere la massima riproducibilità nei fenotipi osservabili. Ad esempio, è stato notato che i topi Charles River esposti a MIA producono fenotipi BIR e dose-dipendenti coerenti nella prole, e anche i topi di Taconic possono essere influenzati in modo simile con alcune differenze tra i gruppi di trattamento⁸. Inoltre, è fondamentale che i ricercatori standardizzino le pratiche di allevamento e tengano registri dettagliati per aumentare la riproducibilità del modello. La pubblicazione scritta da Kentner et al. ha delineato i molti dettagli che dovrebbero essere inclusi nei rapporti sperimentali e può anche funzionare come una lista di controllo per i ricercatori mentre finalizzano i loro protocolli⁹.

BIR viene valutato utilizzando i livelli sierici relativi di interleuchina-6 (IL-6) di topi femmine vergini. Dividendo questi topi in tre gruppi (basso, medio e alto) si rivelano modelli resilienti e suscettibili riproducibili⁸. Poiché la BIR è una questione di concentrazione relativa di IL-6, non è fondamentale testare rigorosamente la potenza poli(I:C) ad alto peso molecolare come è necessario con il poli(I:C) a peso molecolare misto utilizzato per indurre l'attivazione immunitaria materna durante la gestazione. BIR è una misura relativamente nuova che potrebbe non ridurre tutti i risultati variabili.

Le risposte immunitarie delle madri durante la loro prima esposizione a dosi gestazionali di poli (I: C) possono differire dalla loro risposta durante le gravidanze e le esposizioni successive. A tal fine, l'uso di femmine vergini riduce il potenziale di variabilità che potrebbero presentare alterazioni nella risposta immunitaria derivanti da gravidanze multiple. Il metodo basato sul peso della stima del punto temporale della gravidanza è necessario perché i topi spesso non rimangono incinta entro le prime 24 ore dall'accoppiamento.

È importante notare che ci sono sfide statistiche con questo modello. Poiché la MIA è indotta nelle dighe, la prole non può essere randomizzata nelle condizioni di trattamento. Pertanto, ogni cucciolata deve essere considerata un n di 1 9,41,42 e gli individui all'interno di quella cucciolata dovrebbero essere mediati per creare ciascun punto dati. Il disegno statistico più appropriato per questi dati utilizza quindi analisi nidificate⁸. È necessario un minimo di sei cucciolate per gruppo (BIR x dose) per rilevare in modo affidabile le alterazioni nelle misure comportamentali e molecolari. Differenze sessuali significative sono state ampiamente notate nella letteratura MIA, e quindi i sessi non dovrebbero mai essere raggruppati nelle analisi 8,9,43,44.

BIR è uno strumento predittivo relativamente nuovo e deve ancora essere definito in termini di impatto meccanicistico. Non è noto se BIR sia associato a specifiche risposte immunitarie gestazionali, tuttavia la risposta IL-6 dei topi prima della gravidanza non è equivalente alla loro risposta durante la gravidanza⁸. BIR rappresenta quindi una misura predittiva correlata e sono in corso ulteriori ricerche per determinarne le origini.

Nonostante la variabilità inerente al modello MIA, nessun altro modello ambientale di disturbi neuropsichiatrici e NDD fino ad oggi può fornire lo stesso livello di rilevanza traslazionale. La preparazione e test pilota approfonditi sono necessari per produrre coerenza nel modello MIA, ma la robustezza dei risultati fenotipici compensa questo investimento iniziale. In definitiva, i modelli animali MIA offrono un potenziale senza precedenti per studiare un singolo fattore di rischio che crea cluster divergenti e distinti di alterazioni comportamentali e molecolari nella prole, simili a quelli osservati nelle popolazioni umane.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamo la dott.ssa Myka Estes per la sua persistenza nell'affrontare la variabilità nel modello MIA murino e tutti i contributori in Estes et ^al.8 per il loro lavoro che ha portato allo sviluppo del protocollo dei metodi qui descritti. La ricerca qui riportata è stata supportata da NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) e NIMH T32MH112507 (K.P.).