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La infección materna es un factor de riesgo para los trastornos del desarrollo neurológico. Los modelos de ratón de activación inmune materna (MIA) pueden dilucidar el impacto de la infección en el desarrollo y la función del cerebro. Aquí, se proporcionan pautas generales y un procedimiento para producir crías confiablemente resistentes y susceptibles expuestas a MIA.
La activación inmune materna (MIA) durante el embarazo está constantemente relacionada con un mayor riesgo de trastornos del desarrollo neurológico y neuropsiquiátricos en la descendencia. Los modelos animales de MIA se utilizan para probar la causalidad, investigar mecanismos y desarrollar diagnósticos y tratamientos para estos trastornos. A pesar de su uso generalizado, muchos modelos MIA sufren de una falta de reproducibilidad y casi todos ignoran dos aspectos importantes de este factor de riesgo: (i) muchos descendientes son resistentes a MIA, y (ii) los descendientes susceptibles pueden exhibir distintas combinaciones de fenotipos. Para aumentar la reproducibilidad y modelar tanto la susceptibilidad como la resistencia a la MIA, la inmunorreactividad basal (BIR) de ratones hembra antes del embarazo se utiliza para predecir qué embarazos darán lugar a una descendencia resistente o descendencia con anomalías moleculares y de comportamiento definidas después de la exposición a la MIA. Aquí, se proporciona un método detallado para inducir MIA a través de la inyección intraperitoneal (i.p.) del poli (I: C) imitador viral de ARN bicatenario (dsRNA) a los 12,5 días de gestación. Este método induce una respuesta inflamatoria aguda en la madre, lo que resulta en perturbaciones en el desarrollo del cerebro en ratones que se asignan a dominios impactados de manera similar en los trastornos psiquiátricos y del neurodesarrollo humano (NDD).
La evidencia epidemiológica vincula la infección materna con un mayor riesgo de NDD psiquiátrica, incluida la esquizofrenia (SZ) y el trastorno del espectro autista (TEA)1,2,3,4,5,6,7. El modelo de ratón MIA fue desarrollado para probar la causalidad y el papel mecanicista de MIA en la etiología de estos trastornos, así como para identificar biomarcadores moleculares y desarrollar herramientas diagnósticas y terapéuticas 4,6. A pesar de la utilidad de este modelo y su creciente popularidad, existe una variabilidad considerable en los protocolos de inducción de MIA dentro del campo, lo que dificulta la comparación de los resultados entre los estudios y la replicación de los hallazgos 8,9. Además, la mayoría de las iteraciones del modelo no investigan dos aspectos traslacionales importantes de la MIA: (i) muchos descendientes son resistentes a la MIA, y (ii) los descendientes susceptibles pueden exhibir distintas combinaciones de fenotipos8.
Para generar un modelo de MIA reproducible, los investigadores deben informar al menos una medida cuantitativa de la magnitud de MIA inducida en presas. Para inducir MIA durante la gestación, nuestro laboratorio realiza inyecciones intraperitoneales (i.p.) del poliinositítico imitador viral de ARN bicatenario: ácido policitidílico [poli(I:C)]. Poly(I:C) induce una cascada inmune similar a los virus de la influenza, ya que es reconocido por el receptor tipo toll 3 (TLR3)10. Como resultado, poli(I:C) activa la respuesta de fase aguda que resulta en una rápida elevación de citoquinas proinflamatorias 8,11,12. Estudios previos han demostrado que la elevación de citoquinas proinflamatorias, incluyendo la interleucina-6 (IL-6), es necesaria para producir anomalías conductuales y neuropatología en la descendencia como resultado de MIA11,12,13. Por lo tanto, el nivel de IL-6 en el suero materno recolectado durante su pico a las 2,5 h después de la inyección de poli(I: C) es una medida cuantitativa convincente de MIA que se puede utilizar para comparar los resultados entre laboratorios dentro del campo.
Con el fin de generar un modelo MIA que aborde los elementos traslacionalmente esenciales de resiliencia y susceptibilidad con un solo protocolo de inducción 8,14, los investigadores pueden combinar enfoques típicos de inducción con la caracterización de la inmunorreactividad basal (BIR) de la madre antes del embarazo8. Recientemente, se descubrió que los ratones hembra vírgenes C57BL / 6 muestran una amplia gama de respuestas IL-6 a una exposición a dosis bajas a poli(I: C) antes del embarazo8. Es sólo un subconjunto de estas hembras que llegan a producir descendencia susceptible, y sólo a ciertas magnitudes de activación inmune según lo dictado por la combinación de BIR y poli(I:C) dosis8. MIA induce fenotipos en un patrón de U invertida; La descendencia muestra las mayores aberraciones conductuales y moleculares cuando las madres son moderadamente inmunorreactivas, y la magnitud de la inflamación materna alcanza, pero no supera, un rango crítico8. Aquí, se proporciona un método detallado de cómo crear de manera confiable descendientes resistentes y susceptibles con fenotipos conductuales divergentes como resultado de la inyección gestacional media de poli (I: C).
Todos los protocolos se realizan bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California-Davis (IACUC).
1. Preparación de animales
2. Prueba y preparación de lotes de poli(I:C)
3. Prueba de inmunorreactividad basal (BIR)
NOTA: La figura 1 muestra el esquema de los pasos. Use un poli (I: C) de peso molecular diferente para la prueba BIR en comparación con la gestacional para reducir la probabilidad de respuestas inmunes adaptativas al compuesto.
4. Método de sangrado de cola para la recolección de sangre
NOTA: Para evitar el uso de sedantes potencialmente inmunomoduladores, use el método de extracción de sangre para el sangrado de la cola.
Figura 1. La línea de tiempo para probar la inmunorreactividad y el apareamiento de referencia de las hembras vírgenes. Ordene a los ratones que lleguen a las 7 semanas de edad y permita aclimatarse a las instalaciones durante 1 semana. Inyectar a los animales con 5 mg/kg de poli(I:C) y 2,5 h más tarde extraer sangre. Deje que la sangre se coagule durante la noche, luego centrifugar a 3,768 x g, 4 ° C durante 8 min. Recolectar suero y evaluar los niveles relativos de IL-6 a través de ELISA o Multiplex. A las 9 semanas de edad, establezca parejas de apareamiento. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Método basado en el peso para el apareamiento y la inyección gestacional de E12.5
NOTA: La figura 2 muestra el esquema de los pasos. Se pueden usar dos métodos para configurar pares de apareamiento y determinar el punto de tiempo E12.5. El primero, el apareamiento cronometrado, se describe en otra parte22. Los cálculos basados en el peso también se pueden utilizar para evaluar un embarazo E12.523. El beneficio de este enfoque es que permite el bloqueo temporal de la edad de la madre en el apareamiento, disminuyendo la variabilidad en la respuesta inmune. Este procedimiento se utiliza aquí.
Figura 2. Inducción MIA. La inducción de MIA requiere una evaluación del embarazo, inyección i.p. de poli(I: C) y controles de camada para garantizar el momento correcto de la inflamación materna. Después de evaluar el día gestacional, ya sea a través del apareamiento cronometrado o el método de aumento de peso, administre una inyección i.p. de poli (I: C) en E12.5. Recoger una muestra de sangre a las 2,5 h después de la inyección para confirmar la activación inmune y determinar el nivel de activación de IL-6. Las camadas nacerán aproximadamente E18.5-E20.5. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Investigación de alteraciones en el comportamiento en MIA adulta y crías control (opcional)
No todos los animales expuestos a 30 mg/kg de poli(I:C) en E12.5 producen descendencia con anomalías de comportamiento consistentes 8,31. Aunque tanto 30 mg/kg como 40 mg/kg de poli(I:C) producen de manera confiable comportamientos de enfermedad en las presas, incluyendo disminución de los niveles de actividad, respuestas hipotérmicas y pérdida de peso, y también causan elevaciones significativas en IL-6, solo un subconjunto de camadas expuestas a MIA desarrollará anomalías de comportamiento en dominios similares a los observados en psiquiátricos humanos y NDD (Figura 3A-C)8 . Una dosis más baja de 20 mg/kg de poli(I:C) también induce comportamiento de enfermedad y pérdida de peso, pero en contraste con dosis más altas no produce consistentemente respuestas de IL-6 lo suficientemente altas en magnitud como para inducir aberraciones de comportamiento en la descendencia a pesar de que las respuestas de IL-6 están muy por encima de las de las madres inyectadas con solución salina (Figura 3D)8.
Figura 3. Diferentes dosis de poli(I:C) conducen a efectos diferenciales en las presas. (A) Las presas expuestas a 20 mg/kg, 30 mg/kg o 40 mg/kg de poli(I:C) experimentaron una disminución de la actividad en una escala subjetiva (ANOVA unidireccional; P < 0,0001). (B) Las presas expuestas sólo a 30 mg/kg de poli(I:C) mostraron una temperatura significativamente alterada en forma de respuesta hipotérmica (ANOVA unidireccional; F3,35 = 4,289, p < 0,05). (C) Tanto 30 mg/kg de poli(I:C) como 40 mg/kg de poli(I:C) indujeron una pérdida de peso significativa (ANOVA unidireccional; F7,187 = 26.93, P < 0.0001) y (D) mostraron niveles elevados de IL-6 por encima del umbral requerido para inducir alteraciones conductuales (ANOVA unidireccional; F3,35 = 25,54, p < 0,0001). (E) La inmunorreactividad basal en hembras isogénicas C57BL/6J es muy variable, y la categorización de las hembras BIR en grupos bajos, medios y altos permite a los investigadores predecir qué crías tienen más probabilidades de ser susceptibles al impacto de MIA. Las barras representan la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada de Estes et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Inesperadamente, los ratones hembra vírgenes C57BL/6 exhiben inmunorreactividad basal (BIR) bastante variable a una dosis baja de poli(I:C) (5 mg/kg de poli(I:C)) antes del embarazo a pesar de que son isogénicos, y esta variabilidad no está asociada con el peso (Figura 3E, Figura complementaria 1)8. Las madres inyectadas con 5 mg/kg de poli(I:C) antes del embarazo cuyas respuestas IL-6 están en el 50% medio (madres BIR medias) producen descendencia masculina adulta con alteraciones en los niveles de STAT3, MEF2 y proteína tirosina hidroxilasa en el tejido estriado P0 (Figura 4C-E)8. Las crías masculinas de madres BIR medianas expuestas a 30 mg/kg de poli(I:C) también presentan disminución de la densidad de sinapsis y elevada del complejo mayor de histocompatibilidad I (MHCI) en cultivo neuronal disociado (Figura 4A,B)8. Las madres inyectadas con 5 mg/kg de poli(I:C) antes del embarazo cuyas respuestas IL-6 están en el 50% medio (madres BIR medias) producen de manera confiable crías masculinas adultas con comportamientos repetitivos elevados y comportamiento exploratorio disminuido cuando se exponen a 30 mg/kg de poli(I:C) en E12.5 (Figura 5A-F)8.
Por el contrario, los ratones del grupo de BIR alto (con niveles de IL-6 en el 25% superior cuando se exponen a 5 mg / kg de poli (I: C) antes del embarazo) producen descendencia de manera confiable sin cambios de comportamiento repetitivos después de MIA. Sin embargo, las crías masculinas de estas presas BIR altas exhiben un comportamiento exploratorio elevado después de MIA (Figura 5D)8. Juntos, estos resultados indican que la MIA puede causar resultados diferenciales en la descendencia, dependiendo del BIR8 de la madre.
Figura 4. Una dosis intermedia de poli(I:C) y BIR conduce a los mejores resultados en los modelos MIA. (A) Las neuronas corticales de la descendencia expuesta a la activación inmune materna a mediados de la gestación mostraron un aumento significativo de la presentación de MHCI solo cuando las madres recibieron 30 mg / kg de poli (I: C) (ANOVA unidireccional; F3,19 = 5,156, p < 0,01). (B) En contraste, todas las dosis (20 mg/kg, 30 mg/kg y 40 mg/kg) resultaron en una disminución significativa de la densidad de sinapsis en el cultivo neuronal disociado (ANOVA unidireccional; F3,43 = 11,01, p < 0,0001). (C-E) Los Western blots estriatales P0 muestran niveles elevados de STAT3, MEF2A y TH, solo en animales cuyas madres tenían BIRs medianos y estuvieron expuestas a 30 mg/kg de poli(I:C) (ANOVA unidireccional; MEF2A: F3,24 = 3,968, p < 0,05; STAT3: F3,24 = 6,401, P < 0,01; TH: F3,24 = 3,668, p < 0,05). Las barras representan la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada de Estes et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los animales susceptibles en los grupos BIR medio 30 mg/kg y BIR alto 30 mg/kg no solo pueden compararse con los controles, sino también con los animales resistentes. La inyección de presas BIR medianas con una dosis aún mayor de 40 mg/kg de poli(I:C) produce descendencia sin alteraciones significativas en el comportamiento identificadas mediante los ensayos empleados hasta la fecha (Figura 5A-F)8. Esto sugiere una relación en U invertida entre la activación inmune y la susceptibilidad a MIA.
Figura 5. Las crías masculinas de madres expuestas a una dosis intermedia de poli(I:C) exhiben las mayores alteraciones en el comportamiento. (A-F) Crías masculinas de presas expuestas a 30 mg/kg de poli(I:C) (ANOVA anidado unidireccional; F3,27 = 8,775; Baja: P = 0,0427; Media: P = 0,0062; Alto: (P = 0,9568) pero no 20 mg/kg o 40 mg/kg de poli(I:C) muestran alteraciones en el aseo repetitivo y el comportamiento de crianza exploratoria. Además, los animales en el grupo de tratamiento poli (I: C) de 30 mg / kg muestran formas dispares de susceptibilidad, y los descendientes masculinos de madres BIR medianas muestran un aumento del comportamiento repetitivo y una disminución de la exploración, mientras que los descendientes masculinos de madres con BIR alto no muestran alteración en el comportamiento repetitivo, pero han aumentado el comportamiento exploratorio (A, D ; ANOVA unidireccional anidado; F3,15 = 9,407, Bajo: P = 0,4910; Medio: P < 0,001; Alto: P = 0,0117). Las crías expuestas a 20 mg/kg de poli(I:C) no parecieron alcanzar el umbral de activación inmune requerido para alterar el desarrollo neuronal ya que no mostraron alteraciones en los comportamientos probados, mientras que las crías expuestas a 40 mg/kg de poli(I:C) también fueron en su mayoría resistentes a sus efectos (B,C,E,F). Las barras representan la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada de Estes et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1. La inmunorreactividad basal no se correlaciona con el peso animal. Los ratones hembra vírgenes exhiben una amplia gama de respuestas de IL-6 a 5 mg / kg de poli (I: C) inyectado antes del embarazo de manera independiente del peso, R2 = 0.0086, P = 0.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.
La infección materna altera el curso del desarrollo cerebral en humanos y en roedores y primates no humanos 4,5,7. Aquí, se describe un procedimiento para inducir MIA en ratones en un punto de tiempo gestacional medio usando poli (I: C). Este método incorpora la evaluación del BIR antes del embarazo, lo que aumenta la reproducibilidad y ofrece la oportunidad de investigar mecánicamente los mecanismos que conducen a la resiliencia y susceptibilidad de la descendencia a MIA8. Después de MIA, las madres del grupo BIR medio (con niveles de IL-6 en el 50% medio) generan de manera confiable descendencia adulta con alteraciones en los comportamientos repetitivos, alteraciones en los niveles de MHCI en las neuronas de la descendencia recién nacida según lo determinado por inmunocitoquímica y niveles elevados de tirosina hidroxilasa estriatal, MEF2 y proteína STAT3 de la descendencia recién nacida según lo determinado por Western blot8.
El uso de MIA como modelo ambiental confiere una mayor relevancia traslacional ya que cumple con los criterios para un modelo de enfermedad: constructo, cara y validez predictiva7. Sin embargo, como con cualquier modelo ambiental, se debe tener mucho cuidado para minimizar las variables externas. Muchos factores como el vendedor, el lote de poli(I:C), el momento de la inyección, la edad de las presas e incluso el sistema de jaula pueden alterar el impacto de MIA en la descendencia 8,9,39. Como se informó anteriormente, la potencia de poli(I:C) es inconsistente entre fabricantes, lotes e incluso botellas dentro de un lote debido a la alta variabilidad en las concentraciones de dsRNA y pesos moleculares 8,40. Debido a que esta variabilidad puede aumentar la heterogeneidad en la respuesta inmune materna, es fundamental que los laboratorios determinen la dosis efectiva para cada lote para mantener la máxima reproducibilidad en fenotipos observables. Por ejemplo, se ha observado que los ratones Charles River expuestos a MIA producen BIR consistente y fenotipos dependientes de la dosis en la descendencia, y los ratones de Taconic también pueden verse afectados de manera similar con algunas diferencias entre los grupos de tratamiento8. Además, es vital que los investigadores estandarizen las prácticas de cría y mantengan registros detallados para aumentar la reproducibilidad del modelo. La publicación escrita por Kentner et al. describió los muchos detalles que deben incluirse en los informes experimentales y también puede funcionar como una lista de verificación para los investigadores a medida que finalizan sus protocolos9.
El BIR se evalúa utilizando los niveles séricos relativos de interleucina-6 (IL-6) de ratones hembra vírgenes. La división de esos ratones en tres grupos (bajo, medio y alto) revela modelos reproducibles, resistentes y susceptibles8. Debido a que BIR es una cuestión de concentración relativa de IL-6, no es crucial probar rigurosamente la potencia poli (I: C) de alto peso molecular como es necesario con el poli (I: C) de peso molecular mixto utilizado para inducir la activación inmune materna durante la gestación. BIR es una medida relativamente nueva que puede no reducir todos los resultados variables.
Las respuestas inmunes de las madres durante su primera exposición a dosis gestacionales de poli(I:C) pueden diferir de su respuesta durante embarazos y exposiciones posteriores. Con este fin, el uso de hembras vírgenes reduce el potencial de variabilidad que podrían presentar las alteraciones en la respuesta inmune resultantes de embarazos múltiples. El método basado en el peso para estimar el punto de tiempo del embarazo es necesario porque los ratones a menudo no quedan embarazadas dentro de las primeras 24 horas de apareamiento.
Es importante tener en cuenta que existen desafíos estadísticos con este modelo. Debido a que MIA se induce en las madres, la descendencia no puede ser aleatorizada en condiciones de tratamiento. Por lo tanto, cada camada debe considerarse un n de 1 9,41,42, y los individuos dentro de esa camada deben promediarse para crear cada punto de datos. Por lo tanto, el diseño estadístico más apropiado para estos datos utiliza análisis anidados8. Se necesita un mínimo de seis camadas por grupo (dosis BIR x) para detectar de forma fiable alteraciones en las medidas conductuales y moleculares. Se han observado ampliamente diferencias significativas de sexo en la literatura de MIA, por lo que los sexos nunca deben agruparse en los análisis 8,9,43,44.
BIR es una herramienta predictiva relativamente nueva, y aún no se ha definido en términos de impacto mecanicista. Se desconoce si el BIR está asociado con respuestas inmunes gestacionales específicas, sin embargo, la respuesta de IL-6 de los ratones antes del embarazo no es equivalente a su respuesta durante el embarazo8. Por lo tanto, BIR representa una medida predictiva correlativa, y se están realizando más investigaciones para determinar sus orígenes.
A pesar de la variabilidad inherente al modelo MIA, ningún otro modelo ambiental de trastornos neuropsiquiátricos y NDD hasta la fecha puede proporcionar el mismo nivel de relevancia traslacional. La preparación y las pruebas piloto exhaustivas son necesarias para producir consistencia en el modelo MIA, pero la solidez de los resultados fenotípicos compensa esta inversión inicial. En última instancia, los modelos animales MIA ofrecen un potencial sin precedentes para investigar un solo factor de riesgo que crea grupos divergentes y distintos de alteraciones conductuales y moleculares en la descendencia, similares a las observadas en poblaciones humanas.
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecemos a la Dra. Myka Estes por su persistencia en abordar la variabilidad en el modelo MIA de ratón y a todos los colaboradores en Estes et al.8 por su trabajo que condujo al desarrollo del protocolo de métodos descrito aquí. La investigación reportada aquí fue apoyada por NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) y NIMH T32MH112507 (K.P.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Control and vehicle for Poly(I:C) |
35mm petri dish | Thomas Scientific | 1219Z45 | Used to hold oil during tail bleed |
7.5% TGX gels | Bio-rad | 4561084 | Optional |
Ancare Nestlets | Fisher Scientific | NC9365966 | Optional |
anti-β-tubulin | Millipore | MAB3408 | Optional |
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I | Bio-rad | 171I50001 | |
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate | Bio-rad | 171304070M | |
Bovine Serum Albumin | ThermoFisher | 23209 | Optional |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Optional |
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle | Spectrum | 552-58457-083 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779-10G | Optional |
Environmental enrichment | Bio-serv | K3327 and K3322 | Optional |
Ethovision | Noldus | Ethovision | Optional |
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies | Li-cor | 925-32213 and 925-68072 | Optional |
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) | Various vendors | Use to lubricate tail during tail bleeds | |
HBSS | ThermoFisher | 14060040 | Optional |
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid | Invivogen | #tlrl-pic-5 | Used to establish females' BIR |
Humane Mouse Restrainer | AIMS | 1000 | Used to restrain mouse during tail bleeds |
Image Studio Software | Licor | 5.2 | Optional |
Laemmli buffer | Bio-rad | 1610737EDU | Optional |
Luminex200 | ThermoFisher | APX10031 | |
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube | Sarstedt | 16.440.100 | |
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid | Sigma-Aldrich | #P0913 | Gestational induction of MIA |
monoclonal anti-MEF2A | AbCam | ab76063 | Optional |
monoclonal anti-STAT3 | Cell signaling | 12640S | Optional |
Observer | Noldus | Observer | Optional |
Odyssey blocking buffer (TBS) | Li-cor | 927-50003 | Optional |
Odyssey CLx imaging system | Li-cor | 9140 | Optional |
Omnipure PBS | Millipore | 65054L | Optional |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | Optional |
polyclonal anti_TH | Pel-Freez | P4101-150 | Optional |
PVDF membrane | Bio-rad | 162-0177 | Optional |
Qsonica Sonicator Q500 | Fisher Scientific | 15-338-282 | Optional |
Quick blood stopper | Petco | 17140 | |
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile | USA Scientific | 1615-5500 | |
Soldering stand | Amazon | B08Y12QC73 | Used to hold capillary tube during tail bleeds |
Sunflower seeds | Bio-serv | S5137-1 | Use to increase breeding efficiency |
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, | Bio-rad | 171G5007M | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Optional |
Tween 20 | Bio-rad | 23209 | Optional |
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