طريقة بسيطة معدلة لتحريض احتشاء عضلة القلب في الفئران

تحت التخدير الكافي ، تم إخراج قلب الفأر من خلال الفضاء الوربي ، وتم إحداث احتشاء عضلة القلب بنجاح عن طريق ربط الشريان النازل الأمامي الأيسر (LAD) باستخدام مواد متاحة بسهولة في معظم المختبرات.

يمثل احتشاء عضلة القلب (MI) أحد الأسباب الرئيسية للوفاة. تستخدم نماذج MI على نطاق واسع للتحقيق في الآليات المرضية لإعادة عرض ما بعد MI وتقييم العلاجات الجديدة. تم استخدام طرق مختلفة (على سبيل المثال ، علاج الأيزوبروتيرينول ، والإصابة بالتبريد ، وربط الشريان التاجي ، وما إلى ذلك) للحث على MI. بالمقارنة مع علاج الأيزوبروتيرينول والإصابة بالتبريد ، قد يعكس ربط الشريان التاجي بشكل أفضل الاستجابة الإقفارية وإعادة التشكيل المزمن بعد MI. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية لربط الشريان التاجي في الفئران تمثل تحديا تقنيا. تصف الدراسة الحالية عملية بسيطة وفعالة لتحريض MI في الفئران بمواد متاحة بسهولة. تم قطع جلد صدر الفأر تحت التخدير المستقر. تم إخراج القلب على الفور من خلال الفضاء الوربي بعد الفصل الحاد بين الصدرية الكبرى والصدرية الصغرى. تم ربط الفرع الهابط الأمامي الأيسر (LAD) بخياطة 6-0 3 مم من أصله. بعد ربط LAD ، أشار التلوين بكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل تترازوليوم (TTC) إلى تحريض ناجح ل MI والتغيرات الزمنية لحجم ندبة ما بعد MI. وفي الوقت نفسه ، أظهرت نتائج تحليل البقاء على قيد الحياة وفيات علنية في غضون 7 أيام بعد MI ، ويرجع ذلك أساسا إلى تمزق القلب. علاوة على ذلك ، أظهر تقييم تخطيط صدى القلب بعد MI تحريضا ناجحا لضعف الانقباض وإعادة تشكيل البطين. بمجرد إتقانه ، يمكن إنشاء نموذج MI في الفئران في غضون 2-3 دقائق بمواد متاحة بسهولة.

يمثل احتشاء عضلة القلب (MI) أحد الأسباب المهمة للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم¹،²،³،^4،5. على الرغم من إعادة التروية في الوقت المناسب ، يوجد حاليا نقص في العلاجات الفعالة لعلاج إعادة تشكيل القلب بعد MI. في المقابل ، بذلت جهود كبيرة للاستكشاف الميكانيكي واستغلال العلاج ل MI^6،7،8. وتجدر الإشارة إلى أن إنشاء نماذج MI هو شرط أساسي لتحقيق هذه الغايات.

تم اقتراح عدة طرق (على سبيل المثال ، علاج الأيزوبروتيرينول ، والإصابة بالتبريد ، وربط الشريان التاجي ، وما إلى ذلك) للحث على نماذج MI في الحيوانات الصغيرة. علاج الأيزوبروتيرينول هو طريقة بسيطة لتحريض MI ، لكنه لا يمكن أن يحفز احتشاء المنطقة المستهدفة⁹. تؤدي الإصابة بالتبريد إلى نخر عضلة القلب عن طريق توليد بلورات الثلج وتعطيل غشاء الخلية بدلا من نقص التروية المباشر¹⁰. على النقيض من ذلك ، يسمح ربط الشريان التاجي بالتحكم الدقيق في موقع الانسداد ومدى منطقة الاحتشاء ويلخص بأمانة استجابة إعادة البناء بعد الاحتشاء^11,12. عادة ما يتم إجراء ربط الشريان التاجي بعد التنبيب والتهوية الميكانيكية وبضع الصدر ، وهو أمر يمثل تحديا تقنيا^13,14. تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات المعدلة لربط الشريان التاجي (على سبيل المثال ، التهوية الحرة) وعززت تحريض MI ، ولكن لا توجد عروض بصرية مفصلة¹⁵،^16،17. تشكل هذه القضايا حاجزا ماليا وتقنيا كبيرا أمام المجموعات الراغبة في المشاركة في البحث باستخدام نماذج MI. يقدم هذا التقرير نهجا لتحريض MI في الفئران. الطريقة الحالية سهلة وموفرة للوقت وتستخدم الأدوات والمعدات الجراحية الموجودة بسهولة في معظم المختبرات.

يتم إجراء التجارب التي تنطوي على عمل حيواني مع جميع الموافقات اللازمة من لجنة أخلاقيات رعاية المختبر في مستشفى رينجي ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، كلية الطب (R52021-0506). تم استخدام إناث وذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع في الدراسة.

1. إعداد معدات التخدير المبسطة (اختياري)

ملاحظة: هذا إعداد اختياري قبل الجراحة ويمكن استبداله بتخدير قابل للمعايرة كما هو مذكور في القسم 2. يجب استشارة لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية والطبيب البيطري (الأطباء البيطريين) قبل تكييف هذا الإعداد في الإجراءات الحيوانية.

1. خذ أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وقم بعمل قطع عمودي على المحور الطويل للأنبوب على بعد حوالي 3 سم من الفتحة.
   ملاحظة: تأكد من أن القطع أكبر من نصف المحيط الدائري لتجويف الأنبوب بحيث يمكن إدخال الصمام بنجاح.
2. حفر ثقوب (قطرها 2 مم) في جدار أنبوب الطرد المركزي بين القطع وفتحة الأنبوب.
3. اقطع قطعة مناسبة الحجم من الصمام من صفيحة بلاستيكية وأدخل الصمام في القطع الموجود على جدار الأنبوب.
   ملاحظة: يمكن استخدام الصمام للتحكم في معدل إطلاق الأيزوفلوران عن طريق تغيير عمق الإدخال.
4. داخل غطاء الدخان ، قم بقطع الجزء السفلي من الأنبوب وتوصيله بإمدادات الأكسجين. ضع كرة قطنية بالقرب من الطرف السفلي للأنبوب ، وأضف حمولة 0.5 مل إيزوفلوران (كما تم الحصول عليها ، انظر جدول المواد) على كرة القطن ، وأغلق الصمام.
5. اختبر فعالية التخدير عن طريق إخفاء الفئران بأنابيب معدة كما هو موضح أعلاه. راقب معدل التنفس وعمق التخدير عن طريق استجابة قرصة إصبع القدم.
   ملاحظة: يشير معدل التنفس الأقل من 10 مرات / 10 ثوان إلى التخدير المفرط ، ويجب تعديل عمق إدخال الصمام. بالنسبة لجميع الإجراءات التي تنطوي على التخدير ، يجب استخدام مرشح غاز مملوء بألواح الفحم المنشط (الشكل 1A-i) ، ويجب إجراء الجراحة داخل غطاء.

2. التحضير الجراحي والتخدير

1. قم بإعداد وتعقيم جميع الأدوات المطلوبة في يوم الجراحة ، بما في ذلك زوج من الملقط ، ومرقئ البعوض الصغير ، ومقص جراحي ، وزوجان من حاملات الإبر ، وخياطة جراحية من الحرير 4-0 ، وخياطة جراحية من الحرير 6-0 ، وفلتر غاز ، ومصدر ضوء (انظر جدول المواد) (الشكل 1 أ).
2. ارتد قناعا جراحيا وقفازات معقمة.
3. ضع كريم مزيل الشعر على صندوق الماوس وانتظر لمدة 1 دقيقة. امسح بلطف كريم مزيل الشعر والشعر بشاش مبلل.
4. امسك الماوس باليد المهيمنة بعد إزالة الشعر. تحفيز التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران المتبخر (4٪) مع إمداد الأكسجين (1 لتر / دقيقة) والحفاظ على 2-3٪ إيزوفلوران.
5. تأكد من التخدير الكافي بسبب عدم استجابة قرصة إصبع القدم.
6. ضع كريم العين المعقم على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
7. تأمين الفئران على منصة الجراحة في موقف ضعيف. ضع مسحات البوفيدون واليود (انظر جدول المواد) على الصدر ثلاث مرات وقم بتغطية الصدر المطهر بستارة معقمة.

3. تحريض احتشاء عضلة القلب

1. تغيير القفازات الملوثة لضمان العقم.
2. اصنع قطعا جلديا بطول 0.5 سم على طول الخط الذي يربط الخنجري والإبط بعد الكتلة المحلية مع يدوكائين.
3. افصل بصراحة بين العضلات الصدرية الكبرى والصدرية الصغيرة باستخدام ملقط ومرقئ البعوض الصغير لفضح الفضاء الوربي الرابع.
4. افتح المساحة الوربية الرابعة باستخدام مرقئ البعوض الصغير.
5. قم بإخراج القلب عن طريق دفع القلب نحو الفضاء الوربي الرابع بإصبع السبابة في اليد اليسرى.
6. تأمين القلب باليد اليسرى ، وربط الفرع الأمامي الأيسر النازل مع خياطة 6-0 3 ملم من أصله.
7. ضع القلب مرة أخرى في التجويف الصدري بسرعة.
   ملاحظة: من الآمن إخراج القلب من الخارج لمدة تقل عن 30 ثانية.
8. قم بإخلاء الهواء من التجويف الصدري بضغطة لطيفة على تجويف الصدر يدويا.
9. أغلق طبقة العضلات فوق الأضلاع بخياطة حريرية 6-0.
10. أغلق الجلد بخياطة حرير 4-0.
11. ضع الفئران على وسادة (37 درجة مئوية) مباشرة بعد العملية.
12. حقن البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغ / كغ) تحت الجلد كل 4-6 ساعات للحد من آلام ما بعد الجراحة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
13. أعد الفئران التي تم تشغيلها إلى أقفاص عند الشفاء التام.
    ملاحظة: سيتم استرداد الفئران بالكامل في غضون 3-5 دقائق بعد الجراحة.
14. راقب الفئران بعناية وقدم الطعام الرطب لمدة تصل إلى 7 أيام.

4. حصاد الأنسجة

1. التضحية بالفئران في نقاط زمنية مختلفة بعد إنشاء MI عن طريق خلع عنق الرحم.
2. تأمين الفئران التي تم التضحية بها على منصة الجراحة في وضع ضعيف.
3. قم بعمل شق بطني (~ 3-4 سم) في الجزء العلوي من البطن. قطع الأضلاع من كلا جانبي تجويف الصدر ، وإزالة الحجاب الحاجز.
4. قم بتغذية القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد سعة 10 مل (1x PBS ، 4 درجات مئوية) من خلال الحقن داخل البطيني.
5. اجمع القلب عن طريق قطع جذر الأبهر وخزن القلب على الفور عند -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: وفقا لتجربة المؤلفين ، من الممكن إجراء تلطيخ TTC في غضون أسبوعين من التخزين.
6. صبغ القلب بكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم (TTC).
   1. قطعي القلب المتجمد إلى أقسام بسمك 1 مم على الثلج باستخدام شفرات الحلاقة.
   2. احتضان شرائح القلب المحضرة في محلول TTC 1٪ (مذاب في 1x PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: بعد 15 دقيقة من الحضانة ، تخلص من محلول TTC واغمر شرائح القلب الملطخة في 1x PBS.
7. صور الشرائح باستخدام كاميرا رقمية.

يوضح الشكل 1 البروتوكول التجريبي وبعض الخطوات الحاسمة. معدات التخدير المبسطة تسبب التخدير. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، كان التخدير المستحث مستقرا ، كما ينعكس في معدلات التنفس العادية (تراوحت من 90-107 أنفاس / دقيقة في الفئران المختبرة). بعد ربط الشريان التاجي ، أشار تحليل تلطيخ TTC إلى تحريض ناجح لاحتشاء عضلة القلب والتغيرات الزمنية لحجم ندبة ما بعد MI (الشكل 2B). وفي الوقت نفسه ، أظهرت نتائج تحليل البقاء على قيد الحياة وفيات علنية في غضون 7 أيام بعد MI في ذكور وإناث الفئران C57BL / 6J (الشكل 2C ، D). كان تمزق البطين (56٪ في ذكور الفئران ؛ 40٪ في إناث الفئران) سببا شائعا للوفاة بعد MI. علاوة على ذلك ، أظهر تقييم تخطيط صدى القلب بعد MI تحريضا ناجحا لضعف الانقباض وإعادة تشكيل البطين (الشكل 2E ، F).

الشكل 1: المواد والخطوات الحرجة في الطرق المعدلة لتحريض MI . (أ) الأدوات الجراحية والمواد اللازمة لهذا البروتوكول. (أ) 4-0 خياطة حرير. (ب) 6-0 خياطة حرير. (ج) الملقط. (د) المقص. (ه-و) أصحاب الإبر. (ز) مرقئ البعوض الصغير. (ح) مصدر الضوء. (ط) فلتر الغاز. (ب) صور تمثيلية توضح الخطوات الرئيسية لإحداث MI في الفئران. (أ) تم تأمين الفأر بعد التخدير ، وتم تطبيق البوفيدون - اليود على موقع الجراحة. (ب) موقع الجراحة ملفوف. (ج) جرح 0.5 سم في موقع الجراحة بعد إحصار موضعي بالليدوكائين. (د) الأضلاع المكشوفة. يشير السهم إلى الأضلاع. (ه) تشريح العضلات الصدرية الكبرى والصدرية الصغرى لكشف الفراغ الوربي الرابع. (و) القلب الخارجي. (ز - ح) LAD مربوط بخياطة حرير 6-0. يشير السهم إلى LAD. (ط) يوضع القلب مرة أخرى في تجويف الصدر. (ي) تم تفريغ الهواء من التجويف الصدري. (ك) أغلقت الطبقة العضلية فوق الضلوع بخياطة حريرية 6-0 وأغلق الجلد بخيوط حرير 4-0. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التغيرات النسيجية والوظيفية بعد ربط الشريان التاجي. أ: معدلات التنفس في الفئران التي تم تخديرها بواسطة جهاز التخدير المبسط (ن = 10). (ب) تم جمع نتائج تلطيخ TTC لشرائح القلب (4 شرائح من كل قلب) في نقاط زمنية مختلفة بعد MI. تشير المنطقة البيضاء إلى منطقة احتشاء ، وكشفت المنطقة الحمراء عن عضلة القلب القابلة للحياة. (ج) يظهر منحنى كابلان-ماير معدل وفيات ما بعد MI في ذكور الفئران (ن = 20 لكل مجموعة). (د) يوضح منحنى كابلان-ماير معدل وفيات ما بعد MI في إناث الفئران (ن = 20 لكل مجموعة). (ه) صور تمثيلية لتحليل تخطيط صدى القلب في نقاط زمنية مختلفة بعد MI (وهمية ، 3 أيام ، 7 أيام ، 21 يوما ، و 28 يوما بعد MI). (F) التحليل الكمي لقيم الكسر القذفي للبطين الأيسر (LVEF) ، وتقصير كسور البطين الأيسر (LVFS) ، وقطر نهاية البطين الأيسر الانقباضي (LVsD) ، والبعد الانبساطي لنهاية البطين الأيسر (LVdD) بين المجموعات المشار إليها (n = 5 لكل مجموعة). ** p < 0.01 أو *** p < 0.001 مقابل. الشام; ##p<0.01 أو ###p<0.001 مقابل. 3 أيام بعد MI. تم إجراء تحليل أحادي الاتجاه للتباين باستخدام اختبار Tukey HSD (الفرق الهام بصراحة) للتحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وأظهر هذا التقرير بروتوكولا سهلا لتحريض MI في الفئران ذات المواد المتاحة بسهولة، والذي تم تعديله من طريقة أبلغ عنها^{GAO 16}. لا غنى عن نماذج Murine MI للاستكشاف الميكانيكي وشاشة الأدوية لخلل وظيفي بعد MI وإعادة عرض¹². من بين التقنيات الحالية لتحريض MI ، يمثل ربط الشريان التاجي الأكثر شيوعا. يلخص ربط الشريان التاجي بأمانة طبيعة نقص تروية احتشاء عضلة القلب ويؤدي إلى شفاء الندبة واستجابة إعادة تشكيلها على غرار السيناريو السريري^18,19. ومع ذلك ، فإن البروتوكول التقليدي لربط الشريان التاجي ينطوي على التنبيب والتهوية وفتح واسع للصدر ، وهو أمر صعب تقنيا ويستغرق وقتا طويلا. على مدى السنوات الماضية ، تم الإبلاغ عن بروتوكولات مختلفة لربط الشريان التاجي وعززت إنشاء MI إلى حد ما¹⁵،^16،17. قدمت الدراسة الحالية بروتوكولا بسيطا وفعالا باستخدام الأدوات والمعدات الجراحية الموجودة بسهولة في معظم المختبرات.

الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
للحصول على الأداء الأمثل في ممارسة هذه الطريقة ، تجدر الإشارة إلى العديد من الخطوات الرئيسية. لإخراج القلب ، لا ينبغي ضغط تجويف الصدر بشدة ، مما قد يؤثر سلبا على تدفق الدم التاجي ويحجب الشريان التاجي ، مما يؤدي إلى عدم ظهور الشريان التاجي وفشل ربط LAD. علاوة على ذلك ، قد يؤدي هذا إلى إصابة شديدة في الرئة. في معظم الحالات ، سيؤدي الضغط اللطيف على الجانب الأيمن من جدار الصدر إلى إخراج القلب بنجاح من خلال المساحة الوربية المفتوحة. في بعض الأحيان ، قد يشير الشعور بالمقاومة أثناء إخراج القلب إلى عدم تطابق قمة القلب والفتحة الوربية. يمكن معالجة ذلك عن طريق حركات طفيفة لمرقئ البعوض الصغير على طول خط منتصف الإبط. نقطة أخرى حرجة هي الإخلاء الكافي للهواء المتبقي في تجويف الصدر قبل خياطة العضلات والجلد. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى زيادة معدل الوفيات بعد الجراحة بسبب استرواح الصدر.

المزايا والقيود
تتطلب الطرق التقليدية لربط الشريان التاجي التنبيب والتهوية الميكانيكية وقطع الأضلاع وليس من السهل تحديد الشريان التاجي بسبب ارتفاع معدل ضربات القلب. هذه القضايا تطيل بشكل كبير وقت العملية وتزيد من الوفيات المرتبطة بالعملية. بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، يقدم البروتوكول المعدل المزايا التالية: (1) إنه موفر للوقت (أي أنه يستغرق حوالي 3 دقائق من التخدير ، وربط LAD إلى خياطة الجلد الناجحة) ؛ (2) الأدوات والمواد الجراحية المطلوبة متوفرة بسهولة في معظم المختبرات. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الكبيرة على هذه الطريقة الفريدة هو الوقت المحدود المسموح به لربط LAD بعد إخراج القلب بسبب نقص دعم التهوية الميكانيكية. وبالتالي ، يمكن توقع ارتفاع معدل الوفيات الناجم عن استرواح الصدر للمبتدئين. استنادا إلى تجربة المؤلفين ، فإن إخراج القلب لمدة تقل عن 30 ثانية جيد التحمل من قبل جميع الفئران التي تم اختبارها. هذه النافذة الزمنية كافية لفني متمرس لإنهاء تحريض MI مع انخفاض معدل الوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة (<5٪).

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81930007 ، 81625002 ، 81800307 ، 81470389 ، 81500221 ، 81770238) ، وبرنامج شنغهاي للقادة الأكاديميين المتميزين (18XD1402400) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (201409005200) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ للمواهب (2020PJD030) ، ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (2020M671161 ، BX20190216).