Presentamos una técnica ecográfica no invasiva para generar angiografías tridimensionales en el ojo sin el uso de agentes de contraste.

La retina dentro del ojo es uno de los tejidos más exigentes de energía en el cuerpo y, por lo tanto, requiere altas tasas de suministro de oxígeno de un rico suministro de sangre. La lámina capilar de la coroides recubre la superficie externa de la retina y es la fuente dominante de oxígeno en la mayoría de las retinas de los vertebrados. Sin embargo, este lecho vascular es difícil de visualizar con técnicas ópticas tradicionales debido a su posición detrás de la retina altamente absorbente de luz. Aquí describimos una técnica de ultrasonido de alta frecuencia con posterior mejora del flujo para obtener imágenes de lechos vasculares profundos (0,5-3 cm) del ojo con una alta resolución espaciotemporal. Este método no invasivo funciona bien en especies con glóbulos rojos nucleados (modelos animales no mamíferos y fetales). Permite la generación de angiografías tridimensionales no invasivas sin el uso de agentes de contraste, y es independiente de los ángulos de flujo sanguíneo con una sensibilidad más alta que las técnicas de imágenes de ultrasonido basadas en Doppler.

El alto metabolismo en la retina de los vertebrados impone una compensación intrínseca entre dos necesidades contrastantes; altas tasas de flujo sanguíneo y un camino ligero desprovisto de vasos sanguíneos. Para evitar la alteración visual de la perfusión de los glóbulos rojos, la retina de todos los vertebrados recibe oxígeno y nutrientes a través de una lámina de capilares detrás de los fotorreceptores, los coriocapilaris1,2,3. Sin embargo, esta única fuente de nutrientes y oxígeno impone una limitación de difusión al grosor de la ^retina4,5, por lo que muchas especies visualmente activas poseen una variedad de elaboradas redes vasculares para proporcionar un suministro de sangre adicional a este órgano metabólicamente ^activo6. Estos lechos vasculares incluyen vasos sanguíneos que perfunden las capas internas de la retina en mamíferos y algunos peces4,7,8,9,10, vasos sanguíneos en el lado interno (orientado a la luz) de la retina que se encuentran en muchos peces, reptiles y aves4,11,12,13, y arreglos vasculares contracorrientes de la coroides de pescado, la coroides. mirabile, que permite la generación de presiones parciales de oxígeno sobrefosférico14,15,16,17,18,19,20. A pesar de que estas vías no coroideas adicionales para el suministro de nutrientes de la retina juegan un papel esencial en el fomento de los requisitos metabólicos de la visión ^superior4, la anatomía tridimensional de estas estructuras vasculares es poco conocida, lo que limita nuestra comprensión de la evolución morfológica del ojo vertebrado.

Tradicionalmente, el suministro de sangre retiniana se ha estudiado utilizando técnicas ópticas, como la oftalmoscopia del fondo de ojo. Esta categoría de técnicas proporciona información no destructiva de alto rendimiento sobre la anatomía no coroidea de los vasos sanguíneos en alta ^{resolución21} y, por lo tanto, se utiliza fácilmente en el diagnóstico clínico de anomalías en la estructura de los vasos retinianos22. Sin embargo, el epitelio pigmentario de la retina absorbe la luz transmitida y limita la profundidad de visión en estas técnicas ópticas, proporcionando información reducida sobre la estructura y función coroidea sin el uso de agente de ^contraste21. Se experimentan limitaciones de profundidad similares en la tomografía de coherencia óptica (OCT). Esta técnica puede generar angiografías de fondo de ojo de alta resolución utilizando ondas de luz a expensas técnicas de la penetración de ^{profundidad23}, mientras que la OCT de imagen de profundidad mejorada puede visualizar la coroides a expensas de la calidad de la imagen de la ^retina24. La resonancia magnética supera las limitaciones ópticas de la oftalmoscopia y la OCT y puede mapear las capas vasculares de la retina, aunque a baja ^{resolución25}. La histología y la tomografía microinformática (μCT) mantienen la alta resolución de las técnicas ópticas y proporcionan información sobre la morfología vascular de todo el ^ojo4, pero ambas técnicas requieren muestreo ocular y, por lo tanto, no son posibles en la clínica o en especies raras o en peligro de extinción. Para superar algunas de las limitaciones de estas técnicas de imagen retiniana establecidas, el estudio presenta aquí un protocolo de ultrasonido en animales anestesiados, donde el movimiento de la sangre se mapea in silico en una serie de ecografías bidimensionales igualmente espaciadas que abarcan todo un ojo mediante la aplicación de una técnica comparable a la descrita anteriormente para la imagen embrionaria y ^{cardiovascular26,27, 28} y en angiografía ^OCT29. Este enfoque permite la generación de angiografías oculares profundas tridimensionales no invasivas sin usar un agente de contraste y abre nuevas vías para mapear la distribución del flujo sanguíneo dentro del ojo a través de las especies.

El siguiente protocolo se realizó con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentación Animal dentro del Ministerio Danés de Alimentación, Agricultura y Pesca, Administración Danesa de Veterinaria y Alimentos (número de permiso 2016-15-0201-00835).

1. Anestesia y medio de ultrasonido

1. Anestesiar al animal de investigación.
   NOTA: El tipo y la dosis de anestesia apropiada son altamente dependientes de la especie. En general, los anestésicos a base de inmersión como MS-222 (ácido metanosulfónico de etilo 3-aminobenzoato), benzocaína (4-aminobenzoato de etilo) y propofol (2,6-diisopropil fenol) son útiles en peces y anfibios que absorben fácilmente el anestésico sobre las branquias o la piel (por ejemplo, 0,05 mg · Benzocaína ^L-1 en trucha arco iris). Una gama de compuestos disueltos que se pueden administrar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal está disponible para los amniotas, al igual que los anestésicos a base de gas. Alfaxalon administrado por vía intramuscular es útil en reptiles (por ejemplo, 30 mg·^kg-1 en lagartos), e isoflurano administrado como gas es útil en aves (por ejemplo, 2% en aire para palomas). Consulte la literatura publicada30,31,32 para obtener una visión general completa de los anestésicos disponibles en todas las especies.
2. Pruebe los reflejos en el animal para confirmar un nivel óptimo de anestesia. Asegúrese de que el animal esté completamente inmóvil durante el procedimiento, ya que el procedimiento de ultrasonido con flujo mejorado es sensible al ruido de movimiento.
   1. La anestesia demasiado profunda puede alterar los patrones de flujo sanguíneo, así que realice una titulación de la dosis en la fase inicial de un experimento.
   2. Aumente la dosis de anestesia en pasos y observe el flujo sanguíneo en el ojo con la ayuda de ultrasonido en modo de brillo simple (modo B).
      NOTA: Se obtiene un nivel óptimo de anestesia cuando el animal está inmóvil (excepto la respiración) con flujo sanguíneo ocular visible.
3. Si el tipo/dosis de anestésico no es permisivo para los movimientos respiratorios, asegúrese de una ventilación adecuada del animal, por ejemplo, utilizando una bomba de aire para oxigenar el agua para las especies acuáticas o un ventilador para las especies que respiran aire.
4. Coloque al animal en una postura que permita el acceso directo desde arriba al ojo.
   NOTA: Dependiendo de la especie, esto puede ser en posición supina o lateral. Puede ser útil construir un dispositivo de sujeción simple utilizando una pequeña pieza de metal no reactivo (por ejemplo, acero inoxidable) y bandas elásticas sueltas (ver Figura 1).
5. Coloque el medio de ultrasonido apropiado en el ojo del animal. Si los párpados escamosos (impermeables al ultrasonido) cubren el ojo, desplace estos suavemente con un hisopo de algodón.
   NOTA: Para las especies acuáticas, el mejor medio de ultrasonido es el agua limpia del tanque en el que generalmente vive el animal. Para las especies terrestres, una cantidad generosa de gel de ultrasonido garantiza movimientos libres e imágenes del transductor de ultrasonido (es decir, sonda de matriz lineal) en toda la superficie del ojo. Se requiere ungüento veterinario en el ojo contralateral para las especies terrestres.

2. Adquisición de imágenes de ultrasonido ocular 2D y 3D

1. Coloque el transductor de ultrasonido medial al ojo en una orientación dorsal / ventral o rostral / caudal dependiendo de la orientación de la imagen deseada.
2. En el modo B, con una profundidad de campo máxima, tome una imagen de la parte medial y más profunda del ojo y asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen.
   NOTA: En algunas especies, el cristalino ocupa una proporción comparativamente grande del humor vítreo, que puede absorber el ultrasonido, especialmente a frecuencias más altas.
3. Traduzca lentamente el transductor a cada lado mientras inspecciona las imágenes en tiempo real. Asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen; de lo contrario, cambie a un transductor con una frecuencia más baja y una mayor profundidad de campo.
   NOTA: Las siguientes frecuencias centrales permiten la siguiente profundidad máxima de campo: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (véase la Tabla 1). Sin embargo, estos valores máximos de profundidad de campo pueden ser marcadamente más bajos si el ojo contiene estructuras calcificadas u otras estructuras impermeables al ultrasonido.
4. Ajuste la profundidad de la imagen, el desplazamiento de profundidad (distancia desde la parte superior de la imagen hasta la estructura de interés), el ancho de la imagen, así como el número y la posición de las zonas focales para cubrir la región de interés deseada en las tres dimensiones espaciales (por ejemplo, profundidad de imagen de 1 cm, desplazamiento de profundidad de 2 mm, ancho de imagen de 1 cm, una zona focal).
   NOTA: Aunque la nomenclatura específica de los botones que ajustan estos parámetros puede variar entre los sistemas de ultrasonido, la mayoría de los sistemas tendrán botones con nombres lógicos para estos ajustes. Estos ajustes de parámetros de imagen generalmente afectan el rango de posibles resoluciones temporales de la adquisición de ultrasonido.
5. Establezca la velocidad de fotogramas en el rango de 50-120 fotogramas·^s-1.
   NOTA: La resolución temporal (es decir, el intervalo de tiempo entre las sucesivas exploraciones B) debe ser adecuada para mostrar una gran variabilidad de la intensidad de píxeles en los vasos sanguíneos fotografiados, es decir, la resolución temporal no debe ser demasiado alta. Por otro lado, para completar una grabación 3D completa del ojo en un tiempo razonable, la resolución temporal no puede ser demasiado baja. Una resolución temporal que oscila entre 50-120 fotogramas·^s-1 suele ser adecuada para el procedimiento de flujo mejorado en la mayoría de las especies. En algunos sistemas de ultrasonido, esta resolución temporal deseada se puede obtener cambiando entre los modos de "imagen general" (alta resolución espacial / baja resolución temporal) y "cardiología" (baja resolución espacial / alta resolución temporal).
6. Ajuste la ganancia 2D a un nivel (~ 5 dB), de modo que las estructuras anatómicas solo sean visibles en la adquisición del modo B para aumentar la relación señal-ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo.
7. Para adquirir una imagen mejorada con flujo 2D en una sola posición de corte, traduzca el transductor a esta posición y continúe en el paso 3.1.
8. Para adquirir una grabación 3D de toda una región de interés, por ejemplo, la retina, traduzca el transductor a un extremo de la región de interés.
   1. Para determinar la posición exacta del extremo de la región de interés, aumente brevemente la ganancia 2D.
   2. Una vez completada la colocación correcta del transductor, reduzca la ganancia 2D antes de grabar para garantizar la máxima relación señal-ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo.
9. Para cada paso (slice) en la grabación 3D, adquiera ≥100 fotogramas (óptimamente ≥1000 fotogramas).
10. Usando un micromanipulador o un motor de transductor incorporado, traduzca el transductor a través de toda la región de interés en pasos de, por ejemplo, 25 μm o 50 μm (recuerde anotar el tamaño del paso) y repita la adquisición de ≥100 cuadros para cada paso.
11. Sacrificar al animal de investigación de acuerdo con las pautas de cuidado animal de la institución.

3. Reconstrucción de imagen mejorada por flujo

1. Exporte las grabaciones al formato de archivo de imágenes digitales y comunicaciones en medicina (DICOM) (little-endian).
2. Para producir una sola imagen mejorada de flujo basada en una grabación de cine de ≥100 fotogramas (T), calcule la desviación estándar en el nivel de píxeles (STD(x,y)) utilizando la fórmula:
   
   Donde _It(x,y) es la intensidad del píxel en la coordenada del píxel (x,y) en el tiempo t, e _Īt(x,y) es el valor medio aritmético de I a lo largo del tiempo.
3. Repita el paso 3.2 para cada segmento de la grabación 3D.
4. Para automatizar el proceso de cálculo de ETS y reconstrucción de imágenes para múltiples segmentos en una grabación 3D, realice esta operación en modo por lotes utilizando, por ejemplo, ImageJ y el script de macro suplementario (Archivo suplementario 1).
5. Combine todos los sectores reconstruidos en una pila de imágenes (comando Images to Stack en ImageJ).
6. Especifique el grosor del segmento a partir del tamaño de paso utilizado durante la adquisición (comando Properties en ImageJ).
7. Guarde la pila de imágenes como un archivo TIF 3D.
   NOTA: Los registros tridimensionales ponderados por flujo de los vasos sanguíneos oculares se pueden utilizar posteriormente para crear representaciones de volumen y construir modelos anatómicos digitales y físicos de las estructuras vasculares del ojo. Estas opciones de procesamiento de imágenes están fuera del alcance de este protocolo; consulte los artículos publicados anteriormente para obtener más detalles33,34,35.

La técnica de ultrasonido de flujo mejorado para obtener imágenes de los lechos vasculares del ojo se puede aplicar en una variedad de especies y actualmente se ha utilizado en 46 especies diferentes de vertebrados (Figura 1, Tabla 1). La presencia de glóbulos rojos nucleados en vertebrados de mamíferos no adultos proporciona un contraste positivo de la sangre que fluye en comparación con el tejido estático en las grabaciones de cine (Archivo complementario 2). Sin embargo, cuando se analiza fotograma a fotograma, la clara distinción entre la sangre y el tejido circundante es menos obvia (Figura 2A). El procedimiento de mejora del flujo sanguíneo descrito en este protocolo esencialmente compila un registro de múltiples puntos de tiempo en el espacio 2D (una rebanada hecha de fotogramas T ) en una sola imagen en la que las fluctuaciones inherentes del valor de la señal en píxeles posicionados en la sangre que fluye puntúan una desviación estándar más alta que el tejido estático circundante, produciendo así un contraste positivo (Figura 2B). Para mejorar perceptiblemente el contraste de los vasos sanguíneos, las tablas de búsqueda se pueden utilizar para producir imágenes pseudocolores (Figura 2C). En las adquisiciones 3D, se pueden combinar múltiples segmentos paralelos con espaciado conocido en datos de imágenes 3D (Archivo suplementario 3 y Archivo suplementario 4) que se pueden usar para la representación de volúmenes tridimensionales (Figura 2D) y el modelado anatómico (Figura 2E y Archivo suplementario 5). Las imágenes de ultrasonido basadas en Doppler también brindan la opción de obtener imágenes específicas del flujo sanguíneo, sin embargo, con menos sensibilidad que el método descrito (compare la Figura 2G con la Figura 2H y la Figura 2I), y lo que es más importante, no si la orientación del flujo sanguíneo es directa o cercana a la perpendicular a la dirección de la onda de sonido. El procedimiento de mejora del flujo descrito en este protocolo es independiente de la orientación del flujo sanguíneo tanto dentro como fuera del plano.

El procedimiento de ultrasonido de flujo mejorado permite imágenes de flujo sanguíneo en una variedad de especies con glóbulos rojos nucleados (Figura 3A-D). Los lechos vasculares oculares profundos, como la coroides rete mirabile en algunos peces, se pueden obtener imágenes si están presentes en la especie (punta de flecha amarilla en la Figura 2, Figura 3B, Figura 4). El método está limitado por la ausencia de glóbulos rojos nucleados en mamíferos adultos en los que el procedimiento de mejora del flujo produce cierto grado de contraste del flujo sanguíneo, pero no es tan distinto como en las especies con glóbulos rojos nucleados (Figura 3E, F).

El ultrasonido mejorado por flujo es sensible al ruido de movimiento y, por ejemplo, los movimientos respiratorios pueden causar desenfoque de la imagen y artefactos como la mejora del borde del tejido (Figura 4A-C, Archivo suplementario 6). Se puede utilizar la apertura prospectiva o retrospectiva para ajustar el ruido de movimiento (Figura 4D, E).

Figura 1: Ejemplos de la variedad de especies adecuadas para la ecografía de flujo mejorado de la vasculatura ocular. (A) Peces de colores (Carassius auratus). (B) Esturión siberiano (Acipenser baerii). C) Lubina europea (Dicentrarchus labrax). (D) Payaso plumero (Chitala ornata). (E) Carpa cruciana (Carassius carassius). F) Pollo doméstico embrionario (Gallus gallus domesticus). Puede ser útil construir un dispositivo de sujeción simple utilizando un peso metálico no reactivo y bandas elásticas sueltas (A, C, D). Se pueden usar tanto sistemas de imágenes de ultrasonido grandes e inmóviles basados en laboratorio para el procedimiento (A-D, F), así como sistemas operativos de campo pequeño (E). Cuando se toman imágenes de especies pequeñas y altamente sensibles a la temperatura que no se pueden retener en un baño de agua con temperatura controlada como las aves embrionarias, se pueden realizar imágenes mientras la muestra está dentro de la incubadora (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efecto de la mejora del flujo en las ecografías oculares. (A) Ejemplos de imágenes ultrasonográficas en modo B sin procesar del ojo de un pez dorado en una grabación de cine de 1000 fotogramas. Mientras que el flujo sanguíneo se puede observar en la grabación de cine (Archivo Complementario 2) es difícil de ver en fotogramas estáticos. (B) Imagen en escala de grises mejorada por flujo (misma división que en A). Se potencian tanto los lechos vasculares retinianos como los post-retinianos. (C) Versión pseudocoloreada de la imagen en B con ImageJ Fire Look Up Table. (D) Visualización del flujo sanguíneo en el ojo del mismo pez dorado que en A-C, basada en la adquisición 3D. (E) Modelo anatómico de ojo de dos segmentos (vasos retinianos y post-retinianos) en A-D (para el modelo interactivo ver material complementario 5). (F-I) Imagen ultrasonográfica en modo B sin procesar del ojo de otro pez dorado (F) que compara la imagen de flujo basada en Doppler en color (G) con los métodos de flujo mejorado descritos en este protocolo (H-I, nota I es una superposición de H sobre F). Las flechas verdes indican vasos retinianos, las puntas de flecha amarillas indican la relación coroidea mirabile. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplos representativos de imágenes de ultrasonido ocular con flujo mejorado en una variedad de especies de vertebrados. A) Bichir senegalés (Polypterus senegalus). (B) Piraña de vientre rojo (Pygocentrus nattereri). (C) Iguana verde (Iguana iguana). (D) Pollo doméstico embrionario (día 18) (Gallus gallus domesticus). (E) Ratón doméstico (Mus musculus). (F) Rata parda (Rattus norvegicus). En especies con glóbulos rojos nucleados, el procedimiento de mejora del flujo produce imágenes útiles del flujo sanguíneo ocular (A-D), mientras que en mamíferos adultos (glóbulos rojos enucleados), produce solo un contraste limitado entre la sangre que fluye y el tejido circundante (E-F). Las flechas verdes indican vasos retinianos; las puntas de flecha azules indican vasos post-retinales como los coriocapillaris; las puntas de flecha amarillas indican coroide rete mirabile. En el pollo doméstico embrionario tardío, se puede observar el flujo sanguíneo en los pecten oculi (flecha verde inferior en F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los movimientos respiratorios inducen ruido de movimiento que puede aliviarse mediante una apertura retrospectiva. (A-B) Ejemplo de movimientos respiratorios en el ojo de una solla europea (Pleuronectes platessa). El punto rojo está en la misma coordenada de imagen en A (corte 54/410) y B (corte 92/410), pero se puede observar que el ojo ha cambiado de posición (ver también grabación de cine en material complementario 6). (C) El intento de realizar la operación de mejora de flujo en la grabación completa de 410 cuadros falla debido al ruido de movimiento. Los bordes de los tejidos se mejoran artificialmente debido a los movimientos. (D) operación de cierre retrospectiva basada en la intensidad de señal normalizada (SI) en el punto rojo en A-B. Solo se incluyen marcos con SI normalizado > 50 (en total 38 cuadros), es decir, que indican que el ojo está en la misma posición que en B, para el procedimiento de mejora del flujo. (E) Imagen resultante del procedimiento de mejora de flujo cerrado retrospectivamente. Comparar con C. En la imagen cerrada, se evita la mejora artificial del borde y se puede observar el flujo sanguíneo en la coroides rete mirabile (punta de flecha amarilla). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de especies en las que se ha utilizado la técnica de ultrasonido de flujo mejorado para obtener imágenes del flujo sanguíneo ocular. La aplicabilidad del método se basa en la capacidad de producir una representación rica en contraste de los lechos vasculares en comparación con el fondo estático. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo suplementario 1: Script de macro para automatizar los cálculos de mejora de flujo. El script está escrito en el lenguaje de macros IJ1 y se puede ejecutar utilizando la función de macro ImageJ (para la grabación de un solo segmento) o el proceso por lotes imageJ (para la grabación 3D de varios segmentos). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Grabación de cine en modo B en bruto en el ojo de un pez dorado (Carassius auratus). El flujo sanguíneo se puede observar a medida que se reproduce el video, pero no en un solo fotograma como en la Figura 2A. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Corte el video a través del ojo de un pez dorado (Carassius auratus) de secciones mejoradas para el flujo sanguíneo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Archivo TIF tridimensional del ojo mejorado por flujo de peces de colores (Carassius auratus). Las imágenes se han agrupado en 3 x 3 x 3 para minimizar el tamaño del archivo (reducción de 27 veces en la resolución espacial y el tamaño del archivo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Modelo 3D interactivo de vasos pre y post-retinales en el ojo de un pez de colores (Carassius auratus). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 6: Grabación de cine en modo B en bruto en el ojo de una solla europea (Pleuronectes platessa). Tenga en cuenta los movimientos respiratorios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Las imágenes vasculares que utilizan ultrasonido de flujo mejorado proporcionan un nuevo método para la obtención de imágenes no invasivas de la vasculatura del ojo que ofrece varias ventajas sobre las técnicas actuales, pero tiene sus limitaciones intrínsecas. La principal ventaja del ultrasonido con flujo mejorado es la capacidad de generar angiografías oculares con una profundidad de campo que excede el epitelio pigmentario de la retina, lo que limita la profundidad de campo en las técnicas ópticas. En las imágenes de ultrasonido, la resolución espacial y la profundidad de campo están determinadas en última instancia por la frecuencia del transductor de ultrasonido, donde las frecuencias más altas aumentan la resolución espacial, pero a expensas de una profundidad de campo menos profunda, por lo que la elección de la frecuencia del transductor introduce una compensación entre la profundidad de la imagen y la resolución espacial. En nuestra experiencia, la ecografía retiniana óptima se logra utilizando transductores de ultrasonido de alta frecuencia (≥50 MHz) en ojos pequeños con profundidades de imagen de <1 cm y transductores de menor frecuencia (20-40 MHz) en ojos más grandes con profundidades de imagen de 1.5-3.0 cm. Para una ecografía 3D, la resolución de la dimensión de corte adicional se establece por el tamaño de paso entre las exploraciones en la pila de ecografías 2D. En nuestra experiencia, es difícil realizar un escaneo 3D con un tamaño de paso inferior a 20 μm.

El ultrasonido 2D mejorado por flujo tiene una alta resolución temporal. Idealmente, se requieren ≥1000 fotogramas por imagen para obtener imágenes vasculares mejoradas por flujo, por lo que se requieren al menos 8 s por escaneo de imagen. La resolución temporal se reduce significativamente cuando se realizan ultrasonidos con flujo mejorado en 3D, donde el tiempo de escaneo aumenta con el número de imágenes en la pila de escaneos 3D. Dada la alta resolución temporal, el flujo de trabajo de ultrasonido 2D mejorado por el flujo muestra un gran potencial como método para identificar cambios temporales en las velocidades relativas del flujo sanguíneo y la distribución del flujo sanguíneo durante la manipulación experimental. Por lo tanto, los estudios futuros pueden utilizar el flujo de trabajo para identificar cómo las condiciones ambientales alteradas (por ejemplo, temperatura, pO2, pCO2) o la administración farmacológica afectan el flujo sanguíneo en el ojo y otros órganos.

El flujo de trabajo de ultrasonido se basa en el contraste positivo de los glóbulos rojos nucleados de la mayoría de los vertebrados no mamíferos. Por lo tanto, los glóbulos rojos enucleados de mamíferos adultos y algunas especies de salamandras37 proporcionan muy poco contraste para mejorar efectivamente el flujo sanguíneo utilizando el flujo de trabajo actual (Figura 3E, F). En los flujos de trabajo de ultrasonido tradicionales, la inyección vascular de microburbujas proporciona un contraste lo suficientemente alto como para identificar la vasculatura en ^mamíferos38, que se ha utilizado para generar angiografías vasculares de los vasos retrobulbares dentro del ojo de ^rata39. Sin embargo, las microburbujas estallan en cuestión de minutos, por lo que la generación de angiografías 3D requiere sucesivas inyecciones de microburbujas.

El ultrasonido con flujo mejorado depende de grabaciones secuenciales en la misma posición del ojo, por lo que la técnica no es posible en animales despiertos, donde los movimientos aleatorios menores pueden compensar la imagen y socavar los cálculos de mejora del flujo. Por lo tanto, el presente método debe realizarse bajo anestesia adecuada para la inmovilización para mejorar la calidad de la imagen al reducir los movimientos aleatorios. Sin embargo, los movimientos regulares del ojo que ocurren durante los movimientos respiratorios regulares pueden compensarse mediante la adaptación prospectiva o retrospectiva al patrón de ventilación del animal, por lo que solo se utiliza el registro de escaneo del mismo intervalo de tiempo dentro del ciclo de ventilación en el análisis de datos. Si bien el enfoque de cierre retrospectivo para compensar los movimientos ventilatorios de la imagen mejora significativamente la estabilidad de la imagen, reduce drásticamente el número de fotogramas incluidos en el cálculo de la desviación estándar de la intensidad de la señal, lo que lleva a una disminución en la relación señal-ruido (compare la Figura 4E con la Figura 2C y la Figura 2I ). Este efecto se alivia mediante la apertura prospectiva en el ecógrafo, en el que los datos de la imagen solo se adquieren cuando el animal se encuentra en la fase deseada de respiración. Sin embargo, esto provoca un marcado aumento en el tiempo de adquisición si se debe adquirir el número deseado de fotogramas ≥1000.

Vemos múltiples aplicaciones en la investigación zoológica y veterinaria para el flujo de trabajo de ultrasonido mejorado para mapear la fisiología y la anatomía de la vasculatura del ojo. La vasculatura de peces, mamíferos y aves con aletas radiadas está relativamente bien descrita1,3,4,8,9,12,15,40, pero este no es el caso de los peces no óseos (vertebrados sin mandíbula y condrictios), anfibios y reptiles, que representan sus respectivos grupos hermanos divergentes anteriores. La implementación de ultrasonidos con flujo mejorado en estos grupos de animales poco conocidos e integración de estos datos con el conocimiento de los grupos más estudiados proporcionará una visión fundamental de la evolución de la vasculatura del ojo de los vertebrados. Debido a que la vasculatura del ojo es similar en especies estrechamente ^{relacionadas4}, esta información detallada sobre la vasculatura ocular en una amplia gama de especies proporcionará un punto de referencia para que los veterinarios identifiquen malformaciones en la vasculatura del ojo debido a defectos de desarrollo, enfermedades o lesiones físicas. Además, la capacidad de adquirir información de flujo sanguíneo 2D con una alta resolución espaciotemporal proporciona los medios para cuantificar los efectos farmacocinéticos en la distribución del flujo sanguíneo en lechos vasculares profundos, con vastas aplicaciones en el desarrollo y prueba de fármacos. Los estudios futuros sobre esta técnica deben centrarse en identificar compuestos inyectables que mejoren el contraste de la sangre en especies con glóbulos rojos enucleados, lo que ampliará la aplicabilidad de esta técnica a mamíferos con vastas aplicaciones en investigación biomédica y diagnóstico clínico de disfunción vascular en el ojo y otros lechos vasculares profundos.

Los autores declaran que no existen intereses completos.

Este trabajo ha recibido financiación de la Fundación Carlsberg (CF17-0778; CF18-0658), la Fundación Lundbeck (R324-2019-1470; R346-2020-1210), las Fundaciones Velux (00022458), la Fundación A.P. Møller para el Avance de la Ciencia Médica, el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie (No. 754513) y la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus.