יצירת מודל ניתן לשחזור של הפעלה חיסונית אימהית באמצע ההריון באמצעות Poly(I:C) לחקר רגישות וחוסן בצאצאים

זיהום אימהי הוא גורם סיכון להפרעות נוירו-התפתחותיות. מודלים עכבריים של הפעלת מערכת החיסון האימהית (MIA) עשויים להבהיר את השפעת הזיהום על התפתחות המוח ותפקודו. כאן, הנחיות כלליות ונוהל ניתנים כדי לייצר צאצאים עמידים ורגישים באופן אמין שנחשפו ל- MIA.

הפעלה חיסונית אימהית (MIA) במהלך ההריון קשורה באופן עקבי לסיכון מוגבר להפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירופסיכיאטריות בצאצאים. מודלים של MIA בבעלי חיים משמשים לבדיקת סיבתיות, חקירת מנגנונים ופיתוח אבחון וטיפולים להפרעות אלה. למרות השימוש הנרחב בהם, מודלים רבים של MIA סובלים מחוסר יכולת שחזור וכמעט כולם מתעלמים משני היבטים חשובים של גורם סיכון זה: (i) צאצאים רבים עמידים בפני MIA, ו-(ii) צאצאים רגישים יכולים להציג שילובים שונים של פנוטיפים. כדי להגביר את יכולת הרבייה ולדגמן הן את הרגישות והן את החוסן ל-MIA, משתמשים בתגובתיות החיסונית הבסיסית (BIR) של נקבות עכברות לפני ההריון כדי לחזות אילו הריונות יובילו לצאצאים עמידים או צאצאים עם הפרעות התנהגותיות ומולקולריות מוגדרות לאחר חשיפה ל-MIA. כאן, שיטה מפורטת של השראת MIA באמצעות הזרקה intraperitoneal (i.p.) של RNA דו גדילי (dsRNA) נגיפי מחקה poly(I:C) ב 12.5 ימים של הריון מסופק. שיטה זו גורמת לתגובה דלקתית חריפה בסכר, הגורמת להפרעות בהתפתחות המוח בעכברים הממפות תחומים בעלי השפעה דומה בהפרעות פסיכיאטריות ונוירו-התפתחותיות בבני אדם (NDDs).

ראיות אפידמיולוגיות קושרות זיהום אימהי לסיכון מוגבר למחלות פסיכיאטריות ומחלות NDD, כולל סכיזופרניה (SZ) והפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD)1,2,3,4,5,6,7. מודל עכברי MIA פותח כדי לבחון סיבתיות ואת התפקיד המכניסטי של MIA באטיולוגיה של הפרעות אלה, כמו גם לזהות סמנים ביולוגיים מולקולריים ולפתח כלים אבחוניים וטיפוליים ^4,6. למרות התועלת של מודל זה והפופולריות הגוברת שלו, קיימת שונות רבה בפרוטוקולי האינדוקציה של MIA בתחום, מה שמקשה על השוואת תוצאות בין מחקרים ושכפול ממצאים ^8,9. בנוסף, רוב האיטרציות של המודל אינן חוקרות שני היבטים תרגומיים חשובים של MIA: (i) צאצאים רבים עמידים בפני MIA, ו-(ii) צאצאים רגישים יכולים להציג שילובים ברורים של פנוטיפים⁸.

כדי ליצור מודל MIA הניתן לשחזור, החוקרים צריכים לדווח לפחות על מדד כמותי אחד של גודל MIA המושרה בסכרים. כדי לגרום ל-MIA במהלך ההיריון, המעבדה שלנו מבצעת זריקות תוך-פריטוניאליות (כלומר) של ה-RNA הדו-גדילי המחקה פוליאינוסיטי: חומצה פוליציטידילית [poly(I:C)]. Poly(I:C) משרה מפל חיסוני הדומה לנגיפי שפעת כפי שהוא מוכר על ידי קולטן דמוי אגרה 3 (TLR3)¹⁰. כתוצאה מכך, poly(I:C) מפעיל את תגובת השלב החריפה שגורמת לעלייה מהירה של ציטוקינים מעודדי דלקת 8,11,12. מחקרים קודמים הראו כי עלייה של ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל אינטרלוקין-6 (IL-6), נחוצה כדי לייצר הפרעות התנהגותיות ונוירופתולוגיה בצאצאים כתוצאה מ-MIA^11,12,13. לפיכך, רמת IL-6 בסרום האימהי שנאספה בשיאה ב-2.5 שעות לאחר הזרקת פולי(I:C) היא מדד כמותי משכנע של MIA שניתן להשתמש בו כדי להשוות תוצאות בין מעבדות בתחום.

על מנת ליצור מודל MIA המתייחס למרכיבים החיוניים מבחינה תרגומית של חוסן ורגישות עם פרוטוקול אינדוקציה יחיד ^8,14, חוקרים יכולים לשלב גישות אינדוקציה טיפוסיות עם אפיון של תגובתיות חיסונית בסיסית של הסכר (BIR) לפני הריון⁸. לאחרונה, התגלה כי נקבות בתוליות C57BL/6 עכברות מראות מגוון רחב של תגובות IL-6 לחשיפה במינון נמוך לפולי(I:C) לפני הריון⁸. רק תת-קבוצה של נקבות אלה ממשיכה לייצר צאצאים רגישים, ורק בסדרי גודל מסוימים של הפעלת מערכת החיסון כפי שמוכתב על ידי השילוב של BIR ומינון פולי(I:C)⁸. MIA משרה פנוטיפים בתבנית U הפוכה; צאצאים מראים את הסטיות ההתנהגותיות והמולקולריות הגדולות ביותר כאשר הסכרים הם תגובתיים חיסוניים במידה בינונית, ועוצמת הדלקת האימהית מגיעה, אך אינה עולה, לטווח קריטי⁸. כאן, שיטה מפורטת כיצד ליצור באופן אמין הן צאצאים גמישים רגישים עם פנוטיפים התנהגותיים שונים כתוצאה של הזרקה באמצע ההריון של poly(I:C) מסופק.

כל הפרוטוקולים מבוצעים באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה-דייוויס (IACUC).

1. הכנת בעלי חיים

1. בעת רכישת בעלי חיים, שמור על עקביות הפרמטרים הבאים כדי להבטיח רבייה מקסימלית.
   1. מיקום ספק וספק: כפי שדווח בעבר, עכברי בר מסוג C57BL/6J מציגים תגובות שונות לאותו מינון של poly(I:C) בהתאם לספק⁸. בחר ספק ומתח עכבר המציגים תגובה עקבית. עבור הניסויים כאן, עכברי C57BL/6 שהתקבלו מנהר צ'ארלס הראו שינויים עקביים בהתנהגות לאחר חשיפה ל- MIA באמצע ההריון, בעוד שאלו שנרכשו מטאקוניק הראו תגובת גודל גדולה יותר, עם הבדלים מסוימים בין קבוצות הטיפול בהשוואה לעכברי נהר צ'ארלס⁸.
   2. זן: עכברי C57BL/6J הם הנפוצים ביותר, אך עכברי BTBR וזנים אחרים מראים תגובות דיפרנציאליות ל- MIA⁹ באמצע ההריון. שימו לב לתגובות דיפרנציאליות אלה, שכן הן מגבירות את יכולת השחזור של השיטה ויכולות להיות משתנה פוטנציאלי בתרומה לתוצאות דיפרנציאליות בצאצאים.
   3. כדי להבטיח שונות מינימלית, השתמש רק בנקבות בתולות למחקרי MIA⁸ וציין בבירור פרטים בשיטות.
   4. גיל המשלוח ותקופת ההתאקלמות: עכברים שנשלחו לפני 7 שבועות מראים מערכות אנדוקריניות לא מווסתות¹⁵. לאפשר לבעלי חיים להתאקלם במשך מינימום של 48 שעות^16,17. להזמין עכברים להישלח ב 7 שבועות (± 2 ימים) ולהזריק עבור BIR ב 8 שבועות (± 2 ימים).
   5. גיל ההזדווגות: מערכת החיסון של בעלי חיים דינמית לאורך חייהם. דאגו למזער את השונות על ידי שמירה על גיל הזדווגות / הזרקה עקבי ככל האפשר^18,19,20. להזדווג עם נקבות עכברים בגיל 9 שבועות (± יומיים). אין להשתמש בזכרים מעל גיל 6 חודשים להזדווגות.

2. בדיקות והכנת לוט Poly(I:C)

1. הכן פולי(I:C) בעל משקל מולקולרי גבוה כמתואר להלן.
   1. Autoclave 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה לאחסון. פולי מרחף (I:C) יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C, אבל הפשרות הקפאה חוזרות ונשנות יכולות להשפיע על העוצמה. אמבט מים מחממים ל 70 °C (70 °F).
   2. באמצעות טכניקה סטרילית, הוסף 10 מ"ל של מלח פיזיולוגי סטרילי (NaCl 0.9%) לפולי ליופילי (I:C) באמצעות מזרק. חממו באמבט מים בטמפרטורה של 70°C למשך 15 דקות כדי לאפשר חישול מלא. מוציאים ומניחים להתקרר לטמפרטורת החדר.
   3. במכסה מנוע סטרילי, מוסיפים 40 מ"ל נוספים של מלח פיזיולוגי לבקבוק והופכים מספר פעמים כדי לערבב. הסר את החלק העליון של בקבוק poly(I:C) או השתמש מזרק כדי aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
2. הכינו פולי(I:C) במשקל מולקולרי מעורב כמתואר להלן.
   1. Autoclave 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה לאחסון. ניתן לאחסן פולי(I:C) מרחף בטמפרטורה של -20°C, אך הפשרות חוזרות ונשנות בהקפאה עלולות להשפיע על העוצמה. הגדר אמבט מים ל 50 °C.
   2. בטכניקה סטרילית, יש להוסיף 10 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי לפולי(I:C) ולאבטח את המכסה. חממו באמבט מים בטמפרטורה של 50°C למשך 25 דקות כדי לאפשר חישול מלא. מוציאים ומניחים להתקרר לטמפרטורת החדר.
   3. באמצעות טכניקה סטרילית, aliquot לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -20 ° C.
3. מתן פולי(I:C) באמצעות זריקות intraperitoneal (i.p.) כמתואר להלן.
   1. שקול את העכבר כדי לקבוע מינון מדויק. באמצעות מחט אינסולין 0.5 סמ"ק, צייר פולי מרחף (I:C). שפשפו את העכבר והפכו כך שהבטן חשופה.
   2. בעזרת היד השנייה, מחדירים את המחט לעומק של כ-0.5 ס"מ בין שתי הפטמות הקדמיות בזווית של כ-45 מעלות.
   3. צייר כדי לקבוע כי שום דם או שתן לא נכנס מזרק לפני ההזרקה. במקרה כזה, מקם מחדש את המחט ונסה שוב. מזריקים לאט. אם הפולי(I:C) מבעבע החוצה, סביר להניח שההזרקה הייתה תת עורית. מיקום הזרקה מוצלח יגרום לכך ששום דבר לא יימשך ברגע שהמחט מוחדרת, ולא ידלוף ברגע שהיא מוסרת.
4. בדוק עוצמת לוט של MMW poly(I:C) כמתואר להלן⁸.
   1. השג את הצורה הרצויה של poly(I:C). יצרנים מסוימים יאפשרו לחוקרים להחזיק כמות מלאה או חלקית בזמן בדיקת העוצמה, כך שניתן יהיה להשיג בקבוקים מרובים מאוחר יותר בו זמנית. בדרך כלל, אלה יכולים להיות מאוחסנים lyophilized ב -20 ° C במשך מספר שנים אם הקפאה-הפשרה נמנע.
   2. להשיג או לגדל 30 סכרים בהריון לבדיקה. ב- E12.5, בצע זריקות i.p. של 20, 30 ו- 40 מ"ג / ק"ג במינימום של 10 עכברים למנה.
   3. 2.5 שעות לאחר ההזרקה, לאסוף דם באמצעות דימום הזנב. שימו לב שדם היקפי ודם תא מטען יכולים להיות שונים ברמות הציטוקינים, לכן הקפידו על עקביות שיטת האיסוף במחקר.
   4. יש לאפשר לדם להיקרש במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר 12-24 שעות, יש לסובב דגימות דם בטמפרטורה של 3,768 x גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 8 דקות. יש לאסוף את הסרום ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.
   5. בודדו את הסרום ומדדו רמות IL-6 באמצעות ELISA או Luminex. שמרו על עקביות בכלי המדידה מכיוון שיש שונות משמעותית בריכוז הכולל הנמדד עם שיטות ויצרנים שונים. לקבוע את גודל התגובה IL-6 הדרוש כדי לגרום לפנוטיפים באמצעות קבוצת פיילוט.

3. בדיקת תגובתיות חיסונית בסיסית (BIR)

הערה: איור 1 מציג את סכמת השלבים. השתמש במשקל מולקולרי שונה poly(I:C) לבדיקת BIR בהשוואה להריון כדי להפחית את הסבירות לתגובות חיסוניות נרכשות לתרכובת.

1. הזמינו נקבות עכברים בתולות שיישלחו בגיל 7 שבועות. עם ההגעה, קבצו והשכינו ארבעה עד חמישה עכברים בכלוב ושוכנו את הקבוצה עד להזדווגות. השתמש בחריץ באוזן או בכל מערכת זיהוי אחרת.
2. יש להזריק לנקבות תוך צפקית 5 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) שבוע לאחר ההגעה. ב 2.5 שעות לאחר ההזרקה, כאשר IL-6 במחזור הוא הגבוה ביותר⁶, לאסוף דם שלם מבעלי חיים מוזרקים באמצעות חיתוך זנב.
3. יש לאפשר לדם להיקרש במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר 12-24 שעות, יש לסובב דגימות דם בטמפרטורה של 3,768 x גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 8 דקות.
4. יש לאסוף לפחות 32 מיקרוליטר של סרום מכל דגימה. יש להקפיא בטמפרטורה של -80°C עד לבדיקת ציטוקינים. כדי למדוד את רמות IL-6 באופן העקבי ביותר, השתמש בבדיקת מולטיפלקס כגון Luminex. שמרו על עקביות בכלי המדידה מכיוון שיש שונות משמעותית בריכוז הכולל הנמדד עם שיטות ויצרנים שונים.
   1. עבור פרוטוקול בדיקת Luminex, עיין ברוס ואחרים ²¹.
5. באמצעות רמות IL-6 יחסיות, חלק בעלי חיים לקבוצות BIR נמוכות (רביעון תחתון), בינוניות (שני רבעונים אמצעיים) וגבוהות (רביעון עליון).

4. שיטת דימום זנב לאיסוף דם

הערה: כדי להימנע משימוש בתרופות הרגעה שעלולות להיות אימונומודולטוריות, השתמש בשיטת דימום הזנב של איסוף הדם.

1. להגדרה, הניחו מעמד הלחמה וכוס ריסון על משטח בצד היד הלא דומיננטית. בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ מוסיפים 1-2 מ"ל שמן מאכל באיכות מזון. הסירו את הפקק מפקק הדם המהיר והניחו ליד ההתקנה.
2. הניחו כמה שכבות של מגבת נייר על מעמד ההלחמה ועל צינור הנימים הראשון בתוך אטב, ומקמו אותו קרוב למקום שבו יוחזק קצה הזנב של העכבר ויישמר במקביל לפני השטח של השולחן. יש סכין גילוח בהישג יד.
3. כדי לאסוף את הדם, בצע את השלבים הבאים.
   1. בזמן הנדרש, הוציאו את העכבר מהכלוב והניחו מתחת לכוס כשהזנב שלו יוצא מהחריץ בבסיס. בעזרת סכין גילוח טרי, חותכים את קצה הזנב (1-2 מ"מ) ואוספים את טיפת הדם הראשונה בצינור הנימי המחובר למעמד ההלחמה.
   2. טבלו אצבעות של יד דומיננטית בשמן האכיל והשתמשו בסחיטה מבסיס הזנב לקצה, תוך הנחיית קצה הזנב אל צינור הנימים כדי לאסוף טיפות דם שנוצרו. המשך עד ~ 200 μL של דם נאסף.
   3. שים מכסה קצה קטן על הקצה המחודד של צינור נימי לפני המכסה העליון. אם שמים את הכובע העליון קודם, הדגימה תסולק מהקצה המחודד של הצינור. שים צינור מעטפת חיצונית מגן.
   4. אפשר להיקרש לילה בטמפרטורת החדר. מצננים מיקרו-צנטריפוגה ל-4°C ומסובבים את הדם כלפי מטה כאמור בשלב 3.3.

איור 1. ציר הזמן לבדיקת התגובה החיסונית הבסיסית של נקבות בתולות והזדווגות. הזמינו עכברים להגיע בגיל 7 שבועות ואפשרו להם להתאקלם במתקן למשך שבוע. הזריקו לבעלי חיים 5 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) וכעבור 2.5 שעות שאבו דם. אפשר לדם להיקרש במשך הלילה, ואז צנטריפוגה ב 3,768 x גרם, 4 ° C למשך 8 דקות. יש לאסוף סרום ולהעריך רמות IL-6 יחסיות באמצעות ELISA או Multiplex. בגיל 9 שבועות, הגדירו זוגות הזדווגות. נוצר באמצעות BioRender.com לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. שיטה מבוססת משקל להזדווגות והזרקת E12.5 הריונית

הערה: איור 2 מציג את סכמת השלבים. ניתן להשתמש בשתי שיטות כדי להגדיר זוגות הזדווגות ולקבוע את נקודת הזמן E12.5. הראשונה, הזדווגות מתוזמנת, מתוארת במקום אחר²². חישובים מבוססי משקל יכולים לשמש גם כדי להעריך הריון E12.5²³. היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת נעילת זמן של גיל הסכר בעת ההזדווגות, ומפחיתה את השונות בתגובה החיסונית. הליך זה משמש כאן.

1. הכניסו את הזכרים לכלובים נקיים ואפשרו להם להתאקלם במשך שעתיים לפחות. זה מקטין את הסבירות לתוקפנות נשית מכיוון שהזכרים כבר יוצרים ריח דומיננטי בכלוב.
2. הגדר זוגות רבייה של זכר יחיד, נקבה אחת על ידי הוספת הנקבה לכלוב הזכר. לפני שמכניסים אותה לכלוב, שוקלים אותה ורושמים את המשקל. הוסיפו חופן קטן של גרעיני חמניות לכל כלוב כדי להגביר את יעילות ההזדווגות.
3. כדי לקבוע את טווח העלייה במשקל, בצע את השלבים הבאים.
   1. השיגו קבוצת בדיקה של נקבות וקבעו זוגות הזדווגות, תוך רישום משקל בזמן ההזדווגות.
   2. כאשר נקבות מתחילות להופיע בהריון גלוי, לשקול אותם ולחלק תת קבוצות של 8.5 גרם, 9.5 גרם, 10.5 גרם, ו 11.5 גרם של משקל שעלה. עוברים ב-E12.5 רק החלו לפתח ספרות ברורות בכפותיהם. השתמש במורפולוגיה עוברית כדי לקבוע עלייה ממוצעת במשקל כדי להגיע E12.5.
4. לאחר 12 יום לאחר ההזדווגות, לשקול נקבות ולקבוע עלייה במשקל. במתקן בדיקה, הנקבות עולות באופן עקבי 9.5-10.5 גרם מרגע ההזדווגות ל-E12.5. יש להזריק באמצעות i.p. את המינון של פולי מסיס (I:C) שנקבע בשלב 2.3.2 כאשר העלייה במשקל של הנקבה נופלת בטווח שנקבע מראש.
5. שימו לב לתגובה ל-MIA בסכרים באמצעות הפרמטרים הבאים.
   1. התנהגות מחלה: אספו ציונים סובייקטיביים בסולם של 1-3 עבור מידת הפעילות של סכרים בתגובה לטיפול, כאשר 1 הוא תנועה מועטה או ללא תנועה כלל בתגובה לטיפול ו-3 הוא תגובה נורמלית ללכידה וריסון. בעלי חיים עם תגובה חיסונית גדולה יותר יראו פחות עמידות לטיפול⁸.
   2. תגובת חום: באמצעות מדחום IR, לאסוף טמפרטורות לפני ההזרקה ו 2.5 שעות לאחר ההזרקה. בעלי חיים עם תגובות חיסוניות בעוצמה גבוהה יותר מציגים לעתים קרובות היפותרמיה בתגובה לפעילות חיסונית גדולה יותר⁸.
   3. שינוי משקל: יש לשקול בעלי חיים 24 שעות לאחר ההזרקה. בעלי חיים עם תגובות חיסוניות בעוצמה גדולה יותר בדרך כלל מאבדים יותר משקל⁸.
   4. מדוד רמות IL-6 הריוניות כדלקמן⁸.
      1. ב 2.5 שעות לאחר ההזרקה, לאסוף דם בשיטה המועדפת. יש לאפשר לדם להיקרש במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר 12-24 שעות, יש לסובב דגימות דם בטמפרטורה של 3,768 x גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 8 דקות.
      2. יש לאסוף את הסרום ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח. בודדו את הסרום ומדדו רמות IL-6 באמצעות ELISA או Luminex. שמרו על עקביות בכלי המדידה מכיוון שיש שונות משמעותית בריכוז הכולל הנמדד עם שיטות ויצרנים שונים.
      3. יש לשכן את הסכר לאחר ההזרקה עם העשרה מתאימה כמו קינונים ומכשירי העשרה. שמור על כל העשרה עקבית מכיוון שלשינויים בהעשרה יכולות להיות השפעות משמעותיות על התנהגות המכרסם 24,25,26,27,28,29.
6. זמן ההריון עבור עכברי C57 נע בין 18.5-20.5 ימים. בצע בדיקות המלטה כדי לקבוע אם בעלי חיים נולדו בטווח זה כדי לוודא שההזרקה בוצעה בנקודת הזמן הנכונה. בעת בדיקת המלטות, להפריע לכלוב כמה שפחות. מתח מיד לאחר המלטה יכול להגדיל את הסיכון לקניבליזציה.

איור 2. אינדוקציה MIA. זירוז MIA דורש הערכה של הריון, כלומר הזרקה של poly(I:C), ובדיקות המלטה כדי להבטיח תזמון נכון של דלקת אימהית. לאחר הערכת יום ההריון באמצעות הזדווגות מתוזמנת או שיטת העלייה במשקל, לספק זריקה i.p. של poly(I:C) ב E12.5. יש לאסוף דגימת דם בשעה 2.5 שעות לאחר ההזרקה כדי לאשר את הפעלת מערכת החיסון ולקבוע את רמת ההפעלה של IL-6. המלטות ייוולדו בסביבות E18.5-E20.5. נוצר באמצעות BioRender.com לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. חקירת שינויים בהתנהגות ב- MIA בוגר וצאצאי ביקורת (אופציונלי)

1. החל מ-P60 ולפני ביצוע מבחני התנהגות, יש להרגיל בעלי חיים למגע אנושי עם טיפול עדין למשך דקה אחת ביום במשך 3 ימים רצופים. יש לוודא כי ימי החלפת הכלוב אינם מתרחשים באותו יום בו מבוצעים מבחנים התנהגותיים.
2. אפשרו תמיד לעכברים להתאקלם בחדר הבדיקה למשך 30-60 דקות לפני תחילת מבחני התנהגות. השתמשו בחדרים עם תאורה עמומה (15-20 לוקס) כדי למזער חרדה.
3. לטיפוח חוזר, הניחו עכברים לבדם בכלובים נקיים ללא מצעים עם מכסים. באמצעות מצלמה, תיעדו את העכברים בכלובים אלה במשך 20 דקות. 10 הדקות הראשונות מתפקדות כתקופת התאקלמות, 10 הדקות האחרונות הן תקופת המבחן.
4. באמצעות סרטונים שמורים ושעון עצר, הניקוד את זמן הטיפוח המצטבר עבור כל עכבר במהלך תקופת הבדיקה של 10 דקות. התנהגויות אחרות שניתן להבקיע מסרטונים אלה כוללות הגבהה (עמידה על רגליים אחוריות), קפיאה וקפיצה⁸.
5. השתמש במבחנים נפוצים אחרים עבור מודל MIA כגון עיכוב דחף (PPI) 14,30,31,32, שדה פתוח^12,33,34, גישה חברתית תלת-קאמרית ^13,35,36, זיהוי אובייקט חדשני 37, מבוך y 30, מבוך מוגבה פלוס^33, והתניה של פחד הקשר/רמז ³⁸.
6. אימונובלוטינג לאחר הלידה⁸ (אופציונלי)
   1. ב-P0, ערפו את ראשיהם במהירות ונתחו את רקמת המוח העוברית ב-HBSS, הקפיאו בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
   2. יש לשבש דגימות באמצעות סוניק בדיקה עם משרעת של 20% למשך 5 שניות ב-2x חיץ Laemmli, ולאחר מכן לנטרל ב-85°C למשך 5 דקות. צנטריפוגה ליזט ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף supernatant ולאחסן ב -80 ° C.
   3. מדוד את תכולת החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA מסחרית, בהתאם להוראות היצרן, והשתמש באלבומין בסרום בקר כתקן כיול.
   4. הוסף dithiothreitol כסוכן מחזר לדגימות כריכוז סופי של 100 mM. יש לחמם ל-85°C למשך 2 דקות לפני העמסה על ג'ל.
   5. יש להפעיל 5 מק"ג/נתיב חלבון בתנאים מחזרים על 7.5% ג'ל TGS ולהעביר אלקטרופורטית לממברנות PVDF. לחסום ממברנות עם חיץ חוסם לדגור עם נוגדנים נבחרים.
   6. יש לשטוף שלוש פעמים עם TBS + 0.05% Tween 20 ולדגור על ממברנות במשך 45 דקות עם נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית.
   7. שטפו ארבע פעמים נוספות ב-TBS/Tween 20 וקבלו את תוצאות התמונה. סטנדרטיזציה של התוצאות באמצעות β-tubulin, שזוהה באמצעות אנטי-β-tubulin.

לא כל בעלי החיים שנחשפו ל-30 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) ב-E12.5 מעמידים צאצאים עם הפרעות התנהגותיות עקביות ^8,31. אף על פי שגם 30 מ"ג/ק"ג וגם 40 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) מייצרים באופן אמין התנהגויות מחלה בסכרים, כולל ירידה ברמות הפעילות, תגובות היפותרמיות וירידה במשקל, וגם גורמות לעליות משמעותיות ב-IL-6, רק תת-קבוצה של המלטות שנחשפו ל-MIA תמשיך לפתח הפרעות התנהגותיות בתחומים דומים לאלה שנצפו בפסיכיאטריה אנושית וב-NDDs (איור 3A-C)⁸ . מינון נמוך יותר של 20 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) גם גורם להתנהגות מחלה ולירידה במשקל, אולם בניגוד למינונים גבוהים יותר הוא אינו מייצר באופן עקבי תגובות IL-6 גבוהות מספיק כדי לגרום לסטיות התנהגותיות בצאצאים, אף על פי שתגובות IL-6 גבוהות בהרבה מאלו של סכרים המוזרקים במי מלח (איור 3D)⁸.

איור 3. מינונים שונים של poly(I:C) מובילים להשפעות דיפרנציאליות בסכרים. (A) סכרים שנחשפו ל-20 מ"ג/ק"ג, 30 מ"ג/ק"ג או 40 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) חוו ירידה בפעילות בסולם סובייקטיבי (ANOVA חד-כיווני; P < 0.0001). (B) סכרים שנחשפו רק ל-30 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) הראו שינוי משמעותי בטמפרטורה בצורה של תגובה היפותרמית (ANOVA חד-כיוונית; F3,35 = 4.289, P < 0.05). (C) הן 30 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) והן 40 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) גרמו לירידה משמעותית במשקל (ANOVA חד-כיוונית; F7,187 = 26.93, P < 0.0001) ו-(D) הראו רמות גבוהות של IL-6 מעל הסף הדרוש כדי לגרום לשינויים התנהגותיים (ANOVA חד-כיוונית; F3,35 = 25.54, P < 0.0001). (E) תגובתיות חיסונית בסיסית בנקבות איזוגניות C57BL/6J היא משתנה מאוד, וסיווג נקבות BIR לקבוצות נמוכות, בינוניות וגבוהות מאפשר לחוקרים לחזות אילו צאצאים הם בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להיות רגישים להשפעה של MIA. עמודות מייצגות ממוצע ± SEM. נתון זה שונה מ- Estes et ^al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

באופן בלתי צפוי, נקבות בתולות C57BL/6 מציגות תגובתיות חיסונית בסיסית משתנה למדי (BIR) למינון נמוך של פולי(I:C) (5 מ"ג/ק"ג פולי(I:C)) לפני ההריון, אף על פי שהן איזוגניות, ושונות זו אינה קשורה למשקל (איור 3E, איור משלים 1)⁸. סכרים שמוזרקים להם 5 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) לפני ההריון שתגובות IL-6 שלהם הן באמצע 50% (סכרי BIR בינוניים) מייצרים צאצאים זכרים בוגרים עם שינויים ברמות החלבון STAT3, MEF2 וטירוזין הידרוקסילאז ברקמת סטריאטלי P0 (איור 4C-E)⁸. צאצאים זכרים של סכרי BIR בינוניים שנחשפו ל-30 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) מפגינים גם הם ירידה בצפיפות הסינפסות, וקומפלקס היסטו-תאימות גדול גבוה I (MHCI) בתרבית עצבית מנותקת (איור 4A,B)⁸. סכרים שהוזרקו להם 5 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) לפני ההריון שתגובות IL-6 שלהם הן באמצע 50% (סכרי BIR בינוניים) מייצרים באופן אמין צאצאים זכרים בוגרים עם התנהגויות חזרתיות גבוהות והתנהגות חקרנית מופחתת כאשר הם נחשפים ל-30 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) ב-E12.5 (איור 5A-F)⁸.

לעומת זאת, עכברים מקבוצת BIR גבוהה (עם רמות IL-6 ב -25% העליונים כאשר נחשפו ל -5 מ"ג / ק"ג של פולי (I: C) לפני ההריון) מייצרים צאצאים באופן אמין ללא שינויי התנהגות חוזרים ונשנים לאחר MIA. אולם צאצאים זכרים של סכרי BIR גבוהים אלה מפגינים התנהגות גישושית מוגברת בעקבות MIA (איור 5D)⁸. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך ש- MIA יכול לגרום לתוצאות דיפרנציאליות בצאצאים, בהתאם ל- BIR⁸ של הסכר.

איור 4. מינון ביניים של poly(I:C) ו- BIR מוביל לתוצאות הטובות ביותר במודלים של MIA. (A) נוירונים קורטיקליים מצאצאים שנחשפו להפעלה חיסונית אימהית באמצע ההיריון הראו עלייה משמעותית בהצגת MHCI רק כאשר הסכרים קיבלו 30 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) (ANOVA חד-כיוונית; F3,19 = 5.156, P < 0.01). (B) לעומת זאת, כל המינונים (20 מ"ג/ק"ג, 30 מ"ג/ק"ג ו-40 מ"ג/ק"ג) הביאו לירידה משמעותית בצפיפות הסינפסות בתרבית עצבית מנותקת (ANOVA חד-כיוונית; F3,43 = 11.01, P < 0.0001). (ג-ה) כתמים מערביים סטריאטליים P0 מראים רמות גבוהות של STAT3, MEF2A ו-TH, רק בבעלי חיים שלאימהותיהם היה BIRs בינוני והן נחשפו ל-30 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) (ANOVA חד-כיוונית; MEF2A: F3,24 = 3.968, P < 0.05; STAT3: F3,24 = 6.401, P < 0.01; TH: F3,24 = 3.668, P < 0.05). עמודות מייצגות ממוצע ± SEM. נתון זה שונה מ- Estes et ^al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן להשוות בעלי חיים רגישים בקבוצות BIR בינוניות של 30 מ"ג/ק"ג ו-BIR גבוה של 30 מ"ג/ק"ג לא רק לבקרות, אלא גם לבעלי חיים עמידים. הזרקה של סכרי BIR בינוניים עם מינון גבוה עוד יותר של 40 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) מייצרת צאצאים ללא שינויים משמעותיים בהתנהגות שזוהו באמצעות הבדיקות שננקטו עד כה (איור 5A-F)⁸. זה מצביע על קשר U הפוך בין הפעלת מערכת החיסון לבין רגישות ל- MIA.

איור 5. צאצאים זכרים מסכרים שנחשפו למנת ביניים של פולי(I:C) מציגים את השינויים הגדולים ביותר בהתנהגות. (א-ו) צאצאים זכרים מסכרים שנחשפו ל-30 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) (ANOVA חד-כיווני מקונן; F3,27 = 8.775; נמוך: P = 0.0427; בינוני: P = 0.0062; גבוה: (P = 0.9568) אך לא 20 מ"ג/ק"ג או 40 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) מראים שינויים בטיפוח חוזר ובהתנהגות גידול גישוש. בנוסף, בעלי חיים בקבוצת הטיפול בפולי(I:C) של 30 מ"ג/ק"ג מראים צורות שונות של רגישות, וצאצאים זכרים של אימהות BIR בינוניות מראים התנהגות חזרתית מוגברת וחקירה מופחתת, בעוד שצאצאים זכרים של אמהות BIR גבוה לא מראים שינוי בהתנהגות חזרתית, אך היו בעלי התנהגות חקרנית מוגברת (A,D ; ANOVA חד-כיווני מקונן; F3,15 = 9.407, נמוך: P = 0.4910; בינוני: P < 0.001; גבוה: P = 0.0117). נראה כי צאצאים שנחשפו ל-20 מ"ג/ק"ג של פולי(I:C) לא עמדו בסף ההפעלה החיסונית הנדרש לשינוי ההתפתחות העצבית מכיוון שהם לא הראו שינויים בהתנהגויות שנבדקו, בעוד שצאצאים שנחשפו ל-40 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) היו גם עמידים בעיקר להשפעותיו (B,C,E,F). עמודות מייצגות ממוצע ± SEM. נתון זה שונה מ- Estes et ^al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1. תגובתיות חיסונית בסיסית אינה מתואמת עם משקל בעלי חיים. נקבות עכברים בתולות מציגות מגוון רחב של תגובות IL-6 ל-5 מ"ג/ק"ג פולי(I:C) שהוזרקו לפני ההריון באופן שאינו תלוי במשקל, R² = 0.0086, P = 0.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

זיהום אימהי משנה את מהלך התפתחות המוח בבני אדם ובמכרסמים ובפרימטים לא אנושיים ^4,5,7. כאן, מתואר הליך להשראת MIA בעכברים בנקודת זמן באמצע ההריון באמצעות poly(I:C). שיטה זו משלבת הערכה של BIR לפני ההריון, אשר מגבירה את יכולת השחזור ומציעה הזדמנות לחקור באופן מכניסטי מנגנונים המובילים לחוסן ורגישות של צאצאים ל- MIA⁸. לאחר MIA, סכרים מקבוצת BIR בינונית (עם רמות IL-6 באמצע 50%) מייצרים באופן אמין צאצאים בוגרים עם שינויים בהתנהגויות חוזרות, שינויים ברמות MHCI על נוירונים מצאצאים שזה עתה נולדו כפי שנקבע על ידי אימונוציטוכימיה, ורמות גבוהות של טירוזין הידרוקסילאז סטריאטלי, MEF2 וחלבון STAT3 מצאצאים שזה עתה נולדו כפי שנקבע על ידי כתם⁸ המערבי.

השימוש ב-MIA כמודל סביבתי מעניק רלוונטיות תרגומית מוגברת מכיוון שהוא עומד בקריטריונים של מודל מחלה: מבנה, פנים ותוקף ניבוי⁷. עם זאת, כמו בכל מודל סביבתי, יש לנקוט בזהירות רבה כדי למזער משתנים חיצוניים. גורמים רבים כגון ספק, מגרש פולי(I:C), תזמון ההזרקה, גיל הסכרים ואפילו מערכת הכלוב יכולים לשנות את ההשפעה של MIA על צאצאים ^8,9,39. כפי שדווח בעבר, העוצמה של poly(I:C) אינה עקבית בין יצרנים, הרבה, ואפילו בקבוקים בתוך הרבה בשל שונות גבוהה בריכוזי dsRNA ומשקל מולקולרי ^8,40. מכיוון ששונות זו יכולה להגביר את ההטרוגניות בתגובה החיסונית האימהית, חיוני שהמעבדות יקבעו את המינון היעיל עבור כל מנה כדי לשמור על יכולת שחזור מקסימלית בפנוטיפים נצפים. לדוגמה, צוין כי עכברי נהר צ'ארלס שנחשפו ל- MIA מייצרים BIR עקבי ופנוטיפים תלויי מינון בצאצאים, ועכברים מטאקוניק עשויים גם הם להיות מושפעים באופן דומה עם הבדלים מסוימים בין קבוצות טיפול⁸. בנוסף, חיוני שהחוקרים יתקנו את שיטות הגידול וישמרו רשומות מפורטות כדי להגדיל את יכולת השחזור של המודל. הפרסום שחיברו קנטנר ועמיתיו תיאר את הפרטים הרבים שיש לכלול בדוחות ניסיוניים ויכולים גם לתפקד כרשימת תיוג לחוקרים כשהם מסיימים את הפרוטוקולים שלהם⁹.

BIR מוערך באמצעות רמות אינטרלוקין-6 (IL-6) יחסית בסרום מעכברות בתולות. חלוקת עכברים אלה לשלוש קבוצות (נמוכה, בינונית וגבוהה) מגלה מודלים עמידים ורגישים לשכפול⁸. מכיוון ש-BIR הוא עניין של ריכוז יחסי של IL-6, אין זה חיוני לבדוק בקפדנות את עוצמת המשקל המולקולרי הגבוה של פולי(I:C) כפי שנדרש עם פולי המשקל המולקולרי המעורב (I:C) המשמש לגרימת הפעלה חיסונית אימהית במהלך ההיריון. BIR הוא מדד חדש יחסית שעשוי שלא להפחית את כל התוצאות המשתנות.

התגובה החיסונית של סכרים במהלך החשיפה הראשונה שלהם למנות הריון של poly(I:C) עשויה להיות שונה מהתגובה שלהם במהלך הריונות וחשיפות עוקבים. לשם כך, שימוש בנקבות בתולות מפחית את פוטנציאל השונות ששינויים בתגובה החיסונית כתוצאה מהריונות מרובים עלולים להציג. השיטה מבוססת המשקל של הערכת נקודת זמן ההריון היא הכרחית מכיוון שעכברות לעתים קרובות אינן נכנסות להריון בתוך 24 השעות הראשונות של ההזדווגות.

חשוב לציין כי ישנם אתגרים סטטיסטיים במודל זה. מכיוון ש-MIA מושרה בסכרים, לא ניתן לחלק את הצאצאים באופן אקראי לתנאי טיפול. לכן, כל המלטה חייבת להיחשב n של 1 9,41,42^, ופרטים בתוך המלטה זו צריכים להיות ממוצעים כדי ליצור כל נקודת נתונים. התכנון הסטטיסטי המתאים ביותר לנתונים אלה משתמש אפוא בניתוחים מקוננים⁸. יש צורך במינימום של שש המלטות לכל קבוצה (BIR x dose) כדי לזהות באופן אמין שינויים במדדים התנהגותיים ומולקולריים. הבדלים משמעותיים בין המינים צוינו בהרחבה בספרות MIA, ולכן אין לאגד בין המינים בניתוחים 8,9,43,44.

BIR הוא כלי חיזוי חדש יחסית, והוא טרם הוגדר במונחים של השפעה מכניסטית. עדיין לא ידוע אם BIR קשור לתגובות חיסוניות הריוניות ספציפיות, אולם תגובת IL-6 של עכברות לפני ההריון אינה שקולה לתגובתם במהלך הריון⁸. BIR מייצג אפוא מדד ניבוי מתאם, ומחקרים נוספים נמשכים כדי לקבוע את מקורותיו.

למרות השונות הטבועה במודל MIA, שום מודל סביבתי אחר של הפרעות נוירופסיכיאטריות ו- NDDs עד כה לא יכול לספק את אותה רמה של רלוונטיות תרגומית. הכנה ובדיקות פיילוט מקיפות נחוצות כדי לייצר עקביות במודל MIA, אך החוסן של התוצאות הפנוטיפיות מפצה על השקעה ראשונית זו. בסופו של דבר, מודלים של MIA בבעלי חיים מציעים פוטנציאל חסר תקדים לחקור גורם סיכון יחיד שיוצר אשכולות שונים ומובחנים של שינויים התנהגותיים ומולקולריים בצאצאים, בדומה לאלה שנצפו באוכלוסיות אנושיות.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אנו מודים לד"ר מיקה אסטס על התמדתה בטיפול בשונות במודל MIA של העכבר ולכל התורמים באסטס ואחרים ^{8 על} עבודתם שהובילה לפיתוח פרוטוקול השיטות המתואר כאן. המחקר המדווח כאן נתמך על ידי NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) ו- NIMH T32MH112507 (K.P).