Un metodo semplice modificato per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi

In anestesia adeguata, il cuore del topo è stato esternalizzato attraverso lo spazio intercostale e l'infarto del miocardio è stato indotto con successo legando l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) utilizzando materiali prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori.

L'infarto del miocardio (IM) rappresenta una delle principali cause di morte. I modelli di infarto miocardico sono ampiamente utilizzati per lo studio dei meccanismi patogenetici del rimodellamento post-infarto miocardico e per la valutazione di nuove terapie. Diversi metodi (ad esempio, trattamento con isoproterenolo, criolesione, legatura dell'arteria coronarica, ecc.) sono stati utilizzati per indurre l'infarto miocardico. Rispetto al trattamento con isoproterenolo e al criolesione, la legatura dell'arteria coronaria può riflettere meglio la risposta ischemica e il rimodellamento cronico dopo l'infarto miocardico. Tuttavia, i metodi tradizionali per la legatura coronarica nei topi sono tecnicamente impegnativi. Il presente studio descrive un processo semplice ed efficiente per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi con materiali prontamente disponibili. La pelle del torace del topo è stata tagliata in anestesia stabile. Il cuore è stato immediatamente esternalizzato attraverso lo spazio intercostale dopo la separazione smussata del grande pettorale e del piccolo pettorale. Il ramo discendente anteriore sinistro (LAD) è stato legato con una sutura 6-0 a 3 mm dalla sua origine. Dopo la legatura del LAD, la colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) ha indicato l'induzione riuscita dell'infarto miocardico e i cambiamenti temporali delle dimensioni della cicatrice post-infarto del miocardio. Nel frattempo, i risultati dell'analisi di sopravvivenza hanno mostrato mortalità conclamata entro 7 giorni dall'infarto miocardico, principalmente a causa della rottura cardiaca. Inoltre, la valutazione ecocardiografica post-infarto del miocardio ha dimostrato il successo dell'induzione della disfunzione contrattile e del rimodellamento ventricolare. Una volta padroneggiato, un modello di MI può essere stabilito nei topi entro 2-3 minuti con materiali prontamente disponibili.

L'infarto del miocardio (IM) rappresenta una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo 1,2,3,4,5. Nonostante la riperfusione tempestiva, attualmente mancano terapie efficaci per trattare il rimodellamento cardiaco post-infarto miocardico. Di conseguenza, sono stati compiuti sforzi considerevoli per l'esplorazione meccanicistica e lo sfruttamento terapeutico per l'infarto miocardico ^6,7,8. Da notare che l'istituzione di modelli MI è un prerequisito per raggiungere questi obiettivi.

Diversi metodi (ad esempio, il trattamento con isoproterenolo, il criodanno, la legatura delle arterie coronarie, ecc.) sono stati proposti per indurre modelli di infarto miocardico in piccoli animali. Il trattamento con isoproterenolo è un metodo semplice per l'induzione dell'infarto del miocardio, ma non può indurre l'infarto dell'area bersaglio⁹. La criolesione porta alla necrosi miocardica attraverso la generazione di cristalli di ghiaccio e la rottura della membrana cellulare piuttosto che l'ischemia diretta¹⁰. Al contrario, la legatura delle arterie coronarie consente un controllo preciso del sito di occlusione e dell'estensione dell'area dell'infarto e ricapitola fedelmente la risposta di rimodellamento dopo l'infarto^11,12. La legatura delle arterie coronarie viene in genere eseguita dopo l'intubazione, la ventilazione meccanica e la toracotomia, che è tecnicamente impegnativa^13,14. Sono stati riportati diversi protocolli modificati per la legatura delle arterie coronarie (ad esempio, senza ventilazione) che hanno potenziato l'induzione dell'infarto miocardico, ma mancano dimostrazioni visive dettagliate^15,16,17. Questi problemi rappresentano un ostacolo finanziario e tecnico significativo per i gruppi che desiderano impegnarsi nella ricerca utilizzando i modelli MI. Questo rapporto presenta un approccio per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi. Il metodo attuale è semplice, fa risparmiare tempo e utilizza strumenti e attrezzature chirurgiche che si trovano facilmente nella maggior parte dei laboratori.

Gli esperimenti che coinvolgono il lavoro sugli animali sono eseguiti con tutte le approvazioni necessarie da parte del Comitato etico per il benessere degli animali da laboratorio dell'ospedale Renji, Università Jiao Tong di Shanghai, Facoltà di Medicina (R52021-0506). Nello studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J femmina e maschio di età compresa tra 8 e 10 settimane.

1. Preparazione dell'attrezzatura per anestesia semplificata (OPZIONALE)

NOTA: Si tratta di una configurazione preoperatoria opzionale e può essere sostituita con un'anestesia titolabile come indicato nella sezione 2. Il comitato etico istituzionale per gli animali e il veterinario o i veterinari dovrebbero essere consultati prima di adattare tale impostazione alle procedure sugli animali.

1. Prendi una provetta da centrifuga da 15 mL e fai un taglio perpendicolare all'asse lungo della provetta a circa 3 cm dall'apertura.
   NOTA: Assicurarsi che il taglio sia maggiore della metà della circonferenza circolare del lume del tubo in modo che la valvola possa essere inserita correttamente.
2. Praticare dei fori (diametro, 2 mm) sulla parete della provetta da centrifuga tra il taglio e l'apertura della provetta.
3. Tagliare un pezzo di valvola di dimensioni adeguate da un foglio di plastica e inserire la valvola nel taglio sulla parete del tubo.
   NOTA: La valvola può essere utilizzata per controllare la velocità di rilascio dell'isoflurano modificando la profondità di inserimento.
4. All'interno di una cappa aspirante, aprire il fondo del tubo e collegarlo all'alimentazione dell'ossigeno. Posizionare un batuffolo di cotone vicino all'estremità inferiore del tubo, aggiungere un carico di 0.5 mL di isoflurano (come ottenuto, vedere la tabella dei materiali) sul batuffolo di cotone e chiudere la valvola.
5. Testare l'efficacia dell'anestesia mascherando i topi con provette preparate come descritto sopra. Monitorare la frequenza respiratoria e la profondità dell'anestesia in base alla risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
   NOTA: Una frequenza respiratoria inferiore a 10 volte/10 s suggerisce un'anestesia eccessiva e la profondità di inserimento della valvola deve essere regolata. Per tutte le procedure che prevedono l'anestesia, è necessario utilizzare un filtro per gas riempito con fogli di carbone attivo (Figura 1A-i) e l'intervento chirurgico deve essere eseguito all'interno di una cappa.

2. Preparazione operatoria e anestesia

1. Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti necessari il giorno dell'intervento, tra cui un paio di pinze, un emostato per microzanzare, un paio di forbici chirurgiche, due paia di portaaghi, sutura chirurgica in seta 4-0, sutura chirurgica in seta 6-0, un filtro per gas e una fonte di luce (vedere Tabella dei materiali) (Figura 1A).
2. Indossare una mascherina chirurgica e guanti sterili.
3. Applicare la crema depilatoria sul petto del topo e attendere 1 minuto. Pulisci delicatamente la crema depilatoria e i capelli con una garza bagnata.
4. Tenere il mouse con la mano dominante dopo la depilazione. Indurre l'anestesia per inalazione di isoflurano vaporizzato (4%) con apporto di ossigeno (1L/min) e mantenere al 2-3% di isoflurano.
5. Confermare un'anestesia adeguata in base alla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
6. Applicare una crema per gli occhi sterile su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale.
7. Fissare i topi su una piattaforma chirurgica in posizione supina. Applicare tre volte tamponi di iodio povidone (vedere Tabella dei materiali) sul torace e coprire il torace disinfettato con un telo sterile.

3. Induzione dell'infarto del miocardio

1. Sostituire i guanti contaminati per garantire la sterilità.
2. Praticare un taglio cutaneo di 0,5 cm lungo la linea che collega lo xifoide e l'ascella dopo il blocco locale con lidocaina.
3. Separare senza mezzi termini i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori usando una pinza e un emostatico micro-zanzara per esporre il quarto spazio intercostale.
4. Aprire il quarto spazio intercostale utilizzando un emostato micro-zanzare.
5. Esternare il cuore spingendo il cuore verso il quarto spazio intercostale con l'indice della mano sinistra.
6. Fissare il cuore con la mano sinistra e legare il ramo discendente anteriore sinistro con una sutura 6-0 a 3 mm dalla sua origine.
7. Riposizionare rapidamente il cuore nella cavità toracica.
   NOTA: È sicuro esternare il cuore per meno di 30 secondi.
8. Evacuare l'aria dalla cavità toracica premendo delicatamente la cavità toracica manualmente.
9. Chiudi lo strato muscolare sopra le costole con una sutura di seta 6-0.
10. Chiudere la pelle con una sutura di seta 4-0.
11. Posizionare i mouse su un pad (37 °C) subito dopo l'operazione.
12. Iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea ogni 4-6 ore per ridurre il dolore post-operatorio fino a 72 ore.
13. Riportare i topi operati nelle gabbie quando si sono completamente ripresi.
    NOTA: I topi saranno completamente recuperati entro 3-5 minuti dopo l'intervento chirurgico.
14. Monitora attentamente i topi e fornisci cibo umido per un massimo di 7 giorni.

4. Prelievo dei tessuti

1. Sacrificare i topi in diversi momenti dopo l'insediamento dell'infarto miocardico per lussazione cervicale.
2. Fissare i topi sacrificati sulla piattaforma chirurgica in posizione supina.
3. Praticare un'incisione ventrale (~3-4 cm) nella parte superiore dell'addome. Tagliare le costole da entrambi i lati della cavità del torace e rimuovere il diaframma.
4. Perfondere il cuore con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (1x PBS, 4 °C) mediante iniezione intraventricolare.
5. Raccogliere il cuore tagliando la radice aortica e conservare immediatamente il cuore a -80 °C.
   NOTA: Secondo l'esperienza degli autori, è possibile eseguire la colorazione TTC entro due settimane dalla conservazione.
6. Colorare il cuore con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC).
   1. Tagliate il cuore congelato in fette spesse 1 mm sul ghiaccio con delle lamette da barba.
   2. Incubare le fette di cuore preparate in una soluzione di TTC all'1% (sciolta in 1x PBS) a 37 °C per 10-15 min.
      NOTA: Dopo 15 minuti di incubazione, scartare la soluzione TTC e immergere le fette di cuore macchiate in 1x PBS.
7. Fotografa le fette usando una fotocamera digitale.

Il protocollo sperimentale e alcuni dei passaggi critici sono mostrati nella Figura 1. L'attrezzatura per anestesia semplificata ha indotto l'anestesia. Come mostrato nella Figura 2A, l'anestesia indotta è risultata stabile, come si evince dalle frequenze respiratorie regolari (variavano da 90 a 107 respiri/min nei topi testati). Dopo la legatura dell'arteria coronaria, l'analisi della colorazione TTC ha indicato l'induzione riuscita dell'infarto miocardico e i cambiamenti temporali delle dimensioni della cicatrice post-infarto miocardico (Figura 2B). Nel frattempo, i risultati dell'analisi di sopravvivenza hanno mostrato mortalità conclamata entro 7 giorni dall'infarto miocardico nei topi C57BL/6J maschi e femmine (Figura 2C,D). La rottura ventricolare (56% nei topi maschi; 40% nei topi femmine) è stata una ragione comune per la morte post-infarto miocardico. Inoltre, la valutazione ecocardiografica post-infarto del miocardio ha dimostrato il successo dell'induzione della disfunzione contrattile e del rimodellamento ventricolare (Figura 2E,F).

Figura 1: Materiali e passaggi critici nei metodi modificati per l'induzione dell'infarto miocardico . (A) Strumenti chirurgici e materiali necessari per questo protocollo. (a) Sutura di seta 4-0. (b) Sutura di seta 6-0. (c) Forcipe. (d) Forbici. (e-f) Porta-aghi. g) Emostato microzanzare. h) Sorgente luminosa. (i) Filtro del gas. (B) Immagini rappresentative che mostrano i passaggi chiave per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi. (a) Il topo è stato fissato dopo l'anestesia e lo iodio povidone è stato applicato al sito chirurgico. (b) Il sito chirurgico è drappeggiato. (c) Un taglio di 0,5 cm nel sito chirurgico dopo il blocco locale con lidocaina. (d) Nervature esposte. La freccia indica le nervature. (e) Sezionati i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori per esporre il quarto spazio intercostale. (f) Cuore esteriorizzato. (G-H) LAD legato con sutura di seta 6-0. La freccia indica LAD. (i) Il cuore viene reinserito nella cavità toracica. (j) L'aria è stata evacuata dalla cavità toracica. (k) Lo strato muscolare chiuso sopra le costole con sutura di seta 6-0 e la pelle chiusa con suture di seta 4-0. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Cambiamenti istologici e funzionali dopo la legatura delle arterie coronarie. (A) Frequenza respiratoria nei topi anestetizzati dall'apparecchiatura per anestesia semplificata (n=10). (B ) I risultati della colorazione TTC delle fette di cuore (4 fette da ciascun cuore) sono stati raccolti in diversi punti temporali post-infarto miocardico. L'area bianca indicava un'area infartuata e l'area rossa rivelava miocardio vitale. (C) La curva di Kaplan-Meier mostra il tasso di mortalità post-infarto miocardico nei topi maschi (n=20 per gruppo). (D) La curva di Kaplan-Meier mostra il tasso di mortalità post-infarto miocardico nei topi femmina (n=20 per gruppo). (E) Immagini rappresentative dell'analisi ecocardiografica in diversi punti temporali dopo l'infarto miocardico (sham, 3 giorni, 7 giorni, 21 giorni e 28 giorni dopo l'infarto miocardico). (F) L'analisi quantitativa dei valori della frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF), dell'accorciamento frazionario ventricolare sinistro (LVFS), del diametro telesistolico ventricolare sinistro (LVsD) e della dimensione telediastolica ventricolare sinistra (LVdD) tra i gruppi indicati (n=5 per gruppo). **p<0,01 o ***p<0,001 vs. finto; ##p<0.01 o ###p<0.001 vs. 3 giorni dopo l'infarto miocardico. È stata eseguita un'analisi unidirezionale della varianza con il test post-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) per l'analisi statistica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il presente rapporto ha dimostrato un semplice protocollo per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi con materiali prontamente disponibili, che è stato modificato da un metodo riportato da Gao¹⁶. I modelli murini di infarto miocardico sono indispensabili per l'esplorazione meccanicistica e lo screening farmacologico per la disfunzione post-infarto del miocardio e il rimodellamento¹². Tra le tecniche esistenti per l'induzione dell'infarto miocardico, la legatura delle arterie coronarie rappresenta quella più comunemente praticata. La legatura dell'arteria coronaria ricapitola fedelmente la natura ischemica dell'infarto miocardico e porta a una risposta di guarigione e rimodellamento cicatriziale simile allo scenario clinico^18,19. Tuttavia, il protocollo convenzionale per la legatura delle arterie coronarie prevede l'intubazione, la ventilazione e un'ampia apertura del torace, che è tecnicamente impegnativa e richiede tempo. Negli ultimi anni, sono stati riportati diversi protocolli per la legatura delle arterie coronarie che hanno potenziato l'instaurazione dell'infarto miocardico in una certa misura^15,16,17. L'attuale studio ha presentato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza strumenti e attrezzature chirurgiche facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori.

Passaggi critici e risoluzione dei problemi
Per prestazioni ottimali nella pratica di questo metodo, vale la pena notare diversi passaggi chiave. Per esternare il cuore, la cavità toracica non deve essere compressa ferocemente, il che influenzerebbe negativamente il flusso sanguigno coronarico e oscurerebbe l'arteria coronaria, portando all'invisibilità dell'arteria coronaria e al fallimento della legatura LAD. Inoltre, ciò può causare gravi lesioni polmonari. Per la maggior parte dei casi, una leggera spinta contro il lato destro della parete toracica esternalizzerà con successo il cuore attraverso lo spazio intercostale aperto. Occasionalmente, una sensazione di resistenza durante l'esternazione cardiaca può indicare una mancata corrispondenza tra l'apice del cuore e l'apertura intercostale. Questo può essere affrontato con lievi movimenti dell'emostatico della microzanzara lungo la linea medio-ascellare. Un altro punto critico è l'adeguata evacuazione dell'aria residua nella cavità toracica prima di suturare i muscoli e la pelle. In caso contrario, aumenterà la mortalità post-operatoria dovuta allo pneumotorace.

Vantaggi e limiti
I metodi convenzionali per la legatura coronarica richiedono l'intubazione, la ventilazione meccanica, il taglio delle costole e non sono facili da identificare per le arterie coronarie a causa dell'elevata frequenza cardiaca. Questi problemi prolungano drasticamente i tempi operativi e aumentano la mortalità correlata all'operazione. Rispetto ai metodi convenzionali, il protocollo modificato presenta i seguenti vantaggi: (1) consente di risparmiare tempo (ad esempio, ci vogliono circa 3 minuti dall'anestesia, dalla legatura LAD alla sutura cutanea di successo); (2) Gli strumenti chirurgici e i materiali necessari sono prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori. Tuttavia, una limitazione significativa di questo metodo unico è il tempo limitato concesso per la legatura LAD dopo l'esternalizzazione cardiaca a causa della mancanza di supporto per la ventilazione meccanica. Pertanto, ci si può aspettare un'elevata mortalità causata dallo pneumotorace per i principianti. Sulla base dell'esperienza degli autori, l'esternalizzazione cardiaca per meno di 30 secondi è ben tollerata da tutti i topi testati. Questa finestra temporale è adeguata per un tecnico esperto per completare l'induzione dell'infarto miocardico con una bassa mortalità perioperatoria (<5%).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), dello Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), della Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (201409005200), dello Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030) e della China Postdoctoral Science Foundation (2020M671161, BX20190216).