Ein zuverlässiges schweinisches Faszien-Hautlappenmodell für vaskularisierte Komposit-Allografts Bioengineering-Studien

Das vorliegende Protokoll beschreibt das schweinische Modell des faszio-kutanen Lappens und seine mögliche Verwendung in der vaskularisierten Kompositgewebeforschung.

Vaskularisierte Composite Allografts (VCA) wie Hand-, Gesichts- oder Penistransplantationen stellen die modernste Behandlung für verheerende Hautdefekte dar, die durch die ersten Schritte der rekonstruktiven Leiter versagt haben. Trotz vielversprechender ästhetischer und funktioneller Ergebnisse bleibt der wichtigste limitierende Faktor die Notwendigkeit einer drastisch angewandten lebenslangen Immunsuppression und ihrer bekannten medizinischen Risiken, die breitere Indikationen verhindern. Daher ist die Aufhebung der Immunbarriere bei VCA unerlässlich, um die ethische Waage zu kippen und die Lebensqualität der Patienten mit den fortschrittlichsten chirurgischen Techniken zu verbessern. Die de novo Entwicklung eines patientenspezifischen Transplantats ist der bevorstehende Durchbruch in der rekonstruktiven Transplantation. Mit Hilfe von Tissue Engineering-Techniken können VCAs von Spenderzellen befreit und durch Perfusion-Dezellularisierung-Rezellularisierung auf den Empfänger zugeschnitten werden. Um diese neuen Technologien zu entwickeln, ist ein groß angelegtes Tier-VCA-Modell notwendig. Daher stellen Schweinefaszio-kutane Lappen, bestehend aus Haut, Fett, Faszien und Gefäßen, ein ideales Modell für Vorstudien in VCA dar. Dennoch umfassen die meisten VCA-Modelle, die in der Literatur beschrieben werden, Muskeln und Knochen. Diese Arbeit berichtet von einer zuverlässigen und reproduzierbaren Technik für die saphenöse faszio-kutane Lappenernte bei Schweinen, ein praktisches Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche, insbesondere vaskularisiertes zusammengesetztes Tissue Engineering.

Vaskularisierte Komposit-Allotransplantate (VCA) haben die Behandlung von schwer zu reparierenden Körperteilverlusten wie Händen, Gesicht und Penis revolutioniert ^1,2,3. Leider haben die ersten Langzeitergebnisse⁴ gezeigt, dass die lebenslange Verabreichung von hochdosierten Immunsuppressiva zu schweren Begleiterkrankungen führen kann, einschließlich Diabetes, Infektionen, Neoplasien und renovaskulärer Dysfunktion⁵. In letzter Zeit mussten VCA-Expertenteams das Risiko einer chronischen Abstoßung, die zu einem Transplantatverlust führt, bewältigen und die ersten Gesichtsretransplantationsfälle durchführen ^6,7. Verschiedene Strategien wurden beschrieben, um die Einschränkungen der Immunsuppression bei VCA zu überwinden. Die erste beruht auf der Herstellung einer langfristigen Transplantattoleranz durch Induktion eines immungemischten Chimärismuszustands beim Allograftempfänger ^8,9. Die zweite beinhaltet de novo die Erstellung eines patientenspezifischen Transplantats durch Tissue Engineering.

In jüngster Zeit hat die Perfusionsdezellularisierung von biologischem Gewebe native extrazelluläre Matrix (ECM) -Gerüste erzeugt, die die Erhaltung des vaskulären Netzwerks und der Gewebearchitektur ganzer Organe ermöglichen¹⁰. Daher würde die Rezellularisierung dieser ECM mit empfängerspezifischen Zellen ein maßgeschneidertes Transplantat ohne Immunbeschränkungen schaffen. In der Forschung zum VCA-Bioengineering haben mehrere Teams ein solches ECM dezellularisiert und erhalten, wobei die gesamte Architektur erhalten^{wurde 11,12,13}. Der Rezellularisierungsprozess bleibt jedoch schwierig und war in Großtiermodellen nicht erfolgreich^14,15. Die Entwicklung dieser bahnbrechenden Technologien erfordert zuverlässige und reproduzierbare Gewebemodelle für große Tiere. Schweinemodelle stellen die erste Wahl in der biotechnischen Entwicklungspipeline dar, da Schweinehaut der menschlichen Haut die nächsten anatomischen und physiologischen Eigenschaften aufweist¹⁶. Die Verwendung von fasziokutanen Lappen (FCF) ist ideal für die ersten Schritte zur Herstellung von "maßgeschneiderten" vaskularisierten Kompositgewebetransplantaten. Tatsächlich ist FCF ein elementares VCA-Modell, das Haut-, Fett-, Faszien- und Endothelzellen enthält. Eine Beschreibung der myokutanen Schweinelappen¹⁷ und osteomyokutanen Lappen¹⁸ findet sich in der Literatur. Dennoch fehlt der Fokus auf faszio-kutane Klappenerntetechniken.

Daher zielt diese Studie darauf ab, den Forschern eine detaillierte Beschreibung einer Schweine-Stamm-FCF-Beschaffungstechnik zu liefern und alle Eigenschaften der Klappe für ihren Einsatz in vielen Forschungsbereichen darzustellen, insbesondere im vaskularisierten zusammengesetzten Tissue Engineering.

Alle Tiere erhielten menschliche Pflege gemäß dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Das Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte das Versuchsprotokoll (IACUC-Protokoll #2020N000015). Für alle Experimente wurden sieben weibliche Yorkshire-Schweine (20-25 kg) verwendet.

1. Präoperative Versorgung

1. Fasten Sie das Tier 12 h vor der Operation auf feste Nahrung.
2. Sediert das Tier mit 4,4 mg/kg Telazol, 2,2 mg/kg Xylazin und 0,04 mg/kg (IM) Atropinsulfat (siehe Materialtabelle).
3. Legen Sie einen 18 G peripheren intravenösen Katheter in eine Ohrvene.
4. Intubieren Sie die Schweine mit einem geeigneten Endotrachealtubus (6-15 mm können für 10-200 kg Schweine verwendet werden) und schließen Sie den Schlauch an ein Beatmungsgerät an. Präoperative Analgesie mit Buprenorphin (0,05 mg/kg, IM) verabreichen (siehe Materialtabelle).

2. Intraoperative Überwachung

1. Halten Sie die Anästhesie mit einer Inhalationsmischung von 1,5% -3% Isofluran mit 1,5 l / min Sauerstofffluss aufrecht.
2. Überwachen Sie kontinuierlich die Herzfrequenz, die Pulsoximetrie und das endtidale CO₂. Beurteilen Sie Blutdruck und Körpertemperatur alle 5 Minuten.
   HINWEIS: Der Zielbereich für die Herzfrequenz liegt zwischen 90-100 Schlägen / min, die Sauerstoffsättigung muss höher als 93% sein und der endtidale CO 2-Bereich liegt zwischen 5% -6% von CO₂.
3. Verabreichen Sie 5-10 ml / kg pro Stunde 0,9% Kochsalzlösung während des gesamten Verfahrens, um den mittleren arteriellen Druck zwischen 60 mmHg und 90 mmHg zu regulieren.

3. Bilaterale Beschaffung von FCF

1. Legen Sie das Tier in Rückenlage. Rasieren und schrubben Sie beide Leisten und Hinterbeine, schließen Sie die gesamten Hinterbeine in die Operationsstelle ein und drapieren Sie sie steril.
2. Palpieren Sie den Puls der Arteria saphena ~3 Fingerbreiten medial von der Patella und markieren Sie ihn.
3. Identifizieren und zeichnen Sie die Grenzen der Klappe.
   HINWEIS: Die obere Grenze ist eine Achse parallel zur Leistenfalte 3 cm darunter. Die laterale Grenze ist eine Achse von der vorderen oberen Beckenwirbelsäule zum medialen Teil der Patella.
4. Zeichnen Sie einen ovalen Lappen mit einem Durchmesser von 10 cm, der auf dem Stammstiel zentriert ist und in den zuvor beschriebenen Klappengrenzen enthalten ist (Schritt 3.3).
5. Machen Sie einen 1,5 cm Hautschnitt in Bezug auf den distalen Teil des Pedikels auf dem Lappen-Wahrzeichen.
6. Öffnen Sie die Faszie und sezieren Sie stumpf, um die Arteria saphena und ihre beiden Venae comitantes freizulegen. Führen Sie eine doppelte Ligatur durch und trennen Sie sie in einem Bündel.
7. Schneiden Sie die restliche Haut des Lappens mit einer Klinge ein.
8. Verwenden Sie Kauter, um das Unterhautgewebe und die umgebende Faszie zu öffnen. Führen Sie eine gründliche Blutstillung mit einer bipolaren Pinzette durch (siehe Materialtabelle).
9. Befestigen Sie die Hautkomponente des Lappens mit 3-0 nicht resorbierbaren Nähten an der darunter liegenden Faszie, um ein versehentliches Traktion und eine Störung der perforierenden Gefäße zu vermeiden.
10. Befreien Sie den Lappen von der Grazilis, indem Sie die Faszie vom Muskel weg sezieren.
    HINWEIS: Der distale Teil des Stammstiels verläuft in einer Ebene zwischen dem Musculus gracilis und der Faszie. Eine angemessene Spannung und eine vorsichtige bipolare Hämostase der Seitenäste sind entscheidende Elemente, um die Pedikeldissektion zu erleichtern.
11. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 12 cm langen Schnitt in der Leistenfalte zu machen. Führen Sie einen senkrechten Schnitt durch, der die Leistenfalte mit dem proximalen Teil des Lappens verbindet. Heben Sie die verbindende Haut ab und öffnen Sie die Unterhautschicht mit Kauter.
12. Setzen Sie die Pedikeldissektion fort, indem Sie den Stammgefäßen in Richtung der Femurgefäße folgen.
    HINWEIS: Der proximale Teil des Stammstiels kann entweder durch das intermuskuläre Septum verlaufen oder in den Musculus gracilis eintauchen.
13. Skelettieren Sie die Femurgefäße und ligieren Sie sie distal zum Stammast in zwei separaten Bündeln. Setzen Sie die Dissektion der Femurgefäße von distal nach proximal fort, bis das Niveau des Leistenbandes erreicht ist. Verwenden Sie bipolare Pinzetten zum Kauterisieren oder vaskuläre Clips und 2-0 Seidenbinden, um die tiefen Femurgefäße zu ligieren, dann schneiden.
    HINWEIS: Gefäßclips können auch vor dem Schneiden der Gefäße verwendet werden.
14. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.13 an der kontralateralen Hinterbeine, um den zweiten Stammlappen zu entnehmen.
15. Heparinisieren Sie das Tier 5 min vor Schritt 3.16 mit einer intravenösen (IV) Heparininjektion (100 I.E./kg).
16. Ligieren Sie den Oberschenkelstiel (Arterie und Vene) möglichst proximal zum Leistenband und trennen Sie den Lappen vom Spenderschwein.
17. Erweitern Sie die Enden des Femurgefäßes und führen Sie einen 20 G Angiokatheter in Arterie und Vene ein. Verwenden Sie 3-0 Seidenbänder, um den Katheter an den Gefäßen zu befestigen.
18. Spülen Sie die Faszio-Hautlappenarterie langsam mit 10 ml Heparinkochsalzlösung (100 IE / ml), bis ein deutlicher venöser Abfluss beobachtet wird (Abbildung 1).

Abbildung 1: Nativer und dezellularisierter saphenöser faszio-kutaner Lappen . (A) Isolierter Hautlappen mit einem 20 G Angiokatheter, der in die Oberschenkelarterie eingeführt wird, so dass der Lappen aus dem Blut gewaschen und mit verschiedenen Experimenten (Angiographie, Perfusionsdezellularisierung) fortgefahren werden kann. (B) Dezellularisierter Hautlappen. Perfusionsdezellularisierung ergibt weiße, azelluläre Gerüste nach 10 Tagen Waschmittelperfusion. H&E-gefärbte Querschnitte in voller Dicke von (C) nativem Hautlappen und (D) dezellularisiertem Hautlappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

19. Euthanasieren Sie das Tier mit einer intravenösen Injektion von Natriumphenobarbital (100 mg / kg). Bestätigen Sie den Tod durch das Fehlen von Herzschlag und Atembewegungen.

Dieser Arbeit an lebenden Tieren ging die Bestimmung des saphenösen Perforasoms an drei Leichenproben voraus (Abbildung 2). Eine farbige Füllungslösung wurde in die Arteria saphena injiziert, um das spezifische vaskuläre Netzwerk aus der Arterie zu trüben. Die Lösung besteht aus 10 ml blau gefärbtem Glycerinmittel, gemischt mit 10 ml des Verdünnungsmittels (siehe Materialtabelle). Dies erzeugte eine farbige Karte der Haut, die von der Arteria saphena vaskularisiert wurde, und ermöglichte es, die Grenzen der Stammhaut FCF zu zeichnen.

Abbildung 2: Perforasom-Bestimmung. Eine farbige Feillösung wurde in die Saphenader von Leichenproben injiziert, um die Grenzen der vom Saphenstiel durchbluteten Haut genau zu bestimmen.

In dieser Studie wurden insgesamt 14 saphenöse fasziokutane Lappen entnommen (Tabelle 1). Die durchschnittliche Klappenbeschaffungszeit betrug 47 (41; 62) min. Die mittleren Arterien- und Venendurchmesser betrugen 2,25 mm (2; 2,5) bzw. 3,56 mm (2,7; 3,9). Schließlich betrug die mittlere Pedikellänge 10,8 cm (10,4; 12,6).

Tabelle 1: Eigenschaften der Saphenlappen basierend auf 14 Lappenernten.

Eine FCF-Angiographie (Abbildung 3) wurde nach jeder Lappenernte durch intraarterielle Injektion von 10 ml Kontrastmittel unmittelbar nach der Heparin-Kochsalzlösung durchgeführt. Dieser Schritt ermöglichte es, die Vaskularisierung des Hautpaddels zu beurteilen. Alle Angiographiebilder zeigten ein dichtes und gut verteiltes Gefäßnetz auf der Klappe.

Abbildung 3: Saphenöse faszio-kutane Lappenangiographie. Ein Kontrastmittel wurde durch die Oberschenkelarterie injiziert, das ein dichtes saphenöses Gefäßnetzwerk zeigte. Skalierung in Zentimetern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Klappen wurden dann dem benutzerdefinierten Dezellularisierungsprotokoll¹¹ unterzogen. Die Klappen wurden mittels druckgesteuerter Maschinenperfusion perfundiert und lieferten einen kontinuierlichen Durchfluss nach diesem Protokoll. Bei einem Zieldruck von 80 mmHg war der Durchfluss von PBS, SDS und Triton X auf eine maximale Geschwindigkeit von 3,1 ml/min begrenzt. Es wurde kein Sauerstoffverbrauch festgestellt, da das Perfusionssystem der Lappenzellenabschreckung gewidmet war. Dieses Protokoll führte zu einer effektiven Dezellularisierung aller Gewebe (Abbildung 1), was durch das Fehlen von DNA in allen Gewebeproben bestätigt wird.

Dieser Artikel beschreibt einen zuverlässigen und reproduzierbaren fasziokutanen Lappen, der an Schweinehinterbeinen geerntet wird. Nach diesem Schritt-für-Schritt-Operationsprotokoll können Sie in weniger als 2 Stunden zwei Lappen an nur einem Tier erhalten. Der kritischste Schritt der Operation ist die Skelettierung des Gefäßstiels innerhalb der Gracilis Muskelfasern, die eine gründliche Dissektion durch einen erfahrenen Chirurgen erfordert. Die Befestigung der Haut an der Faszie mit Hautnähten ist ein entscheidender Tipp, um einen Schereffekt zu vermeiden, der die Gefäße des Perforators stört und eine anschließende Devaskularisation des Lappens der Haut verursacht. Die Eigenschaften des saphenösen FCF (langer Gefäßstiel, anständige Kaliber der Gefäße) und seine Zuverlässigkeit machen ihn zu einem idealen Modell für viele Forschungsbereiche.

Mehrere Teams haben Interesse an diesem Modell in einem Hautbioengineering-Protokoll durch Dezellularisierung und Rezellularisierung gezeigt¹¹. Das Fehlen von Muskeln war ein entscheidender Punkt bei der Implementierung eines Bioengineering-Protokolls. Daher suchten wir nach fasziokutanen Lappen, die sich entweder an der Vordergliedmaße, dem mittleren Rücken, dem Oberschenkel oder der Leiste befinden, wo der Panniculus carnosus (dünne Muskelschicht, die die oberflächlichen und tiefen Fettschichten bei Schweinen trennt) fehlt¹⁹. In vorläufigen Experimenten wurden Bauchhautlappen basierend auf der Arteria epigastric deep superior nach den zuvor veröffentlichten Protokollen^20,21,22 entnommen. Der geringe Durchmesser der Gefäße, die schwierigere Erntetechnik und das Vorhandensein des Panniculus carnosus stellten jedoch erhebliche Nachteile dar. Das experimentelle Protokoll durch Perfusionsdezellularisierung zeigte Inkonsistenzen in der Hautperfusion durch die Perforatoren, die während der Operation zu klein und/oder verletzt erschienen.

Dieser Lappen wurde auch verwendet, um die mechanistischen Signalwege zu untersuchen, die an der Immunabstoßung von vaskularisierten Hauttransplantaten beteiligt sind, wobei die Haut die immunogenste Komponente in VCA ^8,23 ist. Mit diesem Modell wurde der Einfluss der Hautkomponente auf die Transplantattoleranz genau bewertet.

Darüber hinaus kann dieses detaillierte Verfahren auch als präklinisches Modell in anderen Forschungsbereichen dienen. Saphenous FCF könnte Ischämie-Reperfusionsverletzungen an einem großen Tierhautmodell näher an einem Menschen bewerten. Schließlich könnte es auch für die Ex-vivo-Perfusionskonservierung von VCA-Maschinen hilfreich sein und dazu beitragen, die besten Perfusionsparameter zu bestimmen, um die Lebensfähigkeit der Haut vor der Transplantation zu erhalten²⁴.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese genaue Beschreibung einer zuverlässigen und reproduzierbaren Klappenbeschaffungstechnik ein wertvolles Werkzeug für VCA-Bioengineering-Studien an Schweinen bietet.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch die Shriners Hospitals for Children-Zuschüsse #85127 (BEU und CLC) und #84702 (AA) finanziert. Die Autoren danken der Stiftung "Gueules Cassées" für die Gehaltsunterstützung der an diesem Projekt beteiligten Stipendiaten.