一种用于血管化复合同种异体移植物生物工程研究的可靠猪筋膜-皮肤皮瓣模型

本协议描述了猪筋膜 - 皮肤皮瓣模型及其在血管化复合组织研究中的潜在用途。

血管化复合同种异体移植物（VCA），如手、面部或移植，代表了破坏性皮肤缺陷的尖端治疗方法，在重建阶梯的第一步中失败了。尽管美学和功能结果有希望，但主要限制因素仍然是需要大量应用终身免疫抑制及其众所周知的医疗风险，从而阻止更广泛的适应症。因此，解除VCA中的免疫屏障对于使用最先进的手术技术打破道德规模和改善患者的生活质量至关重要。患者特异性移植物的 从头 创建是重建移植即将取得的突破。使用组织工程技术，VCA可以释放供体细胞，并通过灌注-去细胞化-再细胞化为受体定制。为了开发这些新技术，需要大规模的动物VCA模型。因此，由皮肤、脂肪、筋膜和血管组成的猪筋膜皮肤皮瓣是VCA初步研究的理想模型。然而，文献中描述的大多数VCA模型包括肌肉和骨骼。这项工作报告了一种可靠且可重复的猪大隐筋膜皮肤皮瓣收获技术，是各种研究领域，特别是血管化复合组织工程的实用工具。

血管化复合同种异体移植物（VCA）彻底改变了难以修复的身体部位损失的治疗，例如手，脸和阴茎¹，^2，3。不幸的是，最初的长期结果⁴表明，终身服用高剂量免疫抑制剂可导致严重的附带疾病，包括糖尿病，感染，肿瘤形成和肾血管功能障碍⁵。最近，VCA专家团队不得不管理导致移植物丢失的慢性排斥反应的风险，并执行第一个面部再移植病例^6，7。已经描述了不同的策略来克服VCA中免疫抑制的局限性。第一种依赖于通过在同种异体^{移植受体中}诱导免疫混合嵌合状态来建立长期移植耐受性8^，9。第二种涉及通过组织工程从头创建患者特异性移植物。

最近，生物组织的灌注脱细胞化产生了天然细胞外基质（ECM）支架，允许保存整个器官的血管网络和组织结构¹⁰。因此，用受体特异性细胞对这些ECM进行再细胞化将产生不受免疫限制的定制移植物。在VCA生物工程的研究中，多个团队已经去细胞化并获得了保留整个架构的^ECM11，^12，13。然而，细胞再生过程仍然具有挑战性，并且在大型动物模型中尚未成功^14，15。开发这些突破性技术需要可靠且可重复的大型动物复合组织模型。猪模型代表了生物工程开发管道中的最佳选择，因为猪皮肤呈现出最接近人类皮肤的解剖学和生理特征¹⁶。在创建"定制"血管化复合组织移植物的第一步中，使用筋膜皮肤瓣（FCF）是理想的选择。事实上，FCF是一种包含皮肤，脂肪，筋膜和内皮细胞的基本VCA模型。猪肌皮肤皮瓣¹⁷和骨肌皮肤皮瓣¹⁸的描述可以在文献中找到。尽管如此，对筋膜-皮肤皮瓣收获技术缺乏关注。

因此，本研究旨在为研究人员提供猪隐形FCF采购技术的详细描述，并描述其在许多研究领域的所有特征，特别是在血管化复合组织工程中。

所有动物都按照国家卫生研究所实验动物护理和使用指南接受人类护理。机构动物护理和使用委员会批准了实验方案（IACUC-协议#2020N000015）。所有实验均使用七只雌性约克郡猪（20-25公斤）。

1.术前护理

1. 手术前12小时禁食动物以获取固体食物。
2. 用4.4mg / kg特拉唑，2.2mg / kg甲苯噻嗪和0.04mg / kg（IM）硫酸阿托品镇静动物（见 材料表）。
3. 将 18 G 外周静脉导管置于耳静脉中。
4. 用适当的气管插管插管猪（6-15毫米可用于10-200公斤猪）并将管子连接到呼吸机。用丁丙诺啡（0.05mg / kg，IM）进行术前镇痛（见 材料表）。

2.术中监测

1. 用1.5%-3%异氟醚和1.5L / min氧气流量的吸入混合物维持麻醉。
2. 持续监测心率、脉搏血氧饱和度和潮气末 CO₂。每5分钟评估一次血压和体温。
   注意:心率的目标范围在 90-100 次/分钟之间，血氧饱和度必须高于 93%，潮气末 CO 2 范围在_{CO 2} 的 5%-6% 之间。
3. 在整个手术过程中每小时给予 5-10 mL/kg0.9% 盐水，以调节平均动脉压在 60 mmHg 和 90 mmHg 之间。

3. 双边隐形FCF采购

1. 将动物置于仰卧位。剃须和擦洗腹股沟和后肢，包括手术部位的整个后肢，并以无菌方式悬垂。
2. 触诊隐动脉脉搏~3指宽的内侧距髌骨并标记它。
3. 识别并绘制襟翼的界限。
   注意:上限是平行于其下方 3 厘米的腹股沟折痕的轴。外侧极限是从髂前上棘到髌骨内侧的轴。
4. 画一个直径为10厘米的椭圆形皮瓣，以隐蒂为中心，并包含在前面描述的皮瓣限制中（步骤3.3）。
5. 在皮瓣标志的椎弓根远端做一个 1.5 cm 的皮肤切口。
6. 打开筋膜和钝性解剖，露出隐动脉及其两个静脉导管。进行双连字并在一束中分开。
7. 用刀片切开皮瓣的剩余皮肤。
8. 使用烧灼术打开皮下组织和周围的筋膜。使用双极镊子进行彻底止血（见 材料表）。
9. 用 3-0 条不可吸收的缝合线将皮瓣的皮肤成分连接到下面的筋膜上，以避免无意中牵引和穿孔血管的破坏。
10. 通过将筋膜从肌肉上解剖出来，将皮瓣从肌烬上释放出来。
    注意:隐蒂的远端部分在腹股沟肌和筋膜之间的平面上延伸。适当的张力和谨慎的侧枝双相止血是缓解椎弓根夹层的关键因素。
11. 用手术刀在腹股沟折痕处做一个12厘米的切口。进行垂直切口，将腹股沟折痕连接到皮瓣的近端。抬开连接皮肤，用烧灼术打开皮下层。
12. 继续椎弓根清扫，沿着隐血管向下朝股血管方向移动。
    注意:隐蒂的近端部分可以穿过肌间隔或潜入肌束肌。
13. 将股骨血管骨架化，并将它们远端结扎到大隐支上，分成两束。继续从远端到近端解剖股血管，直到达到腹股沟韧带的水平。使用双极镊子烧灼或血管夹和 2-0 丝带结扎深股血管，然后切断。
    注意:在切割血管之前也可以使用血管夹。
14. 在对侧后肢重复步骤3.2-3.13以收获第二个隐瓣。
15. 在步骤3.16之前5分钟用静脉内（IV）肝素注射液（100IU / kg）使动物肝素化。
16. 尽可能在腹股沟韧带近端结扎股骨蒂（动脉和静脉），并将皮瓣与供体猪分开。
17. 扩张股血管末端，并在动脉和静脉中插入 20 G 血管导管。使用3-0丝带将导管固定在血管上。
18. 用10mL肝素盐水（100IU / mL）缓慢冲洗筋膜 - 皮肤皮瓣动脉，直到观察到清晰的静脉流出（图1）。

图 1:天然和去细胞化的隐性筋膜皮肤皮瓣。 （A）孤立的皮瓣，在股动脉中插入20G血管导管，允许从血液中清洗皮瓣并进行不同的实验（血管造影，灌注脱细胞）。（B）去细胞化皮瓣。灌注脱细胞在洗涤剂灌注 10 天后产生白色无细胞支架。H&E染色的（C）天然皮瓣和（D）脱细胞皮瓣的全层横截面。 请点击此处查看此图的大图。

19. 用静脉注射苯巴比妥钠（100mg / kg）对动物实施安乐死。通过无心跳和呼吸运动来确认死亡。

在对活体动物进行这项工作之前，确定了三个尸体标本上的隐孔体（图2）。将彩色填充溶液注入隐动脉，以遮盖来自动脉的特定血管网络。该溶液由10mL蓝色甘油剂与10mL稀释剂混合而成（见 材料表）。这生成了由隐动脉血管化的皮肤的彩色图，并允许绘制隐动脉的界限。

图 2:穿孔小体测定。 在尸体标本的大隐动脉中注射彩色锉状溶液，以精确确定大隐椎弓根灌注的皮肤极限 请点击此处查看此图的大图。

本研究共收获了14个隐性筋膜皮瓣（表1）。平均襟翼采购时间为 47 （41; 62） 分钟。平均动脉和静脉直径分别为2.25毫米（2;2.5）和3.56毫米（2.7;3.9）。最后，平均椎弓根长度为10.8厘米（10.4;12.6）。

表1:基于14次皮瓣收获的隐形瓣特性。

每次皮瓣收获后，在肝素盐水冲洗后立即通过动脉内注射10mL造影剂进行FCF血管造影（图3）。因此，该步骤能够评估皮肤桨的血管化。所有血管造影图像均显示皮瓣上存在致密且分布良好的血管网络。

图 3:大隐性筋膜皮肤皮瓣血管造影。 通过股动脉注射造影剂，显示致密的隐血管网络。以厘米为单位。 请点击此处查看此图的大图。

然后将皮瓣进行定制的脱细胞方案¹¹。使用压力控制的机器灌注瓣，使用该协议提供连续的流动。当目标压力为 80 mmHg 时，PBS、SDS 和 Triton X 的流量限制在 3.1 mL/min 的最大速度。没有注意到氧气消耗，因为灌注系统专用于皮瓣细胞的去化。该方案导致所有组织的有效去细胞化（图1），正如所有组织样本中没有DNA所证实的那样。

本文描述了一种在猪后肢上收获的可靠且可重复的筋膜皮瓣。遵循此分步手术方案将允许在不到2小时的时间内仅在一只动物上获得两个皮瓣。手术最关键的一步是肌细肌纤维内血管蒂的骨骼化，这需要熟练的外科医生进行彻底解剖。使用皮肤缝合线将皮肤固定在筋膜上是避免剪切效应破坏穿支血管和随后皮瓣皮肤血管化的关键提示。隐形FCF（长血管蒂，血管口径适中）的特性及其可靠性使其成为许多研究领域的理想模型。

几个团队已经通过去细胞化和再细胞化在皮肤生物工程方案中表现出对该模型的兴趣¹¹。肌肉的缺失是实施生物工程协议的关键点。因此，我们寻找位于前肢、中背部、大腿或腹股沟的筋膜皮瓣，其中缺乏肉囊（将猪的浅层和深层脂肪层分开的薄肌肉层）¹⁹。在初步实验中，按照先前发表的方案^20，21，22收获基于上腹部深动脉的腹部皮瓣。然而，血管直径小，收获技术更困难，以及肉牛脂的存在代表了显着的缺点。通过灌注去细胞化的实验方案揭示了通过穿支器进行的皮肤灌注不一致，这些穿支器在手术过程中显得太小和/或受伤。

该皮瓣还用于研究参与血管化皮肤移植物免疫排斥的机制途径，皮肤是VCA^8，23中最具免疫原性的成分。使用该模型，可以精确评估皮肤成分对移植耐受性的影响。

此外，这种详细的程序也可以作为其他研究领域的临床前模型。隐型FCF可以在更接近人类的大型动物皮肤模型上评估缺血再灌注损伤。最后，它还可能有助于 离体 VCA机器灌注保存，并有助于确定最佳灌注参数，以在移植前保持皮肤活力²⁴。

总而言之，这种对可靠且可重复的皮瓣采购技术的准确描述为猪的VCA生物工程研究提供了有价值的工具。

作者没有什么可透露的。

这项工作由Shriners儿童医院拨款#85127（BEU和CLC）和#84702（AA）资助。作者要感谢"Gueules Cassées"基金会为参与该项目的研究员提供的工资支持。