Imaging vascolare profondo nell'occhio con ultrasuoni ottimizzati per il flusso

Presentiamo una tecnica ecografica non invasiva per generare angiografie tridimensionali nell'occhio senza l'uso di mezzi di contrasto.

La retina all'interno dell'occhio è uno dei tessuti più esigenti dal punto di vista energetico nel corpo e quindi richiede alti tassi di erogazione di ossigeno da un ricco apporto di sangue. La lamina capillare della coroide riveste la superficie esterna della retina ed è la fonte dominante di ossigeno nella maggior parte delle retine dei vertebrati. Tuttavia, questo letto vascolare è difficile da fotografare con le tecniche ottiche tradizionali a causa della sua posizione dietro la retina altamente assorbente della luce. Qui descriviamo una tecnica ecografica ad alta frequenza con successivo miglioramento del flusso all'immagine di letti vascolari profondi (0,5-3 cm) dell'occhio con un'alta risoluzione spaziotemporale. Questo metodo non invasivo funziona bene nelle specie con globuli rossi nucleati (modelli animali non mammiferi e fetali). Consente la generazione di angiografie tridimensionali non invasive senza l'uso di mezzi di contrasto ed è indipendente dagli angoli del flusso sanguigno con una sensibilità più elevata rispetto alle tecniche di imaging ecografico basate su Doppler.

L'elevato metabolismo sulla retina dei vertebrati impone un compromesso intrinseco tra due esigenze contrastanti; alte velocità di flusso sanguigno e un percorso di luce privo di vasi sanguigni. Per evitare disturbi visivi di perfondere i globuli rossi, la retina di tutti i vertebrati riceve ossigeno e sostanze nutritive attraverso un foglio di capillari dietro i fotorecettori, il coriocapillare1,2,3. Tuttavia, questa singola fonte di nutrienti e ossigeno impone una limitazione di diffusione allo spessore della ^retina4,5, quindi molte specie visivamente attive possiedono una varietà di reti vascolari elaborate per fornire ulteriore afflusso di sangue a questo organo metabolicamente ^attivo6. Questi letti vascolari includono vasi sanguigni che perfondono gli strati retinici interni nei mammiferi e in alcuni pesci4,7,8,9,10, vasi sanguigni sul lato interno (rivolto verso la luce) della retina che si trovano in molti pesci, rettili e uccelli4,11,12,13, e disposizioni vascolari controcorrenti della coroide di pesce, la rete coroide mirabile, che consente la generazione di pressioni parziali di ossigeno super-atmosferico14,15,16,17,18,19,20. Nonostante questi percorsi aggiuntivi non coroidale per l'apporto di nutrienti retinici svolgano un ruolo essenziale nell'alimentare i requisiti metabolici di una visione ^superiore4, l'anatomia tridimensionale di queste strutture vascolari è poco conosciuta, limitando la nostra comprensione dell'evoluzione morfologica dell'occhio vertebrato.

Tradizionalmente, l'afflusso di sangue retinico è stato studiato utilizzando tecniche ottiche, come l'oftalmoscopia del fondo oculare. Questa categoria di tecniche fornisce informazioni non distruttive ad alto rendimento sull'anatomia dei vasi sanguigni non coroidale in alta ^{risoluzione21} ed è quindi prontamente utilizzata nella diagnosi clinica di anomalie nella struttura dei vasi ^retinici22. Tuttavia, l'epitelio pigmentato retinico assorbe la luce trasmessa e limita la profondità di visione in queste tecniche ottiche, fornendo informazioni ridotte sulla struttura e la funzione coroidale senza l'uso di mezzi di ^contrasto21. Limitazioni di profondità simili si verificano nella tomografia a coerenza ottica (OCT). Questa tecnica può generare angiografie del fondo oculare ad alta risoluzione utilizzando onde luminose a spese tecniche della penetrazione in ^{profondità23}, mentre l'OCT di imaging di profondità avanzato può visualizzare la coroide a scapito della qualità dell'imaging ^retinico24. La risonanza magnetica supera i limiti ottici dell'oftalmoscopia e dell'OCT e può mappare gli strati vascolari nella retina, anche se a bassa ^{risoluzione25}. L'istologia e la tomografia microcalcografica (μCT) mantengono l'alta risoluzione delle tecniche ottiche e forniscono informazioni sulla morfologia vascolare dell'occhio ^intero4, ma entrambe le tecniche richiedono il campionamento oculare e non sono quindi possibili in clinica o in specie rare o in via di estinzione. Per superare alcuni dei limiti di queste tecniche di imaging retinico consolidate, lo studio qui presenta un protocollo ecografico su animali anestetizzati, in cui il movimento del sangue è mappato in silico su una serie di ecografie bidimensionali equamente distanziate che coprono un intero occhio applicando una tecnica comparabile come descritto in precedenza per l'imaging embrionale e ^{cardiovascolare26,27, 28} e nell'angiografia ^OCT29. Questo approccio consente la generazione di angiografie oculari profonde tridimensionali non invasive senza l'uso di un mezzo di contrasto e apre nuove strade per mappare la distribuzione del flusso sanguigno all'interno dell'occhio tra le specie.

Il protocollo riportato di seguito è stato eseguito con il permesso dell'Ispettorato danese per la sperimentazione animale presso il Ministero danese dell'alimentazione, dell'agricoltura e della pesca, della veterinaria danese e dell'amministrazione alimentare (numero di autorizzazione 2016-15-0201-00835).

1. Anestesia e mezzo ad ultrasuoni

1. Anestetizzare l'animale da ricerca.
   NOTA: Il tipo e la dose di anestesia appropriata sono altamente dipendenti dalla specie. In generale, gli anestetici a base di immersione come MS-222 (acido metil 3-aminobenzoato metanosolfonico), benzocaina (etil 4-aminobenzoato) e propofol (2,6-diisopropilfenolo) sono utili nei pesci e negli anfibi che assorbono facilmente l'anestetico su branchie o pelle (ad esempio, 0,05 mg· ^L-1 benzocaina nella trota iridea). Una gamma di composti disciolti che possono essere somministrati per via endovenosa, intramuscolare, intraperitoneale è disponibile per gli amnioti, così come gli anestetici a base di gas. Alfaxalon somministrato per via intramuscolare è utile nei rettili (ad esempio, 30 mg·^kg-1 nelle lucertole) e l'isoflurano somministrato come gas è utile negli uccelli (ad esempio, il 2% nell'aria per i piccioni). Fare riferimento alla letteratura pubblicata30,31,32 per una panoramica completa degli anestetici disponibili tra le specie.
2. Testare i riflessi nell'animale per confermare un livello ottimale di anestesia. Assicurarsi che l'animale sia completamente immobile durante la procedura poiché la procedura ecografica potenziata dal flusso è sensibile al rumore del movimento.
   1. Un'anestesia troppo profonda può alterare i modelli di flusso sanguigno, quindi condurre una titolazione della dose nella fase di avvio di un esperimento.
   2. Aumentare il dosaggio dell'anestesia in passi e osservare il flusso sanguigno nell'occhio aiutato da una semplice ecografia in modalità luminosità (modalità B).
      NOTA: Un livello ottimale di anestesia si ottiene quando l'animale è immobile (tranne la respirazione) con flusso sanguigno oculare visibile.
3. Se il tipo/dose di anestetico non è permissivo per i movimenti respiratori, garantire un'adeguata ventilazione dell'animale, ad esempio utilizzando una pompa ad aria per ossigenare l'acqua per le specie acquatiche o un ventilatore per le specie che respirano l'aria.
4. Posizionare l'animale in una postura che consenta l'accesso diretto dall'alto all'occhio.
   NOTA: a seconda della specie, questo può essere in posizione supina o laterale. Può essere utile costruire un semplice dispositivo di tenuta utilizzando un piccolo pezzo di metallo non reattivo (ad esempio, acciaio inossidabile) e elastici sciolti (vedere la Figura 1).
5. Posizionare un mezzo ad ultrasuoni appropriato sull'occhio dell'animale. Se le palpebre squamate (impermeabili agli ultrasuoni) coprono l'occhio, spostarle delicatamente con un batuffolo di cotone.
   NOTA: Per le specie acquatiche, il miglior mezzo ad ultrasuoni è l'acqua pulita del serbatoio in cui l'animale di solito vive. Per le specie terrestri, una generosa quantità di gel ad ultrasuoni garantisce movimenti liberi e immagini del trasduttore ad ultrasuoni (cioè sonda lineare) su tutta la superficie dell'occhio. L'unguento veterinario sull'occhio controlaterale è richiesto per le specie terrestri.

2. Acquisizione di immagini ad ultrasuoni oculari 2D e 3D

1. Posizionare il trasduttore ad ultrasuoni mediale all'occhio in un orientamento dorsale/ventrale o rostrale/caudale a seconda dell'orientamento dell'immagine desiderato.
2. In modalità B, con una profondità di campo massima, visualizza la porzione mediale e più profonda dell'occhio e assicurati che tutte le strutture di interesse siano visibili nel campo dell'immagine.
   NOTA: In alcune specie, il cristallino occupa una percentuale relativamente grande dell'umore vitreo, che può assorbire gli ultrasuoni, specialmente a frequenze più elevate.
3. Traduci lentamente il trasduttore su ciascun lato mentre ispeziona le immagini in tempo reale. Assicurati che tutte le strutture di interesse siano visibili nel campo dell'immagine; in caso contrario, passare a un trasduttore con una frequenza inferiore e una maggiore profondità di campo.
   NOTA: le seguenti frequenze centrali consentono la seguente profondità massima di campo: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (vedere Tabella 1). Tuttavia, questi valori massimi di profondità di campo possono essere marcatamente inferiori se l'occhio contiene strutture impermeabili calcificate o altre ecografiche.
4. Regola la profondità dell'immagine, l'offset di profondità (distanza dalla parte superiore dell'immagine alla struttura di interesse), la larghezza dell'immagine, nonché il numero e la posizione delle zone focali per coprire la regione di interesse desiderata in tutte e tre le dimensioni spaziali (ad esempio, profondità dell'immagine di 1 cm, offset di profondità di 2 mm, larghezza dell'immagine di 1 cm, una zona focale).
   NOTA: sebbene la denominazione specifica dei pulsanti che regolano questi parametri possa variare tra i sistemi a ultrasuoni, la maggior parte dei sistemi avrà pulsanti con nomi logici per queste regolazioni. Queste impostazioni dei parametri dell'immagine di solito influenzano la gamma di possibili risoluzioni temporali dell'acquisizione ecografica.
5. Impostare la frequenza dei fotogrammi nell'intervallo 50-120 fotogrammi·^s-1.
   NOTA: La risoluzione temporale (cioè l'intervallo di tempo tra le successive scansioni B) deve essere adeguata per visualizzare una grande variabilità di intensità di pixel nei vasi sanguigni ripresi, cioè la risoluzione temporale non deve essere troppo alta. D'altra parte, per completare una registrazione 3D completa dell'occhio in un tempo ragionevole, la risoluzione temporale non può essere troppo bassa. Una risoluzione temporale che va da 50-120 fotogrammi·^s-1 è di solito adeguata per la procedura potenziata dal flusso nella maggior parte delle specie. Su alcuni sistemi ad ultrasuoni, questa risoluzione temporale desiderata può essere ottenuta passando tra le modalità "imaging generale" (alta risoluzione spaziale / bassa temporale) e "cardiologia" (bassa risoluzione spaziale / temporale alta).
6. Regola il guadagno 2D a un livello (~ 5 dB), in modo che le strutture anatomiche siano appena visibili nell'acquisizione in modalità B per aumentare il rapporto segnale-rumore nella successiva ricostruzione potenziata dal flusso.
7. Per acquisire un'immagine 2D ottimizzata per il flusso in una singola posizione slice, tradurre il trasduttore in questa posizione e continuare al passaggio 3.1.
8. Per acquisire una registrazione 3D di un'intera regione di interesse, ad esempio la retina, tradurre il trasduttore a un estremo della regione di interesse.
   1. Per determinare la posizione esatta dell'estremità estrema della regione di interesse, aumentare brevemente il guadagno 2D.
   2. Al termine del corretto posizionamento del trasduttore, ridurre il guadagno 2D prima della registrazione per garantire il massimo rapporto segnale-rumore nella successiva ricostruzione potenziata dal flusso.
9. Per ogni passaggio (slice) nella registrazione 3D, acquisire ≥100 fotogrammi (in modo ottimale ≥1000 fotogrammi).
10. Utilizzando un micromanipolatore o un motore trasduttore incorporato, tradurre il trasduttore attraverso l'intera regione di interesse in passi di, ad esempio, 25 μm o 50 μm (ricordarsi di notare la dimensione del passo) e ripetere l'acquisizione di fotogrammi ≥100 per ogni passaggio.
11. Eutanasia dell'animale da ricerca secondo le linee guida per la cura degli animali dell'istituzione.

3. Ricostruzione dell'immagine ottimizzata dal flusso

1. Esportare le registrazioni in formato di file DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) (little-endian).
2. Per produrre una singola immagine ottimizzata dal flusso basata su una registrazione cinematografica ≥100 fotogrammi (T), calcolate la deviazione standard a livello di pixel (STD(x,y)) utilizzando la formula:
   
   Dove _It(x,y) è l'intensità del pixel alla coordinata del pixel (x,y) al tempo t, e _Īt(x,y) è il valore medio aritmetico di I nel tempo.
3. Ripetere il passaggio 3.2 per ogni fetta nella registrazione 3D.
4. Per automatizzare il processo di calcolo STD e ricostruzione dell'immagine per più sezioni in una registrazione 3D, eseguire questa operazione in modalità batch utilizzando, ad esempio, ImageJ e lo script macro supplementare (File supplementare 1).
5. Combina tutte le sezioni ricostruite in un'unica pila di immagini (comando Da visualizzare a impilare in ImageJ).
6. Specificate lo spessore della fetta dalla dimensione del passo utilizzata durante l'acquisizione (comando Proprietà in ImageJ).
7. Salvare lo stack di immagini come file TIF 3D.
   NOTA: Le registrazioni tridimensionali ponderate a flusso dei vasi sanguigni oculari possono successivamente essere utilizzate per creare rendering di volume e costruire modelli anatomici digitali e fisici delle strutture vascolari dell'occhio. Queste opzioni di elaborazione delle immagini esulano dall'ambito di questo protocollo; fare riferimento agli articoli precedentemente pubblicati per maggiori dettagli33,34,35.

La tecnica ecografica potenziata dal flusso per visualizzare i letti vascolari dell'occhio può essere applicata in una vasta gamma di specie ed è stata attualmente utilizzata in 46 diverse specie di vertebrati (Figura 1, Tabella 1). La presenza di globuli rossi nucleati nei vertebrati non adulti dei mammiferi fornisce un contrasto positivo del sangue che scorre rispetto al tessuto statico nelle registrazioni cinematografiche (file supplementare 2). Tuttavia, se analizzata fotogramma per fotogramma, la chiara distinzione tra sangue e tessuto circostante è meno ovvia (Figura 2A). La procedura di miglioramento del flusso sanguigno descritta in questo protocollo compila essenzialmente una registrazione multi-punto temporale nello spazio 2D (una fetta fatta di fotogrammi T ) in una singola immagine in cui le fluttuazioni intrinseche del valore del segnale in pixel posizionati nel sangue che scorre segnano una deviazione standard più elevata rispetto al tessuto statico circostante, producendo quindi un contrasto positivo (Figura 2B). Per migliorare sensibilmente il contrasto dei vasi sanguigni, Le tabelle di ricerca possono essere utilizzate per produrre immagini pseudocolore (Figura 2C). Nelle acquisizioni 3D, più sezioni parallele con spaziatura nota possono essere combinate in dati di immagine 3D (file 3 supplementare e file supplementare 4) che possono essere utilizzati per il rendering tridimensionale del volume (Figura 2D) e la modellazione anatomica (Figura 2E e File supplementare 5). L'imaging a ultrasuoni basato su Doppler offre anche la possibilità di visualizzare in modo specifico il flusso sanguigno, tuttavia con una sensibilità inferiore rispetto al metodo descritto (confrontare la Figura 2G con la Figura 2H e la Figura 2I) e, soprattutto, non se l'orientamento del flusso sanguigno è direttamente o vicino alla perpendicolare alla direzione dell'onda sonora. La procedura potenziata dal flusso descritta in questo protocollo è indipendente dall'orientamento del flusso sanguigno sia all'interno che all'esterno del piano.

La procedura ecografica potenziata dal flusso consente l'imaging del flusso sanguigno in una serie di specie con globuli rossi nucleati (Figura 3A-D). Letti vascolari oculari profondi come la rete mirabile coroide in alcuni pesci possono essere ripresi se presenti nella specie (punta di freccia gialla in Figura 2, Figura 3B, Figura 4). Il metodo è limitato dall'assenza di globuli rossi nucleati nei mammiferi adulti in cui la procedura di miglioramento del flusso produce un certo grado di contrasto del flusso sanguigno ma non è così distinta come nelle specie con globuli rossi nucleati (Figura 3E, F).

Gli ultrasuoni potenziati dal flusso sono sensibili al rumore del movimento e, ad esempio, i movimenti respiratori possono causare sfocatura dell'immagine e artefatti come il miglioramento del bordo dei tessuti (Figura 4A-C, File supplementare 6). Il gating prospettico o retrospettivo può essere utilizzato per regolare il rumore di movimento (Figura 4D, E).

Figura 1: Esempi della varietà di specie adatte per l'imaging ecografico potenziato dal flusso della vascolarizzazione oculare. (A) Pesce rosso (Carassius auratus). (B) Storione siberiano (Acipenser baerii). C) Spigola europea (Dicentrarchus labrax). (D) Pagliaccio (Chitala ornata). (E) Carpa cruciana (Carassius carassius). F) Pollo domestico embrionale (Gallus gallus domesticus). Può essere utile costruire un semplice dispositivo di tenuta utilizzando un peso metallico non reattivo e elastici sciolti (A, C, D). Per la procedura (A-D, F) possono essere utilizzati sia sistemi di imaging a ultrasuoni di grandi dimensioni e immobili basati su laboratorio (E). Quando si esegue l'imaging di specie piccole e altamente sensibili alla temperatura che non possono essere trattenute in un bagno d'acqua a temperatura controllata come gli uccelli embrionali, l'imaging può essere eseguito mentre il campione si trova all'interno dell'incubatrice (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto del miglioramento del flusso sulle ecografie oculari. (A) Esempi di immagini ecografiche grezze in modalità B dell'occhio di un pesce rosso in una registrazione cinematografica di 1000 fotogrammi. Mentre il flusso sanguigno può essere osservato nella registrazione cinematografica (file supplementare 2) è difficile da vedere in fotogrammi statici. (B) Immagine in scala di grigi ottimizzata per il flusso (stessa sezione di A). Sia i letti vascolari retinici che quelli post-retinici sono migliorati. (C) Versione pseudocolorata dell'immagine in B con ImageJ Fire Look Up Table. (D) Visualizzazione volumetrica del flusso sanguigno nell'occhio dello stesso pesce rosso di A-C, basata sull'acquisizione 3D. (E) Modello anatomico dell'occhio a due segmenti (vasi retinici e post-retinici) in A-D (per il modello interattivo si veda il materiale supplementare 5). (F-I) Immagine ecografica in modalità B grezza dell'occhio di un altro pesce rosso (F) che confronta l'imaging di flusso basato su Doppler a colori (G) con i metodi potenziati dal flusso descritti in questo protocollo (H-I, nota I è una sovrapposizione di H su F). Le frecce verdi indicano i vasi retinici, le punte di freccia gialle indicano la rete mirabile della coroide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi rappresentativi di immagini ecografiche oculari potenziate dal flusso in una varietà di specie di vertebrati. (A) Bichir del Senegal (Polypterus senegalus). (B) Piranha dal ventre rosso (Pygocentrus nattereri). (C) Iguana verde (Iguana iguana). (D) Pollo domestico embrionale (giorno 18) (Gallus gallus domesticus). (E) Topo domestico (Mus musculus). (F) Ratto bruno (Rattus norvegicus). Nelle specie con globuli rossi nucleati, la procedura di miglioramento del flusso produce immagini utili del flusso sanguigno oculare (A-D), mentre nei mammiferi adulti (globuli rossi enucleati), produce solo un contrasto limitato tra il sangue che scorre e il tessuto circostante (E-F). Le frecce verdi indicano i vasi retinici; le punte di freccia blu indicano vasi post-retinici come la coriocapillare; le punte di freccia gialle indicano la rete mirabile coroide. Nel pollo domestico embrionale tardivo, si può osservare il flusso sanguigno nel pecten oculi (freccia verde inferiore in F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: I movimenti respiratori inducono un rumore di movimento che può essere alleviato dal gating retrospettivo. (A-B) Esempio di movimenti respiratori nell'occhio di una passera di mare europea (Pleuronectes platessa). Il punto rosso si trova alla stessa coordinata dell'immagine in A (fetta 54/410) e B (fetta 92/410), ma si può osservare che l'occhio ha spostato la posizione (vedi anche cine recording in materiale supplementare 6). (C) Il tentativo di eseguire l'operazione di miglioramento del flusso sulla registrazione completa a 410 fotogrammi non riesce a causa del rumore del movimento. I bordi dei tessuti sono artificialmente migliorati a causa dei movimenti. (D) funzionamento retrospettivo del gating basato sull'intensità del segnale normalizzata (SI) al punto rosso in A-B. Solo i fotogrammi con SI normalizzato > 50 (in totale 38 fotogrammi), cioè indicano che l'occhio è nella stessa posizione del punto B, sono inclusi per la procedura di miglioramento del flusso. (E) Immagine risultante della procedura di miglioramento del flusso retrospettivamente gated. Confronta con C. Nell'immagine gated, si evita il miglioramento del bordo artificiale e si può osservare il flusso sanguigno nella rete mirabile coroide .. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco delle specie su cui è stata utilizzata la tecnica ecografica potenziata dal flusso per visualizzare il flusso sanguigno oculare. L'applicabilità del metodo si basa sulla capacità di produrre una rappresentazione ricca di contrasti dei letti vascolari rispetto allo sfondo statico. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

File 1 supplementare: script macro per automatizzare i calcoli di miglioramento del flusso. Lo script è scritto in linguaggio IJ1 Macro e può essere eseguito sia utilizzando la funzione macro ImageJ (per la registrazione a fetta singola) che il processo batch ImageJ (per la registrazione 3D a più sezioni). Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Registrazione cine in modalità B grezza sull'occhio di un pesce rosso (Carassius auratus). Il flusso sanguigno può essere osservato durante la riproduzione del video, ma non su un singolo fotogramma come nella Figura 2A. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Taglia il video attraverso l'occhio di un pesce rosso (Carassius auratus) di sezioni potenziate dal flusso sanguigno. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: File TIF tridimensionale dell'occhio potenziato dal flusso del pesce rosso (Carassius auratus). Le immagini sono state associate di 3 x 3 x 3 per ridurre al minimo le dimensioni del file (riduzione di 27 volte della risoluzione spaziale e delle dimensioni del file). Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: Modello 3D interattivo di vasi pre e post-retinici nell'occhio di un pesce rosso (Carassius auratus). Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 6: Registrazione cine in modalità B grezza sull'occhio di una passera di mare europea (Pleuronectes platessa). Nota i movimenti respiratori. Fare clic qui per scaricare questo file.

L'imaging vascolare che utilizza ultrasuoni potenziati dal flusso fornisce un nuovo metodo per l'imaging non invasivo della vascolarizzazione dell'occhio che offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche attuali, ma ha i suoi limiti intrinseci. Il vantaggio principale degli ultrasuoni potenziati dal flusso è la capacità di generare angiografie oculari con una profondità di campo che supera l'epitelio pigmentato retinico, che limita la profondità di campo nelle tecniche ottiche. Nell'imaging ad ultrasuoni, la risoluzione spaziale e la profondità di campo sono determinate in ultima analisi dalla frequenza del trasduttore ad ultrasuoni, dove frequenze più elevate aumentano la risoluzione spaziale, ma a scapito di una profondità di campo inferiore, quindi la scelta della frequenza del trasduttore introduce un compromesso tra profondità dell'immagine e risoluzione spaziale. Nella nostra esperienza, l'imaging ecografico retinico ottimale si ottiene utilizzando trasduttori ad ultrasuoni ad alta frequenza (≥50 MHz) in occhi piccoli con profondità di immagine di <1 cm e trasduttori a bassa frequenza (20-40 MHz) in occhi più grandi con profondità dell'immagine di 1,5-3,0 cm. Per un'ecografia 3D, la risoluzione della dimensione aggiuntiva della fetta è impostata dalla dimensione del passo tra le scansioni nella pila di scansioni a ultrasuoni 2D. Nella nostra esperienza, è difficile condurre una scansione 3D con una dimensione del gradino inferiore a 20 μm.

Gli ultrasuoni 2D potenziati dal flusso hanno un'alta risoluzione temporale. Idealmente, sono necessari ≥ 1000 fotogrammi per immagine per l'imaging vascolare ottimizzato dal flusso, quindi sono necessari almeno 8 s per scansione dell'immagine. La risoluzione temporale è significativamente ridotta quando si eseguono ultrasuoni 3D potenziati dal flusso, in cui il tempo di scansione aumenta con il numero di immagini nella pila di scansioni 3D. Data l'elevata risoluzione temporale, il flusso di lavoro ecografico 2D potenziato dal flusso mostra un forte potenziale come metodo per identificare i cambiamenti temporali nelle velocità relative del flusso sanguigno e nella distribuzione del flusso sanguigno durante la manipolazione sperimentale. Pertanto, studi futuri possono utilizzare il flusso di lavoro per identificare in che modo le condizioni ambientali alterate (ad esempio, temperatura, pO2, pCO2) o la somministrazione farmacologica influenzano il flusso sanguigno nell'occhio e in altri organi.

Il flusso di lavoro ecografico si basa sul contrasto positivo dei globuli rossi nucleati dalla maggior parte dei vertebrati non mammiferi. Pertanto, i globuli rossi enucleati dei mammiferi adulti e di alcune specie di salamandra37 forniscono un contrasto troppo basso per migliorare efficacemente il flusso sanguigno utilizzando il flusso di lavoro attuale (Figura 3E, F). Nei flussi di lavoro ecografici tradizionali, l'iniezione vascolare di microbolle fornisce un contrasto sufficientemente elevato da identificare la vascolarizzazione nei ^mammiferi38, che è stata utilizzata per generare angiografie vascolari dei vasi retrobulbari all'interno dell'occhio del ^ratto39. Tuttavia, le microbolle scoppiano in pochi minuti, quindi la generazione di angiografie 3D richiede successive iniezioni di microbolle.

L'ecografia potenziata dal flusso dipende da registrazioni sequenziali nella stessa posizione dell'occhio, quindi la tecnica non è possibile negli animali svegli, dove piccoli movimenti casuali possono compensare l'immagine e minare i calcoli di miglioramento del flusso. Pertanto, il presente metodo deve essere eseguito in anestesia adeguata per l'immobilizzazione per migliorare la qualità dell'immagine riducendo i movimenti casuali. Tuttavia, i movimenti regolari dell'occhio che si verificano durante i movimenti respiratori regolari possono essere compensati da un gating prospettico o retrospettivo al modello di ventilazione dell'animale, quindi nell'analisi dei dati viene utilizzata solo la registrazione della scansione dallo stesso intervallo di tempo all'interno del ciclo di ventilazione. Mentre l'approccio retrospettivo di gating per compensare i movimenti ventilatori dell'immagine migliora significativamente la stabilità dell'immagine, riduce notevolmente il numero di fotogrammi inclusi nel calcolo della deviazione standard dell'intensità del segnale portando a una diminuzione del rapporto segnale-rumore (confronta la Figura 4E con la Figura 2C e la Figura 2I ). Questo effetto viene alleviato utilizzando il gating prospettico allo scanner ad ultrasuoni, in cui i dati dell'immagine vengono acquisiti solo quando l'animale si trova nella fase desiderata della respirazione. Tuttavia, ciò causa un marcato aumento del tempo di acquisizione se è necessario acquisire il numero desiderato di fotogrammi ≥ 1000.

Vediamo molteplici applicazioni nella ricerca zoologica e veterinaria per il flusso di lavoro ecografico potenziato dal flusso per mappare la fisiologia e l'anatomia della vascolarizzazione dell'occhio. La vascolarizzazione di pesci, mammiferi e uccelli con pinne raggiate è relativamente ben descritta1,3,4,8,9,12,15,40, ma questo non è il caso dei pesci non ossei (vertebrati e condritti senza mascelle), anfibi e rettili, che rappresentano i loro rispettivi gruppi fratelli divergenti precedenti. L'implementazione di ultrasuoni potenziati dal flusso su questi gruppi animali poco compresi e l'integrazione di questi dati con le conoscenze sui gruppi più ben studiati forniranno una visione fondamentale dell'evoluzione della vascolarizzazione dell'occhio dei vertebrati. Poiché la vascolarizzazione dell'occhio è simile nelle specie strettamente ^correlate4, tali informazioni dettagliate sulla vascolarizzazione oculare in una vasta gamma di specie forniranno un punto di riferimento per i veterinari per identificare malformazioni nella vascolarizzazione dell'occhio a causa di difetti dello sviluppo, malattie o lesioni fisiche. Inoltre, la capacità di acquisire informazioni sul flusso sanguigno 2D con un'elevata risoluzione spaziotemporale fornisce i mezzi per quantificare gli effetti farmacocinetici sulla distribuzione del flusso sanguigno nei letti vascolari profondi, con vaste applicazioni nello sviluppo e nei test di farmaci. Studi futuri su questa tecnica dovrebbero concentrarsi sull'identificazione di composti iniettabili che migliorano il contrasto del sangue in specie con globuli rossi enucleati, che espanderanno l'applicabilità di questa tecnica ai mammiferi con vaste applicazioni nella ricerca biomedica e nella diagnostica clinica della disfunzione vascolare nell'occhio e in altri letti vascolari profondi.

Gli autori dichiarano che non esistono interessi di completamento.

Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dalla Fondazione Carlsberg (CF17-0778; CF18-0658), Fondazione Lundbeck (R324-2019-1470; R346-2020-1210), le Fondazioni Velux (00022458), la Fondazione A.P. Møller per l'avanzamento della scienza medica, il programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie (n. 754513) e la Fondazione di ricerca universitaria di Aarhus.