Un modello affidabile di lembo fascio-cutaneo suino per studi di bioingegneria di allotrapianti compositi vascolarizzati

Il presente protocollo descrive il modello di lembo fascio-cutaneo suino e il suo potenziale utilizzo nella ricerca sui tessuti compositi vascolarizzati.

Gli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA) come il trapianto di mano, viso o pene rappresentano il trattamento all'avanguardia per i difetti devastanti della pelle, falliti dai primi passi della scala ricostruttiva. Nonostante i risultati estetici e funzionali promettenti, il principale fattore limitante rimane la necessità di un'immunosoppressione permanente drasticamente applicata e i suoi ben noti rischi medici, prevenendo indicazioni più ampie. Pertanto, sollevare la barriera immunitaria nella VCA è essenziale per ribaltare la scala etica e migliorare la qualità della vita dei pazienti utilizzando le tecniche chirurgiche più avanzate. La creazione de novo di un innesto specifico per il paziente è l'imminente svolta nel trapianto ricostruttivo. Utilizzando tecniche di ingegneria tissutale, i VCA possono essere liberati dalle cellule donatrici e personalizzati per il ricevente attraverso perfusione-decellularizzazione-ricellularizzazione. Per sviluppare queste nuove tecnologie, è necessario un modello VCA animale su larga scala. Quindi, i lembi fascio-cutanei suini, composti da pelle, grasso, fascia e vasi, rappresentano un modello ideale per studi preliminari in VCA. Tuttavia, la maggior parte dei modelli VCA descritti in letteratura includono muscoli e ossa. Questo lavoro riporta una tecnica affidabile e riproducibile per la raccolta di lembo fascio-cutaneo safeno nei suini, uno strumento pratico per vari campi di ricerca, in particolare l'ingegneria dei tessuti compositi vascolarizzati.

Gli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA) hanno rivoluzionato il trattamento delle perdite di parti del corpo difficili da riparare, come mani, viso e pene ^1,2,3. Sfortunatamente, i primi risultati a lungo termine⁴ hanno dimostrato che la somministrazione permanente di agenti immunosoppressori ad alte dosi può portare a gravi condizioni mediche collaterali, tra cui diabete, infezioni, neoplasie e disfunzione reno-vascolare⁵. Ultimamente, team esperti di VCA hanno dovuto gestire il rischio di rigetto cronico che porta alla perdita del trapianto ed eseguire i primi casi di trapianto facciale ^6,7. Sono state descritte diverse strategie per superare i limiti dell'immunosoppressione nella VCA. Il primo si basa sulla determinazione della tolleranza all'innesto a lungo termine inducendo uno stato di chimerismo misto immunitario nel ricevente di allotrapianto ^8,9. Il secondo prevede la creazione de novo di un innesto specifico per il paziente tramite ingegneria tissutale.

Recentemente, la decellularizzazione per perfusione di tessuti biologici ha generato scaffold nativi della matrice extracellulare (ECM), consentendo la conservazione della rete vascolare e dell'architettura tissutale di interi organi¹⁰. Quindi, la ricellularizzazione di queste ECM con cellule specifiche del ricevente creerebbe un innesto personalizzato privo di vincoli immunitari. Nella ricerca sulla bioingegneria VCA, più team hanno decellularizzato e ottenuto tale ECM preservando l'intera architettura^11,12,13. Tuttavia, il processo di ricellularizzazione rimane impegnativo e non ha avuto successo nei modelli animali di grandi dimensioni^14,15. Lo sviluppo di queste tecnologie innovative crea la necessità di modelli di tessuti compositi animali affidabili e riproducibili. I modelli suini rappresentano la scelta massima nella pipeline di sviluppo della bioingegneria, poiché la pelle suina presenta le caratteristiche anatomiche e fisiologiche più vicine alla pelle umana¹⁶. L'utilizzo dei lembi fascio-cutanei (FCF) è ideale durante i primi passi verso la creazione di innesti di tessuto composito vascolarizzato "su misura". Infatti, FCF è un modello elementare VCA contenente pelle, grasso, fascia e cellule endoteliali. Una descrizione dei lembi miocutanei suini¹⁷ e dei lembi osteomiocutanei¹⁸ può essere trovata in letteratura. Tuttavia, vi è una mancanza di attenzione alle tecniche di raccolta dei lembi fascio-cutanei.

Pertanto, questo studio mira a fornire ai ricercatori una descrizione dettagliata di una tecnica di approvvigionamento FCF safena suina e descrivere tutte le caratteristiche del lembo per il suo utilizzo in molti campi di ricerca, in particolare nell'ingegneria dei tessuti compositi vascolarizzati.

Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane seguendo la Guida del National Institute of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali ha approvato il protocollo sperimentale (protocollo IACUC #2020N000015). Sette femmine di maiali dello Yorkshire (20-25 kg) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti.

1. Cure preoperatorie

1. Digiunare l'animale per il cibo solido 12 ore prima dell'intervento.
2. Sedare l'animale con 4,4 mg/kg di telazolo, 2,2 mg/kg di xilazina e 0,04 mg/kg (IM) di atropina solfato (vedere Tabella dei materiali).
3. Posizionare un catetere endovenoso periferico da 18 G in una vena dell'orecchio.
4. Intubare i suini con un tubo endotracheale appropriato (6-15 mm possono essere utilizzati per suini da 10-200 kg) e collegare il tubo a un ventilatore. Somministrare l'analgesia preoperatoria con buprenorfina (0,05 mg/kg, IM) (vedere Tabella dei materiali).

2. Monitoraggio intraoperatorio

1. Mantenere l'anestesia con una miscela per inalazione di isoflurano all'1,5%-3% con flusso di ossigeno di 1,5 L/min.
2. Monitorare continuamente la frequenza cardiaca, la pulsossimetria e la CO₂ di fine marea. Valutare la pressione sanguigna e la temperatura corporea ogni 5 minuti.
   NOTA: L'intervallo target per la frequenza cardiaca è compreso tra 90-100 battiti / min, la saturazione di ossigeno deve essere superiore al 93% e l'intervallo CO 2 di fine marea è compreso tra il 5% -6% di CO₂.
3. Somministrare 5-10 ml/kg all'ora di soluzione salina allo 0,9% durante tutta la procedura per regolare la pressione arteriosa media tra 60 mmHg e 90 mmHg.

3. Approvvigionamento bilaterale safeno FCF

1. Metti l'animale in posizione supina. Rasare e strofinare sia l'inguine che gli arti posteriori, includere l'intero arto posteriore nel sito chirurgico e drappeggiare in modo sterile.
2. Palpare il polso dell'arteria safena ~ 3 dita di larghezza mediale dalla rotula e taggarlo.
3. Identificare e disegnare i limiti del lembo.
   NOTA: Il limite superiore è un asse parallelo alla piega inguinale 3 cm sotto di esso. Il limite laterale è un asse dalla spina iliaca superiore anteriore alla parte mediale della rotula.
4. Disegnare un lembo ovale di 10 cm di diametro centrato sul peduncolo safeno e contenuto nei limiti del lembo precedentemente descritti (punto 3.3).
5. Fare un'incisione cutanea di 1,5 cm per quanto riguarda la porzione distale del peduncolo sul punto di riferimento del lembo.
6. Aprire la fascia e sezionare smussata per esporre l'arteria safena e le sue due vene comitanti. Eseguire una doppia legatura e separare in un fascio.
7. Incidi la pelle rimanente del lembo con una lama.
8. Utilizzare cauterizzazione per aprire il tessuto sottocutaneo e la fascia circostante. Eseguire un'emostasi completa utilizzando una pinza bipolare (vedere la tabella dei materiali).
9. Attaccare la componente cutanea del lembo alla fascia sottostante con punti di sutura 3-0 non assorbibili per evitare la trazione involontaria e l'interruzione dei vasi perforanti.
10. Liberare il lembo dal gracile sezionando la fascia lontano dal muscolo.
    NOTA: La parte distale del peduncolo safeno corre su un piano tra il muscolo gracile e la fascia. Una tensione appropriata e una cauta emostasi bipolare dei rami laterali sono elementi cruciali per facilitare la dissezione del peduncolo.
11. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione di 12 cm nella piega inguinale. Eseguire un'incisione perpendicolare unendo la piega inguinale alla parte prossimale del lembo. Sollevare la pelle di collegamento e aprire lo strato sottocutaneo usando la cauterizzazione.
12. Continuare la dissezione del peduncolo seguendo i vasi safeni verso i vasi femorali.
    NOTA: La porzione prossimale del peduncolo safeno può attraversare il setto intermuscolare o immergersi nel muscolo gracili.
13. Scheletrizzare i vasi femorali e ligarli distalmente al ramo safeno in due fasci separati. Continuare la dissezione dei vasi femorali da distale a prossimale fino a raggiungere il livello del legamento inguinale. Usa una pinza bipolare per cauterizzare o clip vascolari e cravatte di seta 2-0 per legare i vasi femorali profondi, quindi tagliare.
    NOTA: Le clip vascolari possono essere utilizzate anche prima di tagliare i vasi.
14. Ripetere i passaggi 3.2-3.13 sull'arto posteriore controlaterale per raccogliere il secondo lembo safeno.
15. Eparinizzare l'animale con un'iniezione endovenosa (IV) di eparina (100 UI/kg) 5 minuti prima del punto 3.16.
16. Ligare il peduncolo femorale (arteria e vena) il più possibile prossimale al legamento inguinale e separare il lembo dal maiale donatore.
17. Dilatare le estremità del vaso femorale e inserire un angiocatetere da 20 G sia nell'arteria che nella vena. Utilizzare cravatte di seta 3-0 per fissare il catetere ai vasi.
18. Lavare lentamente l'arteria del lembo fascio-cutaneo con 10 ml di soluzione salina di eparina (100 UI/ml) fino a quando non si osserva un chiaro deflusso venoso (Figura 1).

Figura 1: Lembo fascio-cutaneo safeno nativo e decellularizzato. (A) Lembo cutaneo isolato con un angiocatetere da 20 G inserito nell'arteria femorale, che permette di lavare il lembo dal sangue e procedere con diversi esperimenti (angiografia, decellularizzazione di perfusione). (B) Lembo cutaneo decellularizzato. Decellularizzazione della perfusione che produce scaffold bianchi acellulari dopo 10 giorni di perfusione detergente. Sezioni trasversali a tutto spessore colorate con H&E di lembo cutaneo nativo (C) e lembo cutaneo decellularizzato (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

19. Eutanasia dell'animale con un'iniezione endovenosa di fenobarbital di sodio (100 mg/kg). Confermare la morte per l'assenza di battito cardiaco e movimenti respiratori.

Questo lavoro su animali vivi è stato preceduto dalla determinazione del perforasoma safeno su tre campioni cadaverici (Figura 2). Una soluzione di riempimento colorata è stata iniettata nell'arteria safena per opacizzare la specifica rete vascolare proveniente dall'arteria. La soluzione è composta da 10 mL di agente glicerina di colore blu miscelato con 10 mL di agente diluente (vedere Tabella dei materiali). Ciò ha generato una mappa colorata della pelle vascolarizzata dall'arteria safena e ha permesso di tracciare i limiti della FCF safena.

Figura 2: Determinazione dei perforasomi. Una soluzione colorata di limatura è stata iniettata nell'arteria safena di campioni cadaverici per determinare con precisione i limiti della pelle perfusa dal peduncolo safeno Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo studio sono stati raccolti un totale di 14 lembi fasciocutanei safeni (Tabella 1). Il tempo medio di approvvigionamento dei flap è stato di 47 (41; 62) min. I diametri medi dell'arteria e delle vene erano rispettivamente di 2,25 mm (2; 2,5) e 3,56 mm (2,7; 3,9). Infine, la lunghezza media del peduncolo era di 10,8 cm (10,4; 12,6).

Tabella 1: Caratteristiche dei lembi safeni sulla base di 14 raccolti di lembi.

Un'angiografia FCF (Figura 3) è stata eseguita dopo ogni prelievo di lembo attraverso l'iniezione intraarteriosa di 10 ml di prodotto di contrasto immediatamente dopo il lavaggio salino dell'eparina. Pertanto, questo passaggio ha permesso di valutare la vascolarizzazione della pagaia cutanea. Tutte le immagini angiografiche hanno mostrato una rete vascolare densa e ben distribuita sul lembo.

Figura 3: Angiografia del lembo fascio-cutaneo safena. Un prodotto di contrasto è stato iniettato attraverso l'arteria femorale, mostrando una fitta rete vascolare safena. Scala in centimetri. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

I lembi sono stati quindi sottoposti al protocollo di decellularizzazione personalizzato¹¹. I lembi sono stati perfusi utilizzando la perfusione della macchina a pressione controllata, fornendo un flusso continuo utilizzando questo protocollo. Con una pressione target di 80 mmHg, il flusso di PBS, SDS e Triton X era limitato a una velocità massima di 3,1 mL/min. Non è stato notato alcun consumo di ossigeno poiché il sistema di perfusione era dedicato alla detersione delle cellule del lembo. Questo protocollo ha portato a un'efficace decellularizzazione di tutti i tessuti (Figura 1), come confermato dall'assenza di DNA in tutti i campioni di tessuto.

Questo articolo descrive un lembo fasciocutaneo affidabile e riproducibile raccolto sugli arti posteriori dei suini. Seguendo questo protocollo chirurgico passo-passo sarà possibile l'approvvigionamento di due lembi su un solo animale in meno di 2 ore. Il passo più critico dell'intervento chirurgico è la scheletrizzazione del peduncolo vascolare all'interno delle fibre muscolari gracili, che richiede una dissezione approfondita da parte di un chirurgo esperto. Fissare la pelle alla fascia utilizzando suture cutanee è un suggerimento cruciale per evitare un effetto di taglio che interrompe i vasi del perforatore e una successiva devascolarizzazione cutanea del lembo. Le caratteristiche del safeno FCF (lungo peduncolo vascolare, discreti calibri di vasi) e la sua affidabilità lo rendono un modello ideale per molti campi di ricerca.

Diversi team hanno dimostrato interesse per questo modello in un protocollo di bioingegneria della pelle mediante decellularizzazione e ricellularizzazione¹¹. L'assenza di muscoli è stato un punto cardine nell'implementazione di un protocollo di bioingegneria. Quindi, abbiamo cercato lembi fasciocutanei situati sull'arto anteriore, sulla parte centrale della schiena, sulla coscia o sull'inguine dove il pannicolo carnoso (sottile strato muscolare che divide gli strati di grasso superficiale e profondo nei suini) è carente¹⁹. In esperimenti preliminari, i lembi cutanei addominali basati sull'arteria epigastrica superiore profonda sono stati raccolti seguendo i protocolli precedentemente pubblicati^20,21,22. Tuttavia, il piccolo diametro dei vasi, la tecnica di raccolta più difficile e la presenza del panniculus carnosus rappresentavano notevoli svantaggi. Il protocollo sperimentale mediante decellularizzazione per perfusione ha rivelato incongruenze nella perfusione cutanea attraverso i perforatori che apparivano troppo piccoli e / o feriti durante l'intervento.

Questo lembo è stato utilizzato anche per studiare le vie meccanicistiche coinvolte nel rigetto immunitario di innesti cutanei vascolarizzati, essendo la pelle la componente più immunogenica in VCA ^8,23. Utilizzando questo modello, l'impatto della componente cutanea nella tolleranza al trapianto è stato valutato con precisione.

Inoltre, questa procedura dettagliata può anche servire come modello pre-clinico in altri ambiti della ricerca. La FCF safena potrebbe valutare le lesioni da ischemia-riperfusione su un grande modello di pelle animale più vicino a un essere umano. Infine, potrebbe anche essere utile per la conservazione della perfusione della macchina VCA ex-vivo e aiutare a determinare i migliori parametri di perfusione per mantenere la vitalità della pelle prima del trapianto²⁴.

Per concludere, questa accurata descrizione di una tecnica di approvvigionamento di flap affidabile e riproducibile offre uno strumento prezioso per gli studi di bioingegneria VCA nei suini.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni Shriners Hospitals for Children #85127 (BEU e CLC) e #84702 (AA). Gli autori desiderano ringraziare la fondazione "Gueules Cassées" per il sostegno salariale ai borsisti coinvolti in quel progetto.